沈 晨, 周旻曦, 周素明, 王國良

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室, 寧波 315211)

體外人工感染的刺激隱核蟲幼蟲的電鏡觀察

沈 晨, 周旻曦, 周素明, 王國良

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室, 寧波 315211)

通過透射和掃描電鏡等研究刺激隱核蟲幼蟲階段發(fā)育特征。從患病的大黃魚上采集各個時期的包囊，體外感染傳代培養(yǎng)收集幼蟲，制成電鏡樣品，研究幼蟲的超微結(jié)構(gòu)。對不同時間段的脫包后幼蟲的電鏡和光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，脫包后0～4 h的幼蟲蟲體，細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較完整，周身遍布體纖毛，于培養(yǎng)液中快速游動；8～16 h時，幼蟲體纖毛逐漸減少，游動緩慢，細(xì)胞胞質(zhì)稀薄，幼蟲長徑縮短；20～24 h時，體纖毛稀少，幼蟲不運(yùn)動沉底，細(xì)胞形狀由淚滴形變?yōu)椴灰?guī)則并開始凋亡，蟲體明顯萎縮，長徑僅10 μm左右。在不同時段的幼蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)變化特征與感染活性喪失過程相關(guān)聯(lián)，反映能量衰減可能是影響刺激隱核蟲幼蟲感染能力的主要原因。

刺激隱核蟲；感染力；人工感染；超微結(jié)構(gòu)

刺激隱核蟲(Cryptocaryonirritans)又名海水小瓜蟲，隸屬于前口綱(Class Prostomatea)，前管目(Order Proreodonisa)，隱核蟲科(Family Cryptocaryonidae)的隱核蟲屬(Genuscryptocaryon)[1]。最早被日本學(xué)者Sikama[2]研究報道。刺激隱核蟲常寄生于海水硬骨魚類體表的上皮組織中，導(dǎo)致白點病的發(fā)生[3]。一旦海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類發(fā)病，就會對當(dāng)?shù)貪O業(yè)經(jīng)濟(jì)造成重大損失[4]。

在刺激隱核蟲超微結(jié)構(gòu)研究方面，1981年Cheung[5]采用掃描電鏡研究了刺激隱核蟲的包囊以及滋養(yǎng)體，其中詳實地描述了滋養(yǎng)體口器的觀察，而未對幼蟲階段進(jìn)行研究。徐潤林等[6]和Xu等[7]分別研究了刺激隱核蟲幼蟲的口器和包囊壁結(jié)構(gòu)的超微結(jié)構(gòu)。Colorni和Diamont[8]對刺激隱核蟲不同發(fā)育期蟲體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。Matthews[9]首次使用透射電鏡對刺激隱核蟲幼蟲階段進(jìn)行描述。黃瑋等[10]對人工感染的刺激隱核蟲的皮層和口器進(jìn)行詳細(xì)地描述。上述文獻(xiàn)雖對刺激隱核蟲各階段結(jié)構(gòu)特點進(jìn)行了研究，但未探討幼蟲24 h內(nèi)失去感染力的原因。本實驗參考但學(xué)明[11]以卵形鯧鲹(Trochintuovatus)為宿主建立的刺激隱核蟲傳代系統(tǒng)，稍加改進(jìn)后選擇養(yǎng)殖大黃魚(Pseudosciaenacrocea)作為宿主。通過人工感染和傳代的方法收集幼蟲，對其進(jìn)行較為系統(tǒng)地超微結(jié)構(gòu)觀察，以探索刺激隱核蟲幼蟲感染力喪失的原因，為驅(qū)殺該蟲的時機(jī)和防治白點病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 蟲體來源

大黃魚樣本分批采自寧波市象山養(yǎng)殖海區(qū)和福建省寧德養(yǎng)殖海區(qū)，并按照但學(xué)明[11]的方法選取患病大黃魚。剪下鰓片，放入含過濾海水的培養(yǎng)皿中，用載玻片刮下滋養(yǎng)體，用吸管將長徑大于400 μm的滋養(yǎng)體轉(zhuǎn)移至9 cm培養(yǎng)皿中，加入25‰的滅菌海水，25℃黑暗中培育。

