凌耿強(qiáng)，馬東營，何瑞星，王悅娜，葉偉

腫瘤細(xì)胞微環(huán)境對膠質(zhì)瘤血管生成擬態(tài)形成的影響

凌耿強(qiáng)，馬東營，何瑞星，王悅娜，葉偉

目的探討腫瘤細(xì)胞微環(huán)境改變對膠質(zhì)瘤血管生成擬態(tài)（VM）形成的影響。

膠質(zhì)瘤； 血管生成擬態(tài)； 腫瘤細(xì)胞微環(huán)境； 缺氧； 抗血管生成治療

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其血供豐富，應(yīng)用抗血管生成治療對控制膠質(zhì)瘤生長效果明顯[1]。但是，近年發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤對抗血管生成藥物具有抗藥性，其機(jī)制可能與血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）相關(guān)[2]。VM 是一種不依賴于內(nèi)皮細(xì)胞而形成的供血管道，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)存在于多種惡性腫瘤中[3]，并且有研究提示 VM 與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后相關(guān)[4]。因此，VM 可能是膠質(zhì)瘤治療的新靶點之一[5]。

既往認(rèn)為，VM 形成與否跟腫瘤細(xì)胞自身特性有關(guān)，不形成 VM 的腫瘤細(xì)胞對周圍基質(zhì)環(huán)境進(jìn)行重塑的能力很弱，即使添加了一些與形成管道相關(guān)的細(xì)胞因子，包括血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板源生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，也無法產(chǎn)生管道樣結(jié)構(gòu)[2]。最近有研究顯示，原本無法形成 VM 的低度惡性腫瘤細(xì)胞在某些環(huán)境中（如大于 2% 的缺氧環(huán)境）也可以形成 VM 結(jié)構(gòu)[6-7]。因此我們推測腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境才是其能否形成 VM 的決定因素。微環(huán)境的改變與細(xì)胞外基質(zhì)中 VM 相關(guān)的細(xì)胞因子（VEGF、bFGF、TGF-β、PDGF、TNF-α）濃度變化以及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2、MMP-9）活性水平相關(guān)。在本課題中，我們擬采用多種改變微環(huán)境的方法誘導(dǎo)低惡性度膠質(zhì)瘤細(xì)胞 SHG44 形成VM 結(jié)構(gòu)，并通過檢測微環(huán)境中多種細(xì)胞因子的濃度變化和基質(zhì)金屬蛋白酶的活性水平探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U251 購自上海博士德生物工程有限公司；人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 SHG44 購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；10% 胎牛血清、胰蛋白酶購自美國 Hyclone 公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司；Matrigel 購自美國 Becton Dickson 公司；CoCl2購自美國Sigma 公司；VEGF、TGF-β、bFGF、PDGF、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海史瑞可生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng) 所有的培養(yǎng)基中均添加100 U/ml 的青霉素和 100 μg/ml 的鏈霉素，臨用前再添加 10% 胎牛血清，細(xì)胞置于 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，每 2～3 天傳代一次。

1.2.2 細(xì)胞的三維培養(yǎng)及管道計數(shù)實驗 參照 El Hallani 等[8]的方法并加以改進(jìn)，把 200 μl Matrigel膠于 4 ℃ 過夜融化，并加入預(yù)冷的 24 孔板中，置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱中 30 min 固化，細(xì)胞消化離心后重懸，不加血清，接種于 24 孔板中，每孔接種5×104個，37 ℃ 培養(yǎng) 24 h 后用倒置顯微鏡于×200 隨機(jī)選取上、下、左、右、中 5 個視野，每個視野的管道總長度取平均值進(jìn)行組間比較。

1.2.3 誘導(dǎo) SHG44 細(xì)胞形成 VM

1.2.3.1 缺氧環(huán)境誘導(dǎo) 采用張熙等[7]的方法，將無血清培養(yǎng)的 SHG44 細(xì)胞種入預(yù)鋪 Matrigel 的孔板后，每孔加入 CoCl2100 mmol/L。37 ℃ 培養(yǎng)24 h，觀察各組 SHG44 細(xì)胞 VM 的形成情況。

