范蓮雪+郝寧+張?zhí)焘?陳煥軒+秦智偉+武濤

摘要：為理解和闡述黃瓜耐低氮的生理與分子機(jī)制，以前期試驗(yàn)篩選出的耐低氮性強(qiáng)的黃瓜品種D0328和耐低氮性弱的黃瓜品種D0422為材料，于2014年4—7月對(duì)二者在低氮脅迫（3 mmol/L NO-3）和正常氮（14 mmol/L NO-3）下生理和分子指標(biāo)的變化規(guī)律及差異進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在低氮脅迫下，耐低氮性不同的2個(gè)黃瓜品種D0328和D0422在整個(gè)生長發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期（苗期、抽蔓期、盛果期），氮素吸收相關(guān)生理指標(biāo)，如地上和地下部分硝態(tài)氮含量，地上和地下部分總氮含量沒有顯著差異；氮素同化相關(guān)生理指標(biāo)，如硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）活性也沒有顯著差異；同時(shí)，與氮素吸收和同化相關(guān)基因響應(yīng)模式一致。然而，在低氮脅迫下的盛果期，D0328的可溶性蛋白質(zhì)含量顯著低于D0422，暗示其可能具有較高的氮素再循環(huán)效率；同位素示蹤結(jié)果進(jìn)一步證明，D0328具有比D0422高的氮素再循環(huán)效率。根據(jù)上述規(guī)律證明，氮素再循環(huán)效率是影響黃瓜耐低氮能力的關(guān)鍵因子之一。

關(guān)鍵詞：黃瓜；耐低氮；氮素再循環(huán)；低氮脅迫；生理變化；分子機(jī)制

中圖分類號(hào)： S642.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0117-05

氮素作為一種大量礦物質(zhì)元素，是核苷酸和蛋白質(zhì)的主要成分。它不僅是植物細(xì)胞中許多重要結(jié)構(gòu)遺傳和代謝等復(fù)合物的重要組成部分，也是葉綠素和能量轉(zhuǎn)換復(fù)合物（如ATP等）的主要組成成分，因此被絕大多數(shù)植物在整個(gè)生長發(fā)育階段所需要[1-4]。在大多數(shù)的農(nóng)業(yè)種植體系中，氮肥的供應(yīng)通常影響作物產(chǎn)量，包括黃瓜（Cucumis sativus L.）等園藝作物。農(nóng)民盲目施用過量氮肥也會(huì)造成環(huán)境惡化、生產(chǎn)成本增加、黃瓜硝酸鹽含量超標(biāo)等現(xiàn)象[5-7]。為解決這一系列問題，深入研究黃瓜耐低氮的機(jī)制是必要且漫長的過程。

隨著黃瓜耐低氮機(jī)制研究的陸續(xù)開展，現(xiàn)已取得了一些成果。徐志遠(yuǎn)將黃瓜的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量、株高、真葉面積、根體積、根干質(zhì)量、葉綠素含量6個(gè)指標(biāo)確定為鑒定黃瓜耐瘠薄指標(biāo)[8]。于明磊等以葉綠素b含量為黃瓜耐低氮性最佳的評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出耐低氮性最強(qiáng)品種D0328和耐低氮性最弱品種D0422，并進(jìn)行了相關(guān)特性的分子標(biāo)記[9]。徐靜靜等從生理角度發(fā)現(xiàn)耐低氮能力強(qiáng)和耐低氮能力弱的黃瓜葉片總氮含量、硝酸還原酶活性、葉綠素含量、葉片干質(zhì)量、葉面積等指標(biāo)在生育期內(nèi)響應(yīng)低氮脅迫的模式均沒有顯著差異，之后也對(duì)根系相關(guān)指標(biāo)的變化進(jìn)行了分析[10-11]。馮卓對(duì)耐低氮能力弱的黃瓜品種在低氮脅迫下幼苗葉片在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)水平進(jìn)行了差異比較[12]。何紅梅等對(duì)低氮脅迫下黃瓜鈣依賴蛋白激酶基因CsCDPK進(jìn)行了克隆、表達(dá)分析及遺傳轉(zhuǎn)化[13]。馮卓等對(duì)谷氨酰胺合酶基因[WTBX][STBX]GS1[WTBZ][STBZ]和黃瓜硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[WTBX][STBX]CsNRT1.5[WTBZ][STBZ]等進(jìn)行了克隆與表達(dá)分析[14-15]。然而，從不同發(fā)育時(shí)期結(jié)合氮素吸收、同化和再循環(huán)相關(guān)生理及分子指標(biāo)了解影響黃瓜耐低氮能力重要因子的報(bào)道尚未出現(xiàn)。

