陳文筆， 徐繼林， 周成旭， 嚴(yán)小軍

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

基于脂質(zhì)組成的灘涂貝類優(yōu)質(zhì)餌料微藻篩選和應(yīng)用

陳文筆， 徐繼林， 周成旭， 嚴(yán)小軍

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

餌料微藻的種類和營養(yǎng)組成影響著貝類的營養(yǎng)、生理與繁殖。為了深入了解微藻餌料對雙殼貝類繁育的影響，建立了完整的針對微藻和貝類脂類結(jié)構(gòu)的高靈敏度、結(jié)構(gòu)信息高清晰的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，并以此為基礎(chǔ)建立了針對不同發(fā)育階段的不同貝類，選擇性投喂不同微藻餌料的苗種繁育模式；同時，通過從天然海域分離純化單細(xì)胞微藻，根據(jù)脂類營養(yǎng)成分分析并結(jié)合實(shí)際餌料效果，篩選出2種(3株)適宜貝苗不同階段攝食的新型高效餌料微藻，填補(bǔ)了貝類苗種培育行業(yè)陰雨季餌料供給的缺口，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)格稚貝餌料的高通量連續(xù)供給。

灘涂貝類; 餌料微藻; 脂質(zhì)營養(yǎng)；篩選；應(yīng)用

我國灘涂可養(yǎng)面積超過100萬hm2，灘涂貝類產(chǎn)量名列世界第一，年總產(chǎn)量已突破1000萬t，約占海水養(yǎng)殖總量的75%，是我國水產(chǎn)品的重要組成部分。但隨著沿海水域生態(tài)環(huán)境惡化，灘涂貝類天然苗種資源衰退嚴(yán)重，同時伴隨養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，貝類苗種的需求量也日益增大，90%以上貝類苗種必須源于人工培育。

灘涂貝類育苗成敗關(guān)鍵有兩點(diǎn)：水質(zhì)和餌料。水質(zhì)受到地理環(huán)境、氣候變化、經(jīng)濟(jì)生活的影響，人為調(diào)控能力弱；新鮮活體微藻餌料是雙殼類幼蟲和稚貝的最佳餌料[1]，雖然非活性餌料和人工配合飼料有所發(fā)展，但微藻仍是大部分貝類育苗場雙殼貝類養(yǎng)殖的唯一合適食物源[2]，而微藻餌料的選擇和培養(yǎng)全程人為可控。在貝類繁育的過程中，幼貝的淘汰率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成貝，故貝類的幼苗期成為貝類繁育的瓶頸階段。除了水質(zhì)條件的影響外，常規(guī)餌料面臨以下兩大挑戰(zhàn)：首先，2006年以前，我國貝類苗種大多來源于天然捕撈，早期人工育苗種類只有泥蚶(Tegillarcagranosa)單一品種。隨著近年來海域環(huán)境的日益惡化，絕大多數(shù)天然苗種匱乏，目前人工育苗的貝類品種已經(jīng)包括泥蚶、毛蚶(Scapharcasubcrenata)、縊蟶(Sinonovaculaconstricta)、硬殼蛤(Mercenariamercenaria)、彩虹明櫻蛤(Moerellairidescens)、越南白文蛤(Meretrixlyrata)、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、青蛤(Cyclinasinensis)、文蛤(Meretrixmeretrix)、厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)等幾乎所有的東南沿海常規(guī)養(yǎng)殖品種，貝類苗種繁育種類培育時間已經(jīng)覆蓋全年，但是不同品種的貝類育苗均使用相似的現(xiàn)有常規(guī)餌料微藻種類，而這些微藻營養(yǎng)無法完全適合所有幼貝正常發(fā)育，無法保證在雨季順利擴(kuò)繁并缺少高速擴(kuò)繁品種，難以滿足規(guī)模化大規(guī)格貝類苗種繁育需求。另外，我國海水養(yǎng)殖苗種培育行業(yè)已經(jīng)超過30年沒有推出過餌料微藻新種株，現(xiàn)有的餌料微藻種株適應(yīng)環(huán)境的能力越來越弱，實(shí)際培育過程中平臺期越來越短，很難滿足實(shí)際規(guī)模化育苗過程中龐大的微藻餌料需求量。急需篩選并儲備更多的營養(yǎng)全面或互補(bǔ)餌料微藻新種株，在實(shí)際生產(chǎn)中能夠在不同培養(yǎng)溫度條件、不同天氣或不同水質(zhì)狀況下，均能選擇到高繁殖速度且營養(yǎng)優(yōu)異的餌料微藻。為此，寧波大學(xué)海洋學(xué)院微藻餌料產(chǎn)業(yè)團(tuán)隊通過多年的努力，從天然海域分離純化單細(xì)胞微藻，根據(jù)脂類營養(yǎng)成分分析并結(jié)合實(shí)際餌料效果，篩選出2種(3株)適宜貝苗不同階段攝食的新型高效餌料微藻，填補(bǔ)了貝類苗種培育行業(yè)陰雨季餌料供給的缺口，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)格稚貝餌料的高通量連續(xù)供給，并已經(jīng)在灘涂貝類苗種培育行業(yè)得到規(guī)模化應(yīng)用。