1.2.3.2 U251 上清誘導(dǎo) 將 U251 進(jìn)行無血清培養(yǎng)約 24 h，收集其上清并離心。將 U251 上清混合 SHG44 細(xì)胞后，均勻接種至預(yù)鋪 Matrigel的孔板上，37 ℃ 培養(yǎng) 24 h 后觀察。

1.2.3.3 接種過 U251 的 Matrigel 誘導(dǎo) 參照Seftor 等[9]的方法并加以改進(jìn)，先將 U251 細(xì)胞種入預(yù)鋪 Matrigel 的孔板中，置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后，U251 細(xì)胞形成 VM。依次用 20 mmol/L的 NH4OH、蒸餾水、PBS、常規(guī)培養(yǎng)基沖洗并浸泡 1 h，將 U251 細(xì)胞完全除去。然后將無血清培養(yǎng)的 SHG44 細(xì)胞接種至上述孔板中，37 ℃ 培養(yǎng)24 h 后觀察。

1.2.4 ELISA 檢測細(xì)胞因子濃度 各組細(xì)胞種到Matrigel 上 24 h 后，上層培養(yǎng)基離心取上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行 VEGF、TGF-β、bFGF、PDGF、TNF-α 的 ELISA 檢測。每組設(shè) 2 個復(fù)孔。

1.2.5 明膠酶譜檢測 MMP-2、MMP-9 活性水平 取對數(shù)生長期細(xì)胞至無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，收集上清離心，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，洗脫、漂洗后孵育，然后染色及脫色，顯示 MMP-2（72 kD）和 MMP-9（92 kD）為位于藍(lán)色背景上的透亮帶，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析讀取條帶光密度值（OD），記錄數(shù)據(jù)。實驗重復(fù) 2 次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 用不同的方法誘導(dǎo) SHG44 細(xì)胞形成 VM 并比較組間管道長度差異

三維培養(yǎng)時，SHG44 細(xì)胞并不形成 VM。部分細(xì)胞呈球形并聚集成大小不等的細(xì)胞集落，部分細(xì)胞呈梭形散在分布。管道計數(shù)實驗（圖 1）可見缺氧組形成 VM 的能力最強(qiáng)為（2479.67 ± 286.09）μm，U251 上清組次之為（2166.73 ± 171.80）μm，接種過 U251 的 Matrigel 組能力最弱為（1406.00 ± 155.37）μm。

2.2 ELISA 檢測

不同處理組的 SHG44 細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF、TGF-β、bFGF、PDGF、TNF-α 的濃度采用 ELISA 測定。結(jié)果顯示，對照組、缺氧組、U251上清組、預(yù)處理 Matrigel 組的 VEGF 濃度分別為（115.40 ± 8.99）、（362.19 ± 25.69）、（306.02 ± 11.30）、（261.90 ± 18.57）pg/ml，TGF-β 濃度分別為（1309.87 ± 32.69）、（5699.63 ± 38.67）、（5311.67 ± 34.20）、（5036.37 ± 22.30）pg/ml，bFGF 濃度分別為（785.07 ± 18.16）、（4214.26 ± 188.70）、（4068.63 ± 164.82）、（4172.73 ± 145.66）pg/ml，PDGF 濃度分別為（49.44 ± 5.12）、（157.83 ± 1.67）、（124.19 ± 0.85）、（92.03 ± 5.59）pg/ml，TNF-α 濃度分別為（3.26 ± 0.16）、（8.27 ± 0.25）、（8.04 ± 0.16）、（7.89 ± 0.43）pg/ml。各實驗組 VEGF、TGF-β、bFGF、PDGF、TNF-α 濃度與未處理組相比均有顯著升高（P ＜ 0.05），但缺氧組、U251 上清組、預(yù)處理Matrigel 組有明確遞減趨勢的因子為 VEGF、TGF-β、PDGF，并且經(jīng)過 Spearman 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)VEGF、TGF-β、PDGF 與 VM 形成能力具有相關(guān)性（P ＜ 0.05），而 bFGF（P=0.893）和 TNF-α（P=0.258）與 VM 形成無明顯相關(guān)性。

