趙永田+趙惠燕

摘要：應用擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP）技術對紫外線誘導的麥長管蚜基因組變異進行篩選，對獲得的63個差異片段進行回收克隆測序。經Blast分析，發(fā)現19條同源性高的基因，按照基因功能可將差異序列劃分為5類：防御基因、調節(jié)能量和信號基因、蛋白質合成基因、損害基因、未知功能基因。蚜蟲對紫外線的響應機制涉及多種代謝過程的基因，如與能量代謝和信號傳導、細胞凋亡等有關的基因，還涉及具有保守結構域的調控因子等。

關鍵詞：紫外線；麥長管蚜；DNA片段；克??；序列分析

中圖分類號： S435.122+.2文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）05-0102-03

蚜蟲是小麥上的主要害蟲，其中麥長管蚜[Sitobion avenae （Fabricius）]作為麥蚜的優(yōu)勢種群，可通過傳播病毒、刺吸汁液、分泌蜜露等方式為害，嚴重影響小麥的產量和品質。蚜蟲作為r對策者，環(huán)境是導致種群分化的主要因素[1-2]。近年來，臭氧層空洞導致紫外線輻射劑量增加，特別是UV-B波段[3]，不可避免地對蚜蟲的遺傳與進化產生巨大的選擇壓力。姚建秀等運用隨機擴增多態(tài)性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）技術對麥長管蚜輻射誘導一代的DNA多態(tài)性進行分析表明，輻射條件下的遺傳距離增大，紫外線可誘導產生種下分化[4]。都二霞等通過設置不同時間和強度的紫外線照射桃蚜，運用SSR（simple sequence repeats）技術研究發(fā)現，F1代桃蚜產生可遺傳變異致使F2代的DNA也發(fā)生變異，且各處理平均多態(tài)位點率之間差異顯著[5]。趙惠燕等對桃蚜設置不同時間的紫外線誘導，采用SSH（spring struts hibernate）技術提取了產生的特異基因，進行克隆、測序，分析了差異基因的功能，得出6類相關基因參與紫外線脅迫[6]。AFLP結合了限制性內切酶片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP）的可靠性與PCR的便捷，具有重復性好、結果可靠等特點。AFLP是較為理想的檢測基因組差異的手段，原因在于它不需要提前知曉基因組序列，可直接用于檢測。張根發(fā)等對低能離子誘導擬南芥引起的基因組DNA變異采用AFLP進行檢測，并對差異片段進行克隆，測序發(fā)現突變可能存在突變熱點[7]。陳照立等應用AFLP成功回收了與二羥環(huán)氧苯并芘（BPDE）相互作用產生的DNA差異片段，經克隆測序及同源性比對發(fā)現，9條可能導致BPDE引發(fā)肺癌有關的基因片段[8]。然而利用AFLP對紫外線誘導麥長管蚜的遺傳變異分析尚未見報道。本研究選擇麥長管蚜為試驗材料，利用AFLP技術分析經紫外線處理和對照組之間的DNA變異，對差異基因進行篩選、克隆、測序，分析差異基因的功能，初步探索蚜蟲對紫外線的響應機制，為蚜蟲進化研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1試蟲

試驗蟲源由德國聯邦農林生物研究中心提供。處理方法：取發(fā)育一致的成蟲，分成對照組和試驗組。試驗組經紫外線照射時間為1、2、3、4、6、8 h；對照組采用正常光照。光源高度統(tǒng)一為蚜蟲上方30 cm處。處理后的當代成蚜標記為F0代，繼續(xù)培養(yǎng)2代，均按照同樣處理照射成蟲，并依繁殖次序收集成蟲標記為F1、F2代。

1.2方法

1.2.1DNA池的構建及AFLP反應體系

分別對不同處理時間的蚜蟲構建DNA池。DNA的提取方法及AFLP反應體系參考文獻[9]。

1.2.2差異表達片斷的回收、克隆與測序

用刀片切取差異條帶，用ddH2O浸泡后，取上清液重新擴增，從瓊脂糖凝膠上回收二次擴增差異片段。將回收產物連接于pMD18-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，復蘇后37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性（白斑）克隆進行菌落PCR。經鑒定的陽性克隆送上海生工生物工程公司測序。