植物的氮素代謝過程主要包括氮素吸收、同化、再循環(huán)3個(gè)階段。植物吸收系統(tǒng)對(duì)硝酸鹽吸收具有不同的親和性：高親和系統(tǒng)和低親和系統(tǒng)。每個(gè)高親和性與低親和性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)都由組成型和硝酸鹽誘導(dǎo)型組成[16]。根部吸收獲得的硝酸鹽一小部分直接在根部被同化吸收，很大一部分被運(yùn)輸?shù)角o部，首先在硝酸還原酶（NR）的作用下在細(xì)胞質(zhì)中被還原成亞硝酸鹽，然后在質(zhì)體中被亞硝酸還原酶還原成銨鹽，再在谷氨酰胺合成酶（GS）的作用下催化氨的同化，使其轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺（Gln）和谷氨酸（Glu）[17]。在植物的營養(yǎng)生長階段，葉片是氮的存儲(chǔ)器，在后期衰老過程中，這些氮多數(shù)以氨基酸的形式被再循環(huán)利用，而葉綠體是一個(gè)重要的氮再動(dòng)員庫，因?yàn)樗舜蠹s80%的葉片總氮并以蛋白質(zhì)的形式存在其中[18-19]。植物中氮素含量、硝態(tài)氮含量以及可溶性蛋白質(zhì)含量直接反映作物體內(nèi)氮素積累與代謝情況，是研究作物氮素營養(yǎng)、氮素同化利用與再利用狀況的重要指標(biāo)[20]。NR和GS活性決定氮素的代謝速度，也能反映植物體內(nèi)氮素狀況[21]。另一方面，低氮在遺傳學(xué)角度的相關(guān)研究也已經(jīng)被報(bào)道，如水稻等耐低氮能力的QTL定位分析等[22]。盡管這些指標(biāo)在許多作物中已被研究報(bào)道，并且存在較大差異，但在黃瓜上進(jìn)行全面研究的報(bào)道比較少，因此為深入研究黃瓜耐低氮機(jī)制提供了理論支持。

本研究以耐低氮性強(qiáng)的D0328和耐低氮性弱的D0422這2個(gè)黃瓜品種為材料，對(duì)二者在低氮脅迫下3個(gè)關(guān)鍵發(fā)育時(shí)期（苗期、抽蔓期、盛果期）的氮素吸收、代謝、再循環(huán)相關(guān)生理和分子生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行比較分析，以此確定影響黃瓜耐低氮能力的關(guān)鍵因子，為下一步深入探究黃瓜耐低氮機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的耐低氮性最強(qiáng)的黃瓜品種D0328和耐低氮性最弱的黃瓜品種D0422種子，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供[9]。

1.2方法

1.2.1播種

將D0328和D0422種子催芽后，直播于 8 cm×8 cm的全蛭石營養(yǎng)缽中，待其子葉展平，將幼苗移栽到規(guī)格一致、盛等體積蛭石的塑料桶中，于2014年4月開始，在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院試驗(yàn)站開展以下試驗(yàn)。

1.2.2低氮處理試驗(yàn)

待上述2個(gè)黃瓜品種子葉展平時(shí)，用低氮（3 mmol/L NO-3）和正常氮（14 mmol/L NO-3）的營養(yǎng)液進(jìn)行處理，基礎(chǔ)營養(yǎng)液配方[23]為1.512 mmol/L NaH2PO4·2H2O，0.257 mmol/L Na2HPO4·12H2O，1.500 mmol/L MgSO4·7H2O，4.000 mmol/L Ca（NO3）2·4H2O，6.000 mmol/L KNO3，8.600 μmol/L C10H12FeN2NaO8·3H2O，10.300 μmol/L MnSO4，1.000 μmol/L CuSO4·5H2O，30.000 μmol/L H3BO3，24.000 nmol/L Na6Mo7O24· 4H2O，130.000 nmol/L CoCl2·6H2O。分別在苗期（37 d）、抽蔓期（50 d）、盛果期（63 d）取材（根和第3～5節(jié)位葉片），一部分保存于-20 ℃用于生理指標(biāo)測(cè)定，另一部分用液氮速凍后保存于-80 ℃，用于總RNA的提取。