1 餌料微藻脂質(zhì)營養(yǎng)學(xué)基礎(chǔ)研究

研究表明不同餌料微藻對不同灘涂貝類餌料營養(yǎng)效果不同[3]，Rivero-Rodríguez等發(fā)現(xiàn)不同微藻對貝類的餌料效果的差別跟微藻的碳水化合物、蛋白質(zhì)以及總脂含量沒有相關(guān)性，而認(rèn)為在稚貝階段需要適當(dāng)?shù)闹|(zhì)營養(yǎng)平衡[4]。所以，該研究主要關(guān)注微藻的脂質(zhì)營養(yǎng)組成對貝類幼苗生長的影響。

早期研究表明，微藻的脂肪酸和甾醇的組成直接決定微藻對貝類的餌料效果，所以，早在2004年，就利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)，建立了微藻中脂肪酸和甾醇的連續(xù)分析方法[5]；而由于游離脂肪酸對微藻正常的繁殖和對環(huán)境響應(yīng)有著重要的影響[6]，但微藻中游離脂肪酸含量往往很低，常規(guī)的脂肪酸分析方法滿足分析的靈敏度，故通過把游離脂肪酸樣品經(jīng)五氟苯甲基溴(PFBBr)衍生后進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析，建立海洋微藻體內(nèi)及其培養(yǎng)液中游離脂肪酸的更高靈敏度分析方法[7]。利用這些方法，在26種海洋微藻中共鑒定出40種脂肪酸，并通過對它們的聚類分析，分析結(jié)果與現(xiàn)行國際通用的海洋微藻的分類結(jié)果相吻合[8]；而通過對29種微藻甾醇的分布研究，共檢測到47種甾類化合物，鑒定出36種甾醇和一種甾酮，并根據(jù)甾醇結(jié)構(gòu)的不同，將海洋微藻中的甾醇分為4大類別，分別是4位無甲基5位不飽和甾醇、4位無甲基5位飽和的甾(烷)醇、4-甲基甾(烷)醇與含雙羥基的甾醇[9]。

由于在實(shí)際微藻體內(nèi)游離脂肪酸很少，絕大部分脂肪酸均以?；螒B(tài)存在于甘油酯和鞘脂中，故采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜 (UPLC-Q-TOF-MS) 技術(shù)，建立了完整的針對微藻脂類結(jié)構(gòu)的高靈敏度、結(jié)構(gòu)信息高清晰的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，得到了海洋微藻脂類組學(xué)水平上的定性定量信息。利用在國際上首次建立的海洋微藻中光合作用脂全面分析的方法，從1株硅藻中就可以鑒定出16種單半乳糖甘油二酯(MGDG)、9 種雙半乳糖甘油二酯(DGDG)、23種混合硫代異鼠李糖甘油二酯(SQDG)和8種磷脂酰甘油(PG)的精確結(jié)構(gòu)[10]；而通過建立的微藻中甘油磷脂的分析方法，在新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)中鑒定出18種脂質(zhì)成分，包括7種磷脂酰膽堿(PC)，2種磷脂酰乙醇胺(PE)，2種磷脂酰肌醇(PI)和7種磷脂(PG)[11]。針對微藻中甘油三酯的準(zhǔn)確識別，利用質(zhì)譜分析技術(shù)成功解決了液質(zhì)分析甘油三酯過程中共流出物的定性分析，可以更真實(shí)反映微藻中甘油三酯的分布組成[12]。而通過對微藻中鞘脂進(jìn)行詳細(xì)的組成分析，從3株骨條藻中鑒定出2種新型鞘脂，這種分析手段可成為微藻化學(xué)分類的又一可靠的輔助工具[13]。

