胥 冰, 王巧俠， 王小平, 藺煥萍, 馬曉軍, 張鵬飛, 趙 倩, 張克佩

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 免疫及檢驗(yàn)學(xué)教研室， 咸陽 712046； 2. 西安市中心醫(yī)院 感染科， 西安 710003)

熱休克蛋白70-甲胎蛋白抗原表位肽疫苗抗小鼠H22肝癌細(xì)胞免疫機(jī)制的研究

胥 冰1, 王巧俠2， 王小平1, 藺煥萍1, 馬曉軍1, 張鵬飛1, 趙 倩1, 張克佩1

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 免疫及檢驗(yàn)學(xué)教研室， 咸陽 712046； 2. 西安市中心醫(yī)院 感染科， 西安 710003)

分別以AFP多肽、HSP70 和HSP70-AFP多肽復(fù)合物免疫小鼠，檢測(cè)各組CD8+T細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B水平及CD8+T細(xì)胞對(duì)H22細(xì)胞的殺傷作用，探討熱休克蛋白70(HSP70)-甲胎蛋白(AFP)抗原表位肽復(fù)合物對(duì)小鼠H22肝癌細(xì)胞的免疫效應(yīng)。

甲胎蛋白 (AFP)；熱休克蛋白70( HSP70)；多肽疫苗；抗瘤免疫

肝癌治療主要采用放、化療及手術(shù)，但均因其副作用大，術(shù)后3年存活率低而達(dá)不到理想的療效。近年來以甲胎蛋白(AFP)為靶點(diǎn)的腫瘤疫苗的研發(fā)備受關(guān)注。AFP是腫瘤相關(guān)抗原，胚胎肝細(xì)胞的一種糖蛋白，胚胎期高表達(dá)，出生后低表達(dá)，當(dāng)肝細(xì)胞癌變后AFP表達(dá)升高[1]，70%的原發(fā)性肝癌病人可出現(xiàn)AFP高表達(dá)。研究表明甲胎蛋白存在不同的抗原表位，可為肝細(xì)胞癌的免疫治療提供解決問題的途徑[2-3]。但AFP在患者體內(nèi)不能有效地被遞呈從而激活免疫細(xì)胞，如何增強(qiáng)AFP的免疫原性，使免疫細(xì)胞能有效對(duì)其識(shí)別，才是解決問題的關(guān)鍵。應(yīng)用AFP核酸疫苗，基因重組AFP載體介導(dǎo)DC細(xì)胞免疫等[4-6]，依然不能有效增強(qiáng)AFP的免疫原性。另一簡便而有效的方法即應(yīng)用免疫佐劑，已證實(shí)熱休克蛋白70具有良好的“免疫佐劑”效應(yīng)，能與不同的腫瘤抗原肽結(jié)合誘發(fā)腫瘤特異性主動(dòng)免疫。尤其對(duì)于抗原弱或難以誘發(fā)免疫的抗原，HSP70呈現(xiàn)了良好的內(nèi)在免疫佐劑效應(yīng)[7-9]。本實(shí)驗(yàn)將AFP表位肽與佐劑HSP70結(jié)合形成重組疫苗免疫小鼠, 觀察荷瘤小鼠在重組疫苗誘導(dǎo)下產(chǎn)生針對(duì)AFP腫瘤，特異性細(xì)胞免疫的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

40只6～8周齡健康C57BL/6小鼠(雌性)，體質(zhì)量(20±2)g。由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(陜) 2007-001；小鼠H22肝癌細(xì)胞株購自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。MTT、純化熱休克蛋白70及淋巴細(xì)胞分離液(Sigma)；胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)液(Hyclone)；ELISA檢測(cè)試劑盒及免疫磁珠MicroBead CD8+T細(xì)胞分選抗(Miltenyi Biotec)；PHA(BD Biosciences)；Shanghai Ziyu Biotechnology 公司合成AFP表位肽-FMNKFIYEI 9個(gè)氨基酸寡肽，HSP70-AFP表位肽復(fù)合物則通過氨基酸偶聯(lián)法將熱休克蛋白70羧基端與AFP表位肽氨基端相連，高效液相色譜純化凍干粉，-20℃保存。超凈工作臺(tái)( 蘇州凈化)；RT-2100C型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(深圳雷杜科技有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(BindCD -150)；倒置顯微鏡(奧特BDS-200)；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器(日本三洋MLS-3780)；電子精密分析天平(塞多利斯)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及擴(kuò)增