1.2.3同源性比對

測序結果輸入美國國家生物技術信息中心NCBI（http：//www.ncbi..nlm.nih.gov）網站，并應用Blast工具對差異片段序列同源性進行比對。

2結果與分析

2.1差異片斷的AFLP分析

擴增的差異性主要體現為條帶的增加或缺失。通過統(tǒng)計差異條帶數目，計算不同處理的變異頻率發(fā)現，變異頻率隨著處理時間的增加而增大，且二者之間存在著正相關，此結論與文獻[10]研究結果一致。

2.2差異片段的克隆與菌落PCR鑒定

可知，質粒的擴增片段大小與回收的差異片段一致，表明差異片段成功連接在質粒載體上。

2.3同源性功能分析

對63個克隆成功的序列經測序并通過Blast比對分析，發(fā)現有19個同源性高的基因序列，在比對的過程中發(fā)現，有4個序列經同源性檢測都為Fgd6 protein鳥嘌呤核苷酸交換因子，2個序列為HSP15熱休克蛋白。主要可能參與脅迫響應的基因功能如表1所示，未列出未知功能基因。進一步分析相關基因的功能，可以將19個序列分成5大類：防御基因，約占21%；調節(jié)能量與信號基因，約占37%；蛋白質合成基因，約占5%；損害基因，約占11%；未知功能基因，約占26%（圖3）。

3結論與討論

通過AFLP技術，共有63個差異片段克隆并測序成功，結果表明，經紫外線誘導的蚜蟲DNA變異可以采用AFLP技術進行差異檢測與篩選。本研究與趙惠燕等的研究結論[6]一致，經紫外線脅迫后調節(jié)能量與信號基因和防御基因表達明顯增多，表明蚜蟲面對脅迫能積極作出應激反應。如Hsp15，作為小分子應激蛋白熱休克蛋白，可以與質膜結合[11]，而質膜是細胞吸收外界物質的動態(tài)屏障，也是信息傳遞的通道，起到保護作用。同時小分子熱激蛋白因為具有分子伴侶的作用，所以在不良條件下可以降低蛋白的合成折疊出現異常的概率和穩(wěn)定性，在不良條件下提高生存率[12]。部分熱激蛋白在序列上與細胞防脫水蛋白存在某種相似性，這種相似性可以抑制細胞脫水，使溶質不易發(fā)生滲透，從而減輕冷脅迫對細胞膜的損害，使組織的抗冷性增強[13]。質膜蛋白家族成員眾多，底物多樣，功能也較多，包括對抗生素產生抗性、轉換信號、表達抗原等[14-15]，但它們有共同的特點，能結合并水解ATP，通過細胞膜轉運各種物質[16]。核糖體蛋白L11在蛋白質合成過程中必不可少，并且是高度保守的蛋白質[17]。L11的N-末端具有分子開關功能，在EF-G依賴的遷移過程和RF1識別終止密碼子UAG的過程中都是必須的。Harms等研究表明，L11在核糖體的翻譯過程中起到分子開關的作用[18]。在脅迫的過程中發(fā)現，有損害功能的基因參與其中，如硫酸糖基化蛋白（94sin1），對細胞的存活及增殖分化有負性調節(jié)作用[19]，但具體作用機制還不清楚。除了已知的功能基因外，本研究還得到許多同源性較高，但功能未知的基因，有待進一步研究其在紫外線耐受方面的功能。

研究表明，蚜蟲對紫外線的脅迫響應機制非常復雜，涉及多途徑多種基因協同作用。雖然本研究獲得的差異基因反映的信息不夠全面，但通過篩選鑒別這些特異基因，分析其功能，是闡明蚜蟲對紫外線脅迫分子變異和響應機制的必要前提，同時為蚜蟲的分子進化提供理論依據。

參考文獻：

[1]Bensadia F，Boudreault S，Guay J F，et al. Aphid clonal resistance to a parasitoid fails under heat stress[J]. Journal of Insect Physiology，2006，52（2）：146-157.