在以上工作的基礎(chǔ)上，通過對基于實(shí)際脂類分子組成的餌料微藻全脂成分分析，發(fā)現(xiàn)不同餌料微藻的脂質(zhì)組成明顯不同[14]。雖然同一綱的微藻有著近似的脂肪酸組成，但是不同種微藻在實(shí)際脂類分子組成上也有著極大的差異[15]，即使是分離自不同地域的同一種微藻，其脂質(zhì)組成也會有明顯不同[16-17]，而哪怕是同一株微藻，在其不同培養(yǎng)階段，脂質(zhì)組成也會有明顯改變[18-19]。

食物的風(fēng)味會直接影響生物的攝食選擇，為進(jìn)一步研究貝類對微藻的選擇是否受到微藻脂類揮發(fā)性代謝物的影響，利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(SPME-GC-MS)聯(lián)用分析系統(tǒng),對包括威氏海鏈藻(Conticribraweissflogii)、新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)、角毛藻(Chaetoceroscalcitrans)、扁藻(Platymonashelgolandica)、微綠球藻(Nannochloropsissp.)和叉鞭金藻(Dicrateriainornata)在內(nèi)的6種不同微藻的揮發(fā)性組成進(jìn)行詳細(xì)測定，并通過主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn)，不同的微藻在不同生長階段的揮發(fā)性組分不一 ，不同培養(yǎng)階段的脂質(zhì)揮發(fā)性代謝物明顯改變，這些揮發(fā)性脂類代謝物在一定程度上可能會影響貝類的攝食選擇[20]。

以上餌料微藻脂質(zhì)組成研究為灘涂貝類餌料種類選擇、培養(yǎng)條件選擇及投喂階段選擇提供了營養(yǎng)學(xué)基礎(chǔ)和依據(jù)。

2 針對不同發(fā)育階段貝類的微藻餌料選擇

通過對不同貝類投喂不同種類的微藻發(fā)現(xiàn)，不同種類的微藻對不同貝類的餌料效果有著較大的差別[21]；同時研究發(fā)現(xiàn)，微藻種類會影響貝類的脂類組成，貝類攝取不同的微藻后脂類組成存在明顯差異[22]。所以通過對貝類稚貝混合投喂不同餌料微藻組合后，檢測稚貝中的脂類物質(zhì)并進(jìn)行PCA分析，結(jié)果表明混合投喂后的稚貝脂類組成，跟單獨(dú)投喂餌料效果優(yōu)異的微藻餌料的稚貝脂類組成在第一主成分方向上很接近，而與單獨(dú)投喂其他餌料效果較差的微藻餌料的稚貝脂類組成相差較大，說明在混合投喂過程中，稚貝會選擇性優(yōu)先攝食和同化餌料效果良好的微藻[23]。

在以上理論基礎(chǔ)上通過實(shí)際的餌料效果實(shí)驗(yàn)，總結(jié)了不同種類灘涂貝類在不同培養(yǎng)階段的餌料選擇：在浮游階段，所有貝類初始最適微藻均為金藻，從第2、3天開始，可以輔以投巴夫藻(Diacronemaviridis)，泥蚶和毛蚶從第4天開始，縊蟶、青蛤、毛蚶、彩虹明櫻蛤、菲律賓蛤仔、硬殼蛤從第3天開始可以投喂角毛藻、假微型海鏈藻。在浮游階段最好都以金藻為主，浮游中期投巴夫藻，到每種苗的浮游后期則均投以假微型海鏈藻和角毛藻為主。在稚貝前期階段，對泥蚶和毛蚶而言，最佳微藻餌料組合為角毛藻、假微型海鏈藻和金藻，輔以扁藻；對縊蟶則為假微型海鏈藻和角毛藻，輔以金藻；對青蛤、菲律賓蛤仔、硬殼蛤?yàn)榧傥⑿秃ｆ溤?、角毛藻和扁藻，輔以金藻；在稚貝后期階段，當(dāng)稚貝大于0.5 mm時，可以加投威氏海鏈藻。

除此之外，在灘涂貝類實(shí)際育苗過程中，需要注意幾個“選擇”：由于不同種類的微藻有著不同的最佳合適培養(yǎng)條件，需要根據(jù)在不同季節(jié)培養(yǎng)的貝類品種，選擇在該季節(jié)溫度下適宜培養(yǎng)且餌料效果優(yōu)異的餌料微藻進(jìn)行培養(yǎng)；也需要根據(jù)育苗場所水質(zhì)鹽度條件，選擇該鹽度條件下最適宜培養(yǎng)且餌料效果優(yōu)異的餌料微藻進(jìn)行培養(yǎng)；又由于微藻不同培養(yǎng)階段營養(yǎng)效果不一樣，就需要選擇微藻培養(yǎng)過程中營養(yǎng)效果最佳的階段進(jìn)行投喂。