于含10%胎牛血清及雙抗(100 U/青霉素、100 U/鏈霉素)的RPMI1640培養(yǎng)液中接種H22肝癌細(xì)胞，并于37℃，5% CO2飽和濕度擴(kuò)增培養(yǎng)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力備用。

1.2.2 腫瘤模型小鼠的建立及體內(nèi)腫瘤負(fù)荷實(shí)驗(yàn)

40只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為：HSP70-AFP多肽疫苗組、HSP70組、AFP組、模型組。將擴(kuò)增后的H22肝癌細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，密度為2×105/mL，接種于小鼠前肢右腋下，接種量為0.1 mL/只。3 d后，分別用生理鹽水將HSP70-AFP多肽疫苗、AFP、HSP70稀釋至1 μg /μL, 接種于小鼠右上肢腋下皮內(nèi)0.1 mL/只，相當(dāng)于10 μg/只劑量，于模型組同側(cè)注射等量無菌生理鹽水。首次免疫后，每隔1周等量、同法重復(fù)免疫1次，共3次。觀察小鼠生存及體內(nèi)腫瘤生長情況，每周3次測(cè)量實(shí)體瘤塊大小并取均值，按照公式:4/3πr3(r表示半徑)計(jì)算瘤塊體積。

1.2.3 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離

末次免疫后3 d處死全部小鼠，超凈工作臺(tái)取脾臟，滅菌生理鹽水沖洗2次，剪碎并用無菌勻漿器研磨，200目無菌濾網(wǎng)過濾得濾液1 mL，( Ficoll-Hypaque法)用淋巴細(xì)胞分離液分離得PBMC，備用。

1.2.4 CD8+T細(xì)胞分選純化-免疫磁珠分離法(MACS)

將各組PBMC計(jì)數(shù)，離心(1500 r/min,10 min)棄上清，每107細(xì)胞重懸于40 μL緩沖液中(PBS，含0.5%EDTA，0.5%小牛血清)，加10 μL CD8+T 細(xì)胞生物素標(biāo)記抗體混勻，5 min，4℃ 孵育，再將20 μL抗生物素磁珠加入其中混勻，4℃ 孵育10 min。將分離柱置分選器上，以3 mL無菌PBS緩沖液漂洗分離柱，用已被磁珠標(biāo)記的細(xì)胞懸液過柱；收集流出的未標(biāo)記細(xì)胞，備用。再以3 mL PBS緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流過液，其中即含所需CD8+T細(xì)胞[10-11]。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞純化率。

1.2.5 CD8+T細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)

經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞純度達(dá)90%以上，將細(xì)胞置10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)含PHA 5 μg/mL培養(yǎng)12 h, 37℃，5% CO2飽和濕度條件下繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)3 d，離心留上清，得沉淀細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL，備用。

1.2.6 檢測(cè)小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α、穿孔素、IFN-γ、顆粒酶水平(ELISA)

參照TNF-α、穿孔素等ELISA試劑盒說明操作，檢測(cè)上述離心上清液TNF-α、穿孔素、IFN-γ及顆粒酶的水平。

1.2.7 CD8+T淋巴細(xì)胞對(duì)H22肝癌細(xì)胞的殺傷作用

將擴(kuò)增72 h的H22肝癌細(xì)胞，調(diào)整密度為5×104個(gè)/mL，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種培養(yǎng)，100 μL/孔。24 h后離心培養(yǎng)板，1000 r/min ，10 min，棄上清，即靶細(xì)胞。將體外擴(kuò)增培養(yǎng)的CD8+T細(xì)胞，作為效應(yīng)細(xì)胞加入相應(yīng)的靶細(xì)胞孔中(效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞分別為10∶1、20∶1、40∶1)，每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT 液; 每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃孵育4 h。去除培養(yǎng)液，加DMSO 150 μL/孔，置振蕩器37℃振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶；酶標(biāo)儀測(cè)各孔光密度值(波長490 nm)。計(jì)算細(xì)胞存活百分率(實(shí)驗(yàn)組D490 nm平均值/對(duì)照組D490 nm平均值×100%)。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Student- Newm an-Keuls方法及方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)間比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體內(nèi)腫瘤負(fù)荷實(shí)驗(yàn)結(jié)果