1.2 蟲體的感染及不同時期幼蟲的收集

待刺激隱核蟲幼蟲從包囊中孵出后，收集幼蟲。以每尾魚用大約20 000個幼蟲，感染體重250 g左右的大黃魚2 h，之后放入海水網(wǎng)箱中養(yǎng)殖。每天檢查魚體和鰓表面，待白點充分顯現(xiàn)后，將魚放到特制的收蟲漏斗中暫養(yǎng)過夜。最后取下收蟲漏斗下的收蟲杯，即可從中收獲大量的包囊。在包囊脫包后放出幼蟲高峰期(即收集包囊后第3天的晚上)，更換培養(yǎng)液，然后將收集的活躍幼蟲同步分成若干份，分別在0、4、8、12、16、20和24 h用0.2%福爾馬林殺死幼蟲，于4000 r/min離心5 min 收集蟲體。

1.3 透射電鏡樣品制備

用3 %戊二醛(0.1 mol/L磷酸緩沖液)固定幼蟲1 h以上(4℃)。將樣品用磷酸緩沖液洗滌2次，每次15 min。之后酒精逐級脫水，然后樹脂包埋(幼蟲包埋之前，需進(jìn)行離心濃縮)，超薄切片，再用檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾染色。透射電鏡下觀察、拍照及記錄。

1.4 掃描電鏡樣品制備

用3 %戊二醛(0.1 mol/L 磷酸緩沖液)固定幼蟲1 h(4℃)。之后用酒精逐級脫水(每次脫水均需進(jìn)行離心濃縮)，臨界點干燥，噴金。掃描電鏡下觀察、拍照及記錄。

1.5 幼蟲形態(tài)大小測量

分別取各時段幼蟲10條，測量長徑和短徑，統(tǒng)計數(shù)值取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺激隱核蟲幼蟲脫包后形態(tài)變化過程的顯微及亞顯微結(jié)構(gòu)觀察

幼蟲在光鏡下呈卵圓形或淚滴狀，長徑約50 μm，短徑約20 μm，全身布滿纖毛。脫包后0～4 h的幼蟲蟲體，在光鏡下清晰可見隨著周身纖毛的擺動，蟲體于培養(yǎng)液中快速游動，此時幼蟲感染力最強(qiáng)；脫包后8～16 h時，幼蟲蟲體纖毛逐漸減少，游動緩慢，感染力開始減弱；脫包后20～24 h，只有少部分蟲體仍在運(yùn)動，大部分幼蟲沉于培養(yǎng)板底部，并可見周身纖毛大量減少，感染力喪失。

圖1 刺激隱核蟲幼蟲脫包0～4 h亞顯微觀察

1：幼蟲口器及纖毛的透射電鏡(剛脫包)，示口纖毛(OC)、黏液囊(Mu)、質(zhì)膜小泡(PA)；2：整個幼蟲掃描電鏡(剛脫包)，示體纖毛；3：示雙動基口纖毛(4 h)；4：示幼蟲橫切面(4 h)，口肋(OR)

幼蟲全身密被單動基體纖毛(圖1-2)，分為縱向平行排列的體纖毛和環(huán)向排列的口纖毛(圖1-2、3)。胞口(oralrib)從幼蟲的前部頂端延伸至后腹部，整個口肋位于前端偏腹側(cè)，呈縫隙狀(圖1-4) 。幼蟲有3 層外膜，由內(nèi)向外分別是內(nèi)泡膜(inner alveolar membrane)、外泡膜(outer alveolarmembrane) 和外限制膜(outer limiting membrane)。內(nèi)泡膜在質(zhì)膜小泡的內(nèi)側(cè)，質(zhì)膜小泡凸出于質(zhì)膜表面且內(nèi)部充滿電子致密物質(zhì)(圖1-1)，兩排質(zhì)膜小泡之間的細(xì)胞膜凹下呈犁溝狀，縱行的纖毛即從此犁溝內(nèi)長出來(圖1-1)。外泡膜襯于外限制膜之下，外限制膜覆蓋整個蟲體、口囊、纖毛和細(xì)胞表面內(nèi)陷部分。