3 基于餌料微藻營養(yǎng)學(xué)篩選出優(yōu)質(zhì)餌料微藻新種株

從東海露天圍塘和自然水域中分離純化出17種微藻純藻株(表1)，分別是隸屬于中心硅藻綱Coscinodiscophyceae的脆根管藻(Rhizosoleniafragilissima)、布氏雙尾藻(Ditylumbrightwellii)、中華盒形藻(Bidduphiasinensis)、佛氏海毛藻(Thalassiothrixfrauenfeldii)、威氏海鏈藻(Conticribraweissflogii)及假微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)；隸屬于針胞藻綱Raphidphyceae的赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)；隸屬于縱裂甲藻綱Desmophyceae的海洋原甲藻(Prorocentrummicans)和尖葉原甲藻(Prorocentrumtriestinum)；隸屬于甲藻綱Dinophyceae的錐狀斯克里普藻(Scrippsiellatrochoidea)、共生甲藻(SymbodiniumSymbodiniumsp.)、沃氏藻(Woloszynskiasp.)、米氏凱倫藻(KareniamikimotoiHasen)及裸甲藻(Gymnodiniumsp.)；隸屬于顆石藻綱Coccolithophyceae的顆石藻(Pleurochrysissp.)；隸屬于大眼藻綱Eustigmatophyceae一株微擬球藻(從福建云霄縣分離出，又稱“云微藻”(Nannochloropsissp.)和假微型海鏈藻9006(Thalassiosirapseudonana)。

表1 從東海海域分離出的17種微藻新種株總脂含量

表2 17種微藻的脂肪酸組成

對這17株新分離出的微藻種株進(jìn)行脂肪酸組成分析(表2)，可以發(fā)現(xiàn)，在所有微藻中，威氏海鏈藻9021、假微型海鏈藻9005和假微型海鏈藻9006的DHA和EPA的含量均相對較高，而由于微擬球藻(云微藻)不僅含有很高的EPA(29.2%)，同時也含有最高的AA組成(5.7%)，所以選擇這4株微藻進(jìn)行進(jìn)一步餌料效果研究。

縊蟶目前已經(jīng)成為我國最重要的經(jīng)濟(jì)貝類品種，故選擇縊蟶作為研究對象，研究以上新篩選出的4株篩選微藻和4株常用微藻角毛藻(Chaetoceroscalcitrans)、 金藻(Isochrysisgalbana)、扁藻(Platymonassubcordiformis)和微擬球藻(Nannochloropsisoculata)，對兩種規(guī)格的縊蟶稚貝(殼長分別為 0.37 mm和 1.07 mm)生長率和成活率的影響[24]。結(jié)果表明，單種投喂小規(guī)格稚貝時,投喂角毛藻和金藻的稚貝生長率和成活率最高而投喂扁藻、微擬球藻和威氏海鏈藻的最低；單種投喂大規(guī)格稚貝時，威氏海鏈藻體現(xiàn)了最佳的餌料營養(yǎng)價值而微擬球藻的營養(yǎng)價值最低?；旌贤段勾笠?guī)格稚貝時，8種微藻全混合的餌料顯示了最好的餌料營養(yǎng)價值，而且絕大多數(shù)兩兩混合的微藻餌料效果比對應(yīng)的單種微藻要好。另外，單種投喂威氏海鏈藻的大規(guī)格稚貝的生長率和成活率僅次于8種微藻全混合的卻要高于其他大多數(shù)投喂兩兩混合微藻的稚貝，可見大規(guī)格縊蟶稚貝與威氏海鏈藻表現(xiàn)出高度的營養(yǎng)匹配。