于各組小鼠接種H22肝癌細(xì)胞后，觀察小鼠生存及體內(nèi)腫瘤生長情況。發(fā)現(xiàn)HSP70-AFP多肽疫苗組較其他組動(dòng)物食量好、活動(dòng)自如、毛色光澤度好。30 d后空白組全部死亡；AFP組死亡6只；HSP70組死亡8只；HSP70-AFP組死亡3只，其余存活。證明HSP70-AFP多肽疫苗組保護(hù)效應(yīng)較其他組明顯(P<0.01)，且該組瘤塊體積明顯偏小(P<0.01)，具體結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠接種H22細(xì)胞后瘤塊體積比較

a:P<0.01,vs empty group； b:P<0.01, vs AFP group； c:P>0.05,vs empty group； the same below

2.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞純度

磁珠分離所得CD8+T淋巴細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其純度高達(dá)90%，見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各免疫組小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞的純化

A:HSP70-AFP組純化的CD8+T 淋巴細(xì)胞; B: HSP70組純化的CD8+T 淋巴細(xì)胞; C: AFP組純化的CD8+T 淋巴細(xì)胞; D:空白組純化的CD8+T 淋巴細(xì)胞

2.3 小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ、TNF-α、穿孔素及顆粒酶B水平

HSP70-AFP多肽疫苗組小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B水平較其他組明顯升高, 具體結(jié)果見表2。

2.4 CD8+T淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞(H22)的殺傷作用

HSP70-AFP多肽疫苗組小鼠CD8+T細(xì)胞對(duì)小鼠H22肝癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)均高于其他各組(P<0.01), 見圖2。

表2 CD8+T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α、穿孔素、IFN-γ、顆粒酶B

GroupsHSP70-AFPHSP70AFPEmptyTNF-α470.35±14.25a,b178.35±8.15c177.56±7.98c164.31±9.46穿孔素235.47±17.38a,b121.62±7.53c124.25±6.27c115.65±9.75IFN-γ436.37±11.24a,b179.57±7.69c186.48±8.62c168.42±10.52顆粒酶B105.34±12.26a,b60.57±7.69c62.48±8.62c56.42±10.52

圖2 各免疫組小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞對(duì)小鼠H22肝癌細(xì)胞的毒性作用

Fig 2 Cytotoxicity effect of various mice splenic lymphocyte cells against mice hepatocellular carcinoma cell H22

效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞分別為10∶1、20∶1、40∶1

3 討論

腫瘤免疫治療具有高效性及毒副作用小等特點(diǎn)，并能啟動(dòng)或重啟獨(dú)立腫瘤免疫反應(yīng)，同時(shí)自身組織細(xì)胞不受損傷。AFP作為肝癌的相關(guān)性抗原能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，因此成為肝癌免疫治療的新靶點(diǎn)。因AFP在胚胎期生成，機(jī)體對(duì)其產(chǎn)生了一定的免疫耐受，無法啟動(dòng)強(qiáng)免疫應(yīng)答[12]。因此，本課題組前期熱休克蛋白(HSP)作為佐劑，應(yīng)用戊二醛交聯(lián)法構(gòu)建的HSP72-AFP復(fù)合物蛋白免疫小鼠，已證實(shí)不僅可增強(qiáng)AFP免疫原性，且針對(duì)AFP表達(dá)的腫瘤產(chǎn)生了較好的免疫效應(yīng)[13]。