1.2.315N同位素示蹤試驗(yàn)

2個(gè)同位素示蹤試驗(yàn)分別用于檢測(cè)營養(yǎng)生長階段（苗期至抽蔓期）和生殖生長階段（抽蔓期至盛果期）的氮素再循環(huán)效率。用含有15N的14 mmol/L NO3-營養(yǎng)液進(jìn)行處理，Ca（15NO3）2·4H2O（豐度為10%）和K15NO3（豐度為10%）代替Ca（14NO3）2·4H2O和K14NO3，基礎(chǔ)營養(yǎng)液配方如“1.2.2”節(jié)所述。

營養(yǎng)生長階段的同位素試驗(yàn)：子葉展平時(shí)，進(jìn)行15N處理，35 d（T1）時(shí)取根和全部標(biāo)記葉片為初始葉片，剩余植株洗根后用14N營養(yǎng)液處理，42 d（T2）時(shí)取標(biāo)記葉片為初始葉片、新葉、根和花器官。

生殖生長階段的同位素試驗(yàn)：子葉展平時(shí)，進(jìn)行15N處理，42 d（T3）時(shí)取根和全部標(biāo)記葉片為初始葉片，剩余植株洗根后用14N營養(yǎng)液處理，64 d（T4）時(shí)取標(biāo)記葉片為初始葉片、新葉、根和花器官；每個(gè)處理3次重復(fù)。

15N的含量計(jì)算方法參照Diaz等所述[24]。

1.3生理指標(biāo)測(cè)定

硝態(tài)氮含量采用水楊酸比色法[25]測(cè)定；總氮含量釆用凱氏定氮法[25]測(cè)定；NR活性測(cè)定、GS活性測(cè)定、可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[25-26]。

1.4總RNA提取、cDNA第一鏈合成及qRT-PCR

采用Trizol法提取黃瓜葉片總RNA，并用SAM 1000超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量。

按照TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，以總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成 cDNA 的第一鏈。

依照TOYOBO公司的SYBRGreen Realtime PCR Master Mix說明書，以上述cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR分析，基因引物序列見表1，參照基因?yàn)閇WTBX][STBX]1.5數(shù)據(jù)處理

采用DPS 9.50數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.12個(gè)黃瓜品種在低氮脅迫下氮素吸收能力的比較

植物在低氮脅迫下，可吸收的氮素減少，其體內(nèi)的硝態(tài)氮含量及總氮含量會(huì)相應(yīng)降低。圖1表明，在整個(gè)發(fā)育時(shí)期，D0328和D0422在低氮脅迫下，地上、地下部分硝態(tài)氮含量以及地上、地下部分總氮含量都低于正常氮處理，且2個(gè)品種在低氮脅迫下的變化幅度一致，說明2個(gè)黃瓜品種具有相似的氮素吸收能力，也暗示氮素吸收能力并不是引起2個(gè)品種耐低氮能力差異的主要原因。

2.22個(gè)黃瓜品種在低氮脅迫下氮素同化能力的比較

NR和GS都參與氮同化過程，在植物氮素代謝過程中起著重要作用，并且對(duì)外界氮素濃度的反應(yīng)比較敏感。從圖2可以看出，2個(gè)耐低氮能力不同的黃瓜品種在低氮脅迫下，地上、地下部分NR活性基本呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)。在37、50、63 d時(shí)NR活性和GS活性在2個(gè)品種間的變化并沒有明顯的規(guī)律，這一點(diǎn)說明氮素代謝能力并不是黃瓜具有較強(qiáng)耐低氮性的主要原因。

利用qRT-PCR對(duì)黃瓜生殖生長階段葉片中氮素吸收和代謝相關(guān)基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)黃瓜品種在低氮脅迫下

2.42個(gè)黃瓜品種在低氮脅迫下氮素再循環(huán)效率比較

可溶性蛋白質(zhì)是氮素再循環(huán)的一個(gè)重要來源和指標(biāo)。圖4結(jié)果顯示， D0328葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量在苗期、抽蔓期

和盛果期均顯著低于正常氮條件下，而D0422地上部分可溶性蛋白質(zhì)含量在苗期和抽蔓期并沒有顯著改變，卻在盛果期明顯減少（圖4-a）；而且在盛果期D0328低氮脅迫下葉片中的可溶性蛋白質(zhì)含量減少75%，D0422減少57%（圖4-a）；而2個(gè)品種根部的可溶性蛋白質(zhì)含量在3個(gè)時(shí)期并沒有明顯減少（圖4-b）。蛋白質(zhì)降解是氮素再循環(huán)的必要過程之一，這些結(jié)果表明在生殖生長階段即盛果期，D0328比D0422具有更高的氮素再循環(huán)效率。

2.52個(gè)黃瓜品種生殖生長時(shí)期的氮素再循環(huán)能力比較

15N同位素示蹤試驗(yàn)進(jìn)一步證明，在營養(yǎng)生長階段（T1—T2），2個(gè)品種初始葉片中15N的分配比例相似，說明具有相似的[CM（25]氮素再循環(huán)效率（圖3結(jié)論與討論

植物在遭受低氮脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列的生理生化適應(yīng)性反應(yīng)[27]。許多研究表明，在低氮條件下，作為氮素同化的關(guān)鍵酶NR和GS活性降低，蛋白質(zhì)含量也隨之下降[28-29]。然而，對(duì)于不同作物及不同部位對(duì)低氮的響應(yīng)也存在差異，例如，Kant等在研究鹽芥比擬南芥耐低氮脅迫的機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，與充足的氮處理相比，低氮脅迫下鹽芥根和莖中的NR活性變化不大，擬南芥的NR活性在根和莖中分別下降3.4倍和3.7倍；鹽芥和擬南芥的GS活性不受低氮脅迫影響，變化不大；擬南芥的可溶性蛋白質(zhì)含量都下降，但是鹽芥的下降比例少[30]。以上研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的差別可能是由于作物種類及研究部位的不同引起的。

同位素示蹤技術(shù)在研究植物氮素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累中被廣泛應(yīng)用[35-37]。本試驗(yàn)通過對(duì)2個(gè)耐低氮能力不同的黃瓜品種中營養(yǎng)生長階段和生殖生長階段的氮素再循環(huán)效率進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，D0328在生殖生長階段的氮素再循環(huán)效率高于D0422，在營養(yǎng)生長階段并無區(qū)別。

本研究從黃瓜生長發(fā)育的3個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)2個(gè)耐低氮性不同黃瓜品種的氮素吸收、代謝和再循環(huán)效率進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，耐低氮性強(qiáng)的D0328的氮素再循環(huán)效率高于耐低氮性弱的D0422，而氮素吸收和代謝能力相似；同時(shí)，2個(gè)品種的氮素吸收、代謝相關(guān)基因的表達(dá)模式基本一致，初步推斷黃瓜氮素再循環(huán)效率可能是影響其耐低氮性的主要因素。接下來的同位素示蹤試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在生殖生長階段2個(gè)黃瓜老葉片中的15N分配出現(xiàn)了不同，說明耐低氮性強(qiáng)的D0328在生殖生長階段的氮素再循環(huán)效率高于耐低氮性弱的D0422。從于明磊等對(duì)黃瓜耐低氮性進(jìn)行的種質(zhì)資源篩選中，發(fā)現(xiàn)從形態(tài)學(xué)角度耐低氮性強(qiáng)的黃瓜品種衰老延遲[9]。馮卓等對(duì)黃瓜幼苗低氮脅迫下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)，鑒定出一批響應(yīng)低氮脅迫的基因，其中部分低氮響應(yīng)基因與氮素再循環(huán)相關(guān)[14]。上述數(shù)據(jù)初步闡明，生殖生長階段的氮素再循環(huán)效率是影響黃瓜耐低氮性的主要因子之一。這一結(jié)論為接下來深入開展黃瓜耐低氮生理與分子機(jī)制的研究提供了重要的理論基礎(chǔ)。

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