一株微藻能否應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中，除了其營養(yǎng)組成要符合貝類需求外，還需要在露天環(huán)境條件下容易擴(kuò)大繁殖，故對前期篩選所得的幾種微藻進(jìn)行培養(yǎng)環(huán)境因子研究。影響微藻繁殖的因素主要包括溫度、鹽度、光照和培養(yǎng)液的組成。實(shí)際生產(chǎn)中不同的溫度對應(yīng)著不同的季節(jié)培養(yǎng)，不同光照對應(yīng)著不同的天氣條件，鹽度不同則對應(yīng)不同鹽度水源。從實(shí)驗(yàn)室條件開始進(jìn)行餌料微藻的培養(yǎng)研究，主要選擇溫度、鹽度、光照、營養(yǎng)鹽組成等因子進(jìn)行單因子或多因子調(diào)控實(shí)驗(yàn)，確定了不同微藻最適繁殖的環(huán)境條件，分析了4種餌料微藻對應(yīng)的適宜環(huán)境條件(表3)。

表3 4種餌料微藻對應(yīng)的適宜環(huán)境條件

表3顯示，假微型海鏈藻9005和假微型海鏈藻9006在弱光下繁殖速度最快，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的弱光照條件下繁殖速度最快的品種，說明在一般的陰雨季節(jié)該藻也能正常繁殖，可以保證貝類苗種繁育季節(jié)在陰雨天也能獲得充足的餌料，而目前貝類苗種行業(yè)使用的角毛藻、扁藻和金藻等的最適宜光照強(qiáng)度均在4000 Lx以上，一旦碰到持續(xù)的陰雨天，會使得育苗生產(chǎn)中的餌料供給遭受嚴(yán)峻的考驗(yàn)。假微型海鏈藻的應(yīng)用，從根本上消除該制約因素，從而確保貝類苗種生產(chǎn)的穩(wěn)定性。

另外，以前常用耐高溫藻只有角毛藻，而從表3也可以看出，篩選出威氏海鏈藻9021，可以耐受超過30℃高溫，并且威氏海鏈藻9021藻個體較大，接種后適應(yīng)期較短，充氣條件下非常不容易衰敗，繁殖速度非?？?，一般晴天時只需要1 d，藻細(xì)胞就可以從10萬/mL 迅速繁殖到超過60萬/mL，如果投喂后留存1/5后再加水滿后，晴天條件下1 d就可很快繁殖到超過60萬/mL，同時假微型海鏈藻9006也可以耐受超過28 ℃的高溫，這就給夏季進(jìn)行貝類苗種培育提供了更多的餌料選擇。另外，威氏海鏈藻的高營養(yǎng)價值及極快的繁殖效率，給大規(guī)格貝類苗種培育過程中微藻餌料高通量連續(xù)供給提供了根本保障。

目前，威氏海鏈藻9021、假微型海鏈藻9005和假微型海鏈藻9006已經(jīng)于2015年由寧波大學(xué)免費(fèi)向全國貝類苗種行業(yè)提供，2016年已經(jīng)成為全國所有灘涂貝類苗種培育企業(yè)的當(dāng)家餌料品種，并也已經(jīng)應(yīng)用到蝦蟹苗種培育中，顯示出極佳的應(yīng)用前景。

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Screening and application of advanced microalgae diet for shellfish culture based on the lipid composition

CHEN Wen-bi， XU Ji-lin， ZHOU Chen-xu， YAN Xiao-jun

(School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Microalgal diet is the key factor in shellfish growth and breeding. To gain a thorough knowledge of the effect of microalgal diets on the growth of early life stages of bivalves, liquid chromatograph - mass spectrometer (LC-MS) analytical method about high-sensitivity and high-definition of structure information for microalgae and shellfish was established, and a breeding mode with selective feeding of different microalgae bait according to different shellfish at different development stages was also built. Many unicellular microalgae were isolated and purified from natural water. Eventually, two microalgal species (3 strains) with high efficient bait effects on shellfish juvenile at different stages were screened out based on the lipid composition and the actual effect of lipid nutrients bait, which filled the gap of feed supply for shellfish breeding in rainy season. Meanwhile, high-throughput and continuous supply of microalgal diets for larger juveniles had been realized.

shellfish; microalgal diets; lipid nutritional factor; screening; application

2016-07-11；

2017-02-20

國家自然科學(xué)基金(31172448); 教育部博士點(diǎn)基金優(yōu)先發(fā)展領(lǐng)域項目(20133305130001)；浙江自然科學(xué)基金項目(LY15C190004); 寧波市科技攻關(guān)項目(2014C10005)

陳文筆，碩士研究生，從事海洋生物化學(xué)研究，E-mail: 824683107@qq.com

徐繼林，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樵孱惿x、藻類與餌料生物資源及其利用等， E-mail: xujilin@nbu.edu.cn

Q949.2

A

2095-1736(2017)02-0016-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.02.016