2.3 明膠酶譜檢測

明膠酶譜檢測結(jié)果（圖 2）顯示，缺氧組MMP-2 和 MMP-9 活性均顯著高于對照組（P ＜0.05）。U251 上清組的 MMP-2 與對照組相比顯著增高（P ＜ 0.05），但較缺氧組下降（P ＜ 0.05），而MMP-9（P=0.855）與對照組無顯著差異。U251 預(yù)處理的 Matrigel 組的 MMP-2（P=0.669）及MMP-9（P=0.068）與對照組均無顯著差異。Spearman 相關(guān)分析顯示，MMP-2 與 VM 形成能力相關(guān)性顯著（P ＜ 0.05），而 MMP-9 無相關(guān)性（P=0.195）。

圖1 不同方法誘導(dǎo) SHG44 細(xì)胞形成 VM 及管道形成實驗（A：各組細(xì)胞三維培養(yǎng)形態(tài)；B：實驗組組間比較柱狀圖；*P＜ 0.05）Figure 1 SHG44 VM formation was induced by different methods and tube formation assays (A:Three dimentional culture of each group of cells; B:Histogram between experimental groups;*P ＜ 0.05)

圖2 MMP-2（A）及 MMP-9（B）活性測定（與對照組相比，P ＜ 0.05）Figure 2 Activity of MMP-2 (A) and MMP-9 (B) in each group (*P ＜ 0.05 compared with control group)

3 討論

腫瘤微環(huán)境指腫瘤在生長過程中，腫瘤細(xì)胞及細(xì)胞外間質(zhì)相互作用形成的特殊環(huán)境[10]。有研究指出，腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境下其增殖、侵襲及遷移的能力明顯增加[11-12]。VM 往往出現(xiàn)在高侵襲性及高惡性度的腫瘤中，一些研究已經(jīng)表明缺氧的微環(huán)境可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞形成 VM。U251 細(xì)胞做為一種VM 陽性細(xì)胞已為許多研究證實[13-14]。U251 細(xì)胞系來源于人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 IV 級，生長迅速，惡性度高，因此容易形成一個相對缺氧的微環(huán)境。本次實驗中，我們用 U251 上清及 U251 預(yù)處理Matrigel 等多種方法均成功誘導(dǎo) SHG44 細(xì)胞形成 VM。同時，我們根據(jù)張熙等[7]的報道在 SHG44培養(yǎng)基中加入 CoCl2，制造化學(xué)缺氧環(huán)境，也成功誘導(dǎo)其形成 VM。這表明能否形成 VM 可能與腫瘤細(xì)胞自身的性質(zhì)關(guān)系并不大，腫瘤所處的微環(huán)境才是 VM 形成的關(guān)鍵因素。在一定的條件下，腫瘤細(xì)胞會根據(jù)微環(huán)境改變自身的形態(tài)及行為。

另外，我們還檢測了 SHG44 腫瘤細(xì)胞在形成VM 過程中 VEGF、bFGF、TGF-β、PDGF及 TNF-α的表達(dá)變化。這些因子已證實在內(nèi)皮細(xì)胞依賴的血管形成的過程中起著重要作用。據(jù)報道，這些因子在具有不同 VM 形成能力的細(xì)胞中表達(dá)量也有明顯差異，與細(xì)胞形成 VM 的能力相關(guān)[15]。本實驗結(jié)果顯示，以上因子在各處理組的表達(dá)量與對照組相比均有明顯增高，但尤其以 VEGF、TGF-β 和PDGF 這三種因子與 VM 形成能力具有相關(guān)性。同時，我們通過明膠酶譜檢測還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用 CoCl2制造缺氧環(huán)境時，MMP-2 和 MMP-9 的活性明顯增高，表明 MMP-2 和 MMP-9 是微環(huán)境改變的重要指標(biāo)。但是，僅 MMP-2 活性與 VM 形成能力具有相關(guān)性，表明 MMP-2 及 MMP-9 可能是VM 形成的充分條件之一而非必要條件。由此我們推測，缺氧微環(huán)境中 VEGF、TGF-β 和 PDGF 三因子濃度及 MMP-2 活性在誘導(dǎo)低惡性度腫瘤細(xì)胞形成 VM 的過程中起重要作用，但其機(jī)制目前尚不完全清楚，需要進(jìn)一步探索。結(jié)合既往文獻(xiàn)，我們推測缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）可能是微環(huán)境中誘導(dǎo) VM 形成的關(guān)鍵因素[16]。