此次用氨基酸偶聯(lián)法構(gòu)建HSP70-AFP多肽重組疫苗免疫小鼠, 證實(shí)了此法重組疫苗的免疫效果更好。與戊二醛偶聯(lián)法相比較，氨基酸偶聯(lián)法減少了因戊二醛偶聯(lián)對(duì)蛋白分子抗原表位的遮蓋和破壞，利于保持蛋白多肽的功能結(jié)構(gòu)，最大程度地保持表位肽的活性[14]，直接將抗原表位肽偶聯(lián)于HSP70，可促進(jìn)抗原的提呈，從而活化效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮殺瘤效應(yīng)[15]，研究結(jié)果也證實(shí)了氨基酸偶聯(lián)法構(gòu)建的HSP70-AFP表位肽疫苗相較戊二醛偶聯(lián)法，誘導(dǎo)了較強(qiáng)的免疫攻擊效應(yīng)，并活化CD8+T細(xì)胞而釋放了較高水平的細(xì)胞因子，體外淋巴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)重組蛋白疫苗對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞殺傷率達(dá)60%。Lan等[16]將AFP與HSP70在基因水平重組構(gòu)建真核表達(dá)載體，進(jìn)行在體小鼠的實(shí)驗(yàn)證實(shí)可誘導(dǎo)針對(duì)AFP表達(dá)腫瘤一定的免疫效應(yīng)，相較于氨基酸偶聯(lián)法，基因水平構(gòu)建的DNA疫苗表達(dá)量較少，產(chǎn)生的免疫效應(yīng)相對(duì)有限，結(jié)合基因疫苗的安全性，產(chǎn)物的穩(wěn)定性以及復(fù)雜的載體操作技術(shù)限制了基因疫苗的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。在本研究中應(yīng)用了簡便的氨基酸偶聯(lián)法構(gòu)建了蛋白多肽疫苗，此方法簡單，合成量多，產(chǎn)物穩(wěn)定，直接將HSP70和AFP抗原表位肽偶聯(lián)利于抗原的提呈和活化效應(yīng)細(xì)胞，體內(nèi)外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)了氨基酸偶聯(lián)法重構(gòu)HSP70-AFP表位肽疫苗能更有效地誘導(dǎo)特異性的CTL效應(yīng)攻擊肝癌細(xì)胞。

此外，體內(nèi)腫瘤負(fù)荷實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)重組疫苗組小鼠荷瘤發(fā)生率低，生存時(shí)間較其他組顯著延長，瘤塊體積偏小。通過對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α及穿孔素等細(xì)胞因子水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組疫苗組各指標(biāo)均明顯升高，研究報(bào)道經(jīng)DC活化的AFP特異性T淋巴細(xì)胞能上調(diào)多種細(xì)胞因子含量，如：IL-2、IFN-γ、TNF-α、顆粒酶和穿孔素等，而具有顯著的體內(nèi)外抗腫瘤免疫活性[17]，與本研究相佐證。本研究結(jié)果提示HSP70能有效地增強(qiáng)AFP的免疫原性,且經(jīng)多肽疫苗連續(xù)免疫小鼠后，其體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)AFP抗原的有效殺傷瘤細(xì)胞的保護(hù)性細(xì)胞免疫反應(yīng),，延長了荷瘤小鼠的生存時(shí)間，為腫瘤疫苗的前期臨床研究提供了重要的理論依據(jù)。

[1]SONG P, FENG X, INAGAKI Y, et al. Clinical utility of simultaneous measurement of alpha-fetoprotein and des-γ-carboxy prothrombin for diagnosis of patients with hepatocellular carcinoma in China: a multi-center case-controlled study of 1,153 subjects[J].Biosci Trends, 2014, 8(5):266-273.

[2]BUTTERFIELD L H, RIBAS A, POTTER D M, et al. Spontaneous and vaccine induced AFP-specific T cell phenotypes in subjects with AFP-positive hepatocellular cancer[J].Cancer Immunol Immunother, 2007, 56(12):1931-1943.

[3]EVDOKIMOVA V N, BUTTERFIELD L H. Alpha-fetoprotein and other tumour-associated antigens for immunotherapy of hepatocellular cancer[J].Expert Opin Biol Ther, 2008, 8(3):325-336.

[4]Cao D Y, Yang J Y, Dou K F, et al. Alpha-fetoprotein and interleukin-18 gene-modified dendritic cells effectively stimulate specific type-1 CD4- and CD8-mediated T-cell response from hepatocellular carcinoma patients in vitro[J]. Hum Immunol, 2007, 68(5):334-341.

[5]LAN Y H, LI Y G, LIANG Z W, et al. A DNA vaccine against chimeric AFP enhanced by HSP70 suppresses growth of hepatocellular carcinoma[J].Cancer Immunol Immunother, 2007, 56(7):1009-1016.

[6]RODR GUEZ M M, RYU S M, QIAN C, et al. Immunotherapy of murine hepatocellular carcinoma by alpha-fetoprotein DNA vaccination combined with adenovirus-mediated chemokine and cytokine expression[J].Hum Gene Ther, 2008, 19(7):753-759.