幼蟲脫包后0～4 h：從掃描電鏡可以看出幼蟲蟲體全身遍布體纖毛(圖1-2)并且較為濃密，而且這一時期幼蟲的細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較完整，細(xì)胞中含有較多顆粒狀胞質(zhì)比如高爾基體、伸縮泡、線粒體和共生細(xì)菌，幼蟲胞質(zhì)中還含少量的脂肪顆粒 (圖1-1)。

幼蟲脫包后8～16 h：纖毛不斷脫落導(dǎo)致體纖毛數(shù)量明顯減少(圖2-5、7)。此時幼蟲長徑約為20～30 μm。透射電鏡圖顯示其細(xì)胞胞質(zhì)變的稀薄(圖2-5)，電子致密物質(zhì)減少，但口器清晰可見，口纖毛依然茂密(圖2-6、7)。

圖2 刺激隱核蟲幼蟲脫包8～16 h亞顯微觀察

5：幼蟲胞質(zhì)稀薄(16 h)，單動基體纖毛(SC)；6：口器橫切面(8 h)；7：幼蟲掃描電鏡(12 h)，示體纖毛已逐漸脫落

幼蟲脫包后20～24 h：幼蟲細(xì)胞發(fā)生顯著變化。體纖毛和口纖毛幾乎完全脫落，露出一列一列的毛基體。細(xì)胞大小也發(fā)生了變化，嚴(yán)重緊縮，平均長徑僅10 μm左右，體型變得更為修長。細(xì)胞膜變松弛，細(xì)胞形狀由淚滴形變得不規(guī)則，細(xì)胞器幾乎完全凋亡，形成許多凋亡小體(圖3-8、9、10、11)。

3 討論

若想系統(tǒng)地研究刺激隱核蟲，能夠適時獲得足量的寄生蟲材料是非常必要的，但要想從自然界穩(wěn)定地獲得樣本卻非常困難，發(fā)病的時間和地點，及其采樣的客觀條件都直接制約著獲取樣本的數(shù)量。曾經(jīng)有學(xué)者試圖在實驗室里用其他海水魚類作為宿主培育寄生蟲，但由于某些海水魚類飼養(yǎng)的復(fù)雜性而存在著某些缺陷，導(dǎo)致最終的寄生蟲產(chǎn)量較低。本研究建立的以大黃魚為宿主的傳代系統(tǒng)有諸多優(yōu)點：首先，材料收集方法簡單，幼蟲可以殺死后離心收集；其次，寄生蟲孵化率高，循環(huán)周期短，因此總產(chǎn)量很高，為研究工作提供了保障；再次，大黃魚是最易感染刺激隱核蟲的養(yǎng)殖魚類[12]，故緊密結(jié)合生產(chǎn)實際，研究結(jié)果可及時應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)。

圖3 刺激隱核蟲幼蟲脫包20～24 h亞顯微觀察

8：凋亡的刺激隱核蟲幼蟲(24 h)；9：體被纖毛完全脫落的幼蟲(20 h)；10：幼蟲體積萎縮(24 h)；11：凋亡中的刺激隱核蟲幼蟲(20 h)

刺激隱核蟲的幼蟲期是其整個生活史中唯一具有感染能力的時期，其蟲體透明，游動速度快，且脫離包囊后2 h的幼蟲感染力最強(qiáng)，3～20 h 感染力逐漸減弱到喪失感染力，幼蟲30 h內(nèi)不感染宿主就會死亡[13]。在本實驗中，分別將存活了0、4、8、12、16、20和24 h的幼蟲固定后，利用顯微及亞顯微技術(shù)觀察各時段發(fā)育形態(tài)的變化特征，探索其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化與感染力消失之間的關(guān)系，為防治刺激隱核蟲病的有效時間和方法提供了實驗依據(jù)。