根據(jù)本實驗的結(jié)果，我們認(rèn)為在治療腫瘤時一旦采取僅僅針對血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管抑制治療，由于血供減少，腫瘤細(xì)胞必然會處于缺氧環(huán)境。但是，腫瘤細(xì)胞為了滿足自身的營養(yǎng)需要，就可能形成VM，重新向腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)。這不但不能殺死腫瘤，還會導(dǎo)致腫瘤侵襲性和惡性度增加，導(dǎo)致病程急劇進(jìn)展[17]。因此，進(jìn)一步了解腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞供血的改變有助于我們更好地應(yīng)用抗血管生成療法，并且提示我們通過改變腫瘤細(xì)胞的缺氧微環(huán)境才能在早期徹底切斷腫瘤供血，達(dá)到抑制腫瘤生長甚至“餓死”腫瘤的效果。

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Influence of tumor microenvironment on vasculogenic mimicry formation in glioma

LING Geng-qiang,MA Dong-ying,HE Rui-xing,WANG Yue-na,YE Wei

ObjectiveTo study the influence of tumor microenvironment on vasculogenic mimicry (VM) formation in glioma.MethodsWe induced VM formation in glioma cell line SHG44 by three ways,including creating a chemical hypoxic environment,adding U251 cell culture supernatant and preteating Matrigel with U251.Then,we detected the expression of VEGF,TGF-β,bFGF,PDGF and TNF-α in the supernatant of each culture.The MMP activities were also tested.ResultsVM network formed by SHG44 was successfully induced in all the groups.The capability of VM formation was different among the three groups,with the best result seen in the hypoxic group.In the other two groups,the group with U251 supernatant was better than the Matrigel pretreatment by U251 group.Expression of VEGF,TGF-β and PDGF in each group were correlated with capability of VM formation.MMP-2 activity was also correlated with capability of VM formation.ConclusionVM formed by glioma cells might be induced by multi-factor in the hypoxic tumor microenvironment.Expression of VEGF,TGF-β,PDGF and MMP-2 were correlated with VM formation in glioma.

Glioma; Vasculogenic mimicry; Tumor microenvironment; Hypoxia; Antiangiogenic therapy

LING Geng-qiang,Email:lgq1013@sina.com

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（12541412）

150081 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科

凌耿強(qiáng)，Email：lgq1013@sina.com

2016-12-03

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.006

方法通過制造化學(xué)缺氧環(huán)境、添加 U251 上清和用 U251細(xì)胞預(yù)處理 Matrigel 等 3 種方法誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 SHG44形成 VM，并檢測上述幾種培養(yǎng)基上清中的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、血小板源生長因子（PDGF）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)與對照組 SHG44 細(xì)胞的差異，同時比較組間基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）活性水平。

結(jié)果幾種方法均能誘導(dǎo) SHG44 細(xì)胞形成 VM 結(jié)構(gòu)，其中缺氧組 VM 形成能力最強(qiáng)，添加 U251 上清組次之，U251 細(xì)胞預(yù)處理 Matrigel 組最弱，且?guī)讉€處理組上清中的 VEGF、TGF-β 和 PDGF 濃度與各組 VM 形成能力相關(guān)，MMP-2 活性也與 VM 形成能力相關(guān)。

結(jié)論膠質(zhì)瘤 VM 形成很可能是微環(huán)境改變后多種因素作用的結(jié)果，其中 VEGF、TGF-β、PDGF、MMP-2 與 VM形成關(guān)系具有相關(guān)性。

Author Affiliation:Department of Neurosurgery,Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150081,China