[7]BRAUNS T, LEBLANC P, GELFAND J A, et al. Could mycobacterialHsp70-containing fusion protein lead the way to an affordable therapeutic cancer vaccine? [J]. Expert Rev Vaccines, 2015, 14(3):435-446.

[8]HU H, QIU Y, GUO M, et al. Targeted Hsp70 expression combined with CIK-activated immune reconstruction synergistically exerts antitumor efficacy in patient-derived hepatocellular carcinoma xenograft mouse models[J]. Oncotarget, 2015, 6(2):1079-1089.

[9]MENG F D, SUI C G, TIAN X,et al. Heat shock protein 70 as a tumor antigen for in vitro dendritic cell pulsing in renal cell carcinoma cases[J].Asian Pac J Cancer Prev, 2014, 15(20):8947-8950.

[10]劉悅明，祝 軍，鄭司鵬，等.新疆地區(qū)健康成人外周血NK細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)的研究[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,35(6):763-767.

[11]朱利國,范 俊,浦洪波，等.基于磁性微球AFP時(shí)間分辨熒光免疫分析法的建立[J].標(biāo)記免疫分析與臨床,2016,23(1):83-86.

[12]趙 倩,王小平,胥 冰,等.甲胎蛋白與肝癌免疫的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志,2016,33(2):95-99.

[13]胥 冰,王小平,馬曉軍,等.熱休克蛋白 72-甲胎蛋白抗原表位肽復(fù)合物抗小鼠肝癌Hepal-6細(xì)胞免疫的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2014,22(11):2528-2531.

[14]劉 麗,汪巨峰,李 波.新型佐劑CPG ODN的研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志,2014,23(2):161-170.

[15]趙 德，喬 翠，張 強(qiáng)，等.表位疫苗研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012,33(1):102-106. [16]LAN Y H, LI Y G, LIANG Z W, et al. A DNA vaccine against chimeric AFP enhanced by HSP70 suppresses growth of hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Immunol Immunother,2007,56(7):1009-1016.

[17]劉 揚(yáng),王躍如,王 龍,等.甲胎蛋白特異性肝癌疫苗體內(nèi)殺傷肝癌細(xì)胞[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2014,31(1):77-80.

Study of anti-tumor immunity elicited by peptides complex- heat shock protein 70 and alpha-fetoprotein epitope peptide

XU Bing1, WANG Qiao-xia2, WANG Xiao-ping1, LIN Huan-ping1,MA Xiao-jun1, ZHANG Peng-fei1, ZHAO Qian1, ZHANG Ke-pei1

(1. Immunology and the Science of Inspection Teaching and Research Section, Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712046； 2. Department of Infectious Disease, Xi′an Central Hospital, Xi′an 710003, China)

To study anti-tumor immunity mechanism induced by a reconstructed peptide complex-heat shock protein 70 (HSP70) and alpha-fetoprotein (AFP), mice were immunized with recombinant peptide vaccine HSP70-AFP-P, whereas AFP peptide or HSP70 vaccination as controls. IFN-γ, TNF-α and granzyme-B, perforin-produced by separated CD8+T cells from vaccinated mice were detected with ELISA, respectively. In vivo tumor loaded test was exerted to evaluate the immune effect of the peptide vaccine. The study suggested that sequential immunization with HSP70-AFP peptide vaccine could bring about effective AFP-specific CD8+T cell responses and elicit specific antitumor immunity on AFP-producing tumors.

alpha-fetoprotein(AFP); heat shock protein 70 (HSP70); peptide vaccine; tumor immunity

2016-04-14；

2016-05-25

國家自然科學(xué)基金(No.81172135)；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(No.2016JM8023，2016JM8150)；陜西省教育廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目( No.07JK233，14JS025)

胥冰，碩士，副教授，主要從事分子免疫學(xué)研究工作,E-mail：xubing-95@163.com

王巧俠，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)疾病臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail: 894449620@qq.com； 王小平，博士，教授，碩士生導(dǎo)師, 主要從事腫瘤分子免疫病理學(xué)研究,E-mail:120145557@qq.com

R730.51

A

2095-1736(2017)02-0046-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.02.046