黃文，談紅，王潞，晉群

(1武警山東省總隊(duì)醫(yī)院，濟(jì)南250014；2濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院)

內(nèi)皮功能損傷在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。引起內(nèi)皮功能損傷的因素眾多，其中內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是重要因素之一。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)抑制劑廣泛應(yīng)用于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(以下簡(jiǎn)稱冠心病)的治療，可改善患者的長(zhǎng)期預(yù)后。近年研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ1型受體阻斷劑(ARB)氯沙坦具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用，但其作用機(jī)制尚不完全明確。2016年3～7月，我們觀察了氯沙坦對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化模型粥樣斑塊內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，探討氯沙坦對(duì)粥樣斑塊內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及干預(yù)方法 14周齡雄性清潔級(jí)新西蘭大白兔25只，體質(zhì)量(2.2±0.2)kg，購(gòu)自濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心。將25只兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組5例、高膽固醇組10例、氯沙坦組10例。高膽固醇組、氯沙坦組均以高脂飼料(含1%膽固醇和0.5%豬板油)喂養(yǎng)，正常對(duì)照組以普通飼料喂養(yǎng)。氯沙坦組同時(shí)給予氯沙坦25 mg/(kg·d)灌胃，正常對(duì)照組和高膽固醇組給予同等劑量的生理鹽水灌胃。共干預(yù)16周。

1.2 主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)觀察 干預(yù)結(jié)束后處死各組兔，取主動(dòng)脈弓處1 mm3左右動(dòng)脈組織，2.5%戊二醛固定，制成超薄組織切片，采用JEM-1200EX透射電鏡觀察選取組織的超微結(jié)構(gòu)。

1.3 內(nèi)皮細(xì)胞增殖周期及凋亡檢測(cè) 于髂總動(dòng)脈分叉以上取2 cm主動(dòng)脈，仔細(xì)分離內(nèi)膜層，70%乙醇固定，充分研磨，過(guò)濾后1 500 r/min離心5 min，加入PI工作液0.5 mL，避光30 min。調(diào)整流式細(xì)胞儀，變異系數(shù)穩(wěn)定在2%以內(nèi)，收集2×104個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)完成后根據(jù)流式細(xì)胞圖分析細(xì)胞周期和凋亡率，以G0、G1期為細(xì)胞靜止期，S、(G2+M)期分別為細(xì)胞分裂前期和分裂期，以ModiFit軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4 動(dòng)脈壁內(nèi)c-myc蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取主動(dòng)脈組織，以c-myc鼠單克隆抗體進(jìn)行免疫組化染色，c-myc陽(yáng)性顆粒呈棕黃色，在細(xì)胞核和核漿中均有表達(dá)。在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察10個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比，取其平均值。采取半定量記分，表達(dá)陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>75%為4分。

1.5 動(dòng)脈壁內(nèi)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspases-3) mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。取-80 ℃保存的動(dòng)脈壁組織，TRIzol法提取總RNA。引物序列：5′-TTTGTTTGTGTGCTTCTTCTGAGGCC-3′，5′-ATTCTGTTGCCACCTTTCGG-3′。擴(kuò)增條件：94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH做為內(nèi)參照，Caspases-3與GAPDH擴(kuò)增條帶的光密度比值作為Caspases-3相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)；以Ridit檢驗(yàn)計(jì)算半定量資料平均Ridit值(Ri)和95%可信區(qū)間(95%CI)，組間Ri比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化 正常對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平梭形，核較小，核周的胞質(zhì)較豐富，含有高爾基復(fù)合體、中心體、多胞體和溶酶體等。高膽固醇組內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高，細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)破壞、斷裂甚至發(fā)生變性和脫落，核濃縮，染色質(zhì)濃縮，胞核體積縮小，可見(jiàn)凋亡小體。氯沙坦組內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯改善，未見(jiàn)凋亡小體形成。

2.2 各組內(nèi)皮細(xì)胞增殖周期比例及細(xì)胞凋亡率比較 正常對(duì)照組、氯沙坦組細(xì)胞均以靜止期為主，而高膽固醇組細(xì)胞以分裂前期及分裂期為主。由于細(xì)胞增殖周期各組標(biāo)準(zhǔn)差較大，各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常對(duì)照組及氯沙坦組細(xì)胞凋亡率均低于高膽固醇組(P均<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖周期比例及細(xì)胞凋亡率比較

注：與高膽固醇組比較，*P<0.05。

2.3 各組動(dòng)脈壁內(nèi)c-myc蛋白表達(dá)比較 正常對(duì)照組、高膽固醇組、氯沙坦組c-myc陽(yáng)性表達(dá)半定量評(píng)分分別為1.000、3.143、1.500，Ri分別為0.19、0.73、0.39，95%CI分別為-0.11～0.49、0.52～0.94、0.15～0.63，高膽固醇組c-myc表達(dá)高于正常對(duì)照組，氯沙坦組c-myc表達(dá)低于高膽固醇組(P均<0.05)。

2.4 各組動(dòng)脈組織Caspeses-3 mRNA表達(dá)比較 正常對(duì)照組、高膽固醇組、氯沙坦組高膽固醇組動(dòng)脈組織Caspeses-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.51±0.14、2.44±1.13、1.48±0.52，高膽固醇組動(dòng)脈組織Caspeses-3 mRNA表達(dá)高于正常對(duì)照組(P<0.01)，氯沙坦組動(dòng)脈組織Caspeses-3 mRNA表達(dá)低于高膽固醇組(P<0.01)。

3 討論

內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的早期階段，也是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素，同時(shí)也是發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的必備條件。近年來(lái)，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中細(xì)胞凋亡的作用引起關(guān)注。粥樣斑塊的消退與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[1]。Gonzalez等[2]研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞凋亡在粥樣斑塊發(fā)展、斑塊內(nèi)壞死核心產(chǎn)生和易損斑塊形成中起到重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可通過(guò)影響內(nèi)皮損傷修復(fù)功能、導(dǎo)致血管舒縮功能障礙[3]、增加斑塊不穩(wěn)定性、促進(jìn)血栓形成和急性冠脈事件的發(fā)生[4]，從而參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。近年研究表明，RAAS可通過(guò)一系列作用機(jī)制，與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，如促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制其凋亡、引起內(nèi)皮功能失調(diào)、誘導(dǎo)癌基因表達(dá)、抑制纖溶、與激肽系統(tǒng)相互作用等。因此，RAAS與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系已成為新的研究熱點(diǎn)[5]。

氯沙坦作為血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑，早先作為抗高血壓類藥物廣泛應(yīng)用于臨床，近年研究發(fā)現(xiàn)，除降壓作用以外，氯沙坦還可以改善心室重構(gòu)、改善內(nèi)皮功能，進(jìn)而改善冠心病患者的長(zhǎng)期預(yù)后，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究[6]。Derosa等[7]研究發(fā)現(xiàn)，氯沙坦聯(lián)合應(yīng)用鈣離子拮抗劑可顯著改善糖尿病和高血壓患者的內(nèi)皮損傷和氧化應(yīng)激。Zhu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠給予氯沙坦治療后，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)更加平滑完整，內(nèi)皮損傷得到改善。本研究發(fā)現(xiàn)，與高膽固醇組比較，氯沙坦組的內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯改善，未見(jiàn)凋亡小體形成，靜止期細(xì)胞比例增加、分裂前期及分