觀察脫包0～4 h時期的幼蟲時發(fā)現(xiàn)，其全身布滿纖毛，游動速度快，有利于它在水體中尋找宿主和成功感染。有報道認(rèn)為脫包6～8 h后，幼蟲的感染能力大大減弱[14-16]，作者觀察脫包8～16 h時期的幼蟲時發(fā)現(xiàn)在掃描電子顯微鏡下其體纖毛大部分脫落，光鏡下幼蟲行動遲緩，這些現(xiàn)象表明刺激隱核蟲幼蟲感染能力的下降。Burgess[14]和Dan[17]認(rèn)為刺激隱核蟲幼蟲在脫包18 h后完全喪失感染力，本實驗在觀察脫包20～24 h時期的幼蟲時，發(fā)現(xiàn)刺激隱核蟲幼蟲纖毛幾乎完全脫落，細(xì)胞發(fā)生顯著變化，形體急劇萎縮，呈現(xiàn)凋亡。Nigrelli和Ruggier[18]研究發(fā)現(xiàn)幼蟲從包囊溢出之后并不進(jìn)食而是在水中快速游動，尋找感染宿主才能維系生命活動。徐潤林等[6]研究刺激隱核蟲幼蟲超微結(jié)構(gòu)時也發(fā)現(xiàn)此時僅有無法攝食的口器原基，無明顯口器結(jié)構(gòu)。由此推測，刺激隱核蟲幼蟲3～20 h 感染力逐漸減弱到喪失感染力，與幼蟲擺動纖毛尋找宿主過程中能量的不斷消耗有關(guān)，最終幼蟲能量枯竭而失去感染活性。本研究在不同時段的幼蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)變化特征與感染活性喪失過程相關(guān)聯(lián)，反映能量衰減可能是影響刺激隱核蟲幼蟲感染能力的主要原因。

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Electron microscopic observation of artificial infection of theront ofCryptocaryonirritansin vitro

SHEN Chen, ZHOU Min-xi, ZHOU Su-ming, WANG Guo-liang

(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Cryptocaryonirritanstheront stage development characteristics were examined by observation of scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). Tomont in each period collected from the diseasedPseudosciaenacrocea, and the strains were maintained in experimentally infectingPseudosciaenacroceafrom which the sample used for ultrastructural observation was collected. The result of observing different stages of theront off the tomont by electron microscope and light microscope showed: theront off the tomont after 0-4 h, ciliary body of the worm body was more dense and the cell structure was complete, swimming quickly in culture fluid; theront off the tomont after 8-16 h,Cryptocaryonirritanslarvae significantly reduced the long diameter and the number of its body cilia, with thin cytoplasm, swimming slowly; theront off the tomont after 20-24 h, the larvae body cilia was few. And the larvae were nonmoving, sinking to the bottom. Meanwhile, the cell shapes of teardrop changed into the irregular and begain apoptosis, the cell size in a serious recession significantly, with long diameter of only 10 μm around. In this study, the morphological and structural characterization changes of the larvae in different periods are associated with the process of the loss of infectivity, reflecting the main reason that the influences on infectivity ofCryptocaryonirritansis energy attenuation.

Cryptocaryonirritans; contagious; artificial infection; ultrastructure

2016-05-30；

2016-06-21

教育部長江學(xué)者與創(chuàng)新團(tuán)隊資助項目(IRTO734號)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項資助項目(200903029號)；浙江省海水養(yǎng)殖重點科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目(2010R50025-08號)

沈 晨,碩士研究生,水生動物病害方向,E-mail:1506012768@qq.com

王國良,教授,主要從事水生動物病害研究,E-mail:wangguoliang@nbu.edu.cn

S941.51

B

2095-1736(2017)02-0104-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.02.104