[2]Chen Z，Madden R D，Dillwith J W. Effect of precocene Ⅱ on fatty acid metabolism in the pea aphid，Acyrthosiphon pisum，under cold stress[J]. Journal of Insect Physiology，2005，51（4）：411-416.

[3]Madronich S，Mckenzie R L，Bjrn L O，et al. Changes in biologically active ultraviolet radiation reaching the earths surface[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B Biology，1998，46（1/2/3）：5-15.

[4]姚建秀，趙惠燕. 紫外條件誘導下麥長管蚜DNA的變異研究[J]. 西北農業(yè)學報，2001，10（1）：33-36.

[5]都二霞，郭劍文，趙惠燕. 紫外輻射誘導桃蚜DNA變異[J]. 應用生態(tài)學報，2006，17（7）：1245-1249.

[6]趙惠燕，都二霞，郭劍文，等. UV-B輻射脅迫下桃蚜差異基因表達的分子生態(tài)初步研究[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版），2010（3）：132-138.

[7]張根發(fā)，聶艷麗，石小明，等. 低能離子注入擬南芥DNA變異的AFLP檢測及差異片段的序列分析[J]. 遺傳學報，2004，31（9）：1021.

[8]陳照立，金敏，郭向飛，等. 用AFLP結合免疫納米磁珠技術富集分離BPDE-DNA片段[J]. 解放軍預防醫(yī)學雜志，2007，25（5）：324-327.

[9]趙永田，王興娥，趙惠燕，等. 麥長管蚜AFLP銀染分析體系的建立與優(yōu)化[J]. 貴州師范大學學報（自然科學版），2010，28（1）：1-5.[ZK）]

[10]趙永田，趙惠燕. 紫外線脅迫麥長管蚜DNA變異的AFLP分析[J]. 生物技術通報，2009（10）：142-145，155.

[11]Lin C Y，Chen Y M，Key J L，et a1.Solute leakage in soybean seedlings under various heat shock regimes[J]. Plant and Cell Physiology，1985，26（8）：1493-1498.

[12]Soto A，Allona I，Collada C，et al.Heterologous expression of a plant small heat-shock protein enhances Escherichia coli viability under heat and cold stress[J]. Plant Physiology，1999，120（2）：521-528.

[13]邵玲，陳向榮. 熱激蛋白與植物的抗逆性[J]. 北方園藝，2005（3）：73-74.

[14]Tachikawa H，Takeuchi Y，Funahashi W，et al. Isolation and characterization of a yeast gene，MPD1，the overexpression of which suppresses inviability caused by protein disulfide isomerase depletion[J]. FEBS Letters，1995，369（2/3）：212-216.

[15]Schneider E，Hunke S.ATP-binding-cassette（ABC）transport systems：functional and structural aspects of the ATP-hydrolyzing subunits/domains[J]. FEMS Microbiology Reviews，1998，22（1）：1-20.

[16]吳麗娜，林向民，任海霞，等. Halomonas aquamarina鹽敏感質膜蛋白組的研究[J]. 廈門大學學報（自然科學版），2005，44（增刊1）：139-141.

[17]王玉瑤，張志云，梁愛華. 核糖體蛋白L11及其功能[J]. 生命的化學，2008，28（1）：104-106.

[18]Harms J M，Wilson D N，Schluenzen F，et al. Translational regulation via L11：molecular switches on the ribosome turned on and off by thiostrepton and micrococcin[J]. Molecular Cell，2008，30（1）：26-38.

[19]藍儒竹，葉章群，王齊襄，等. 硫酸糖基化蛋白2在去勢大鼠前列腺中的表達[J]. 中華實驗外科雜志，2001，18（5）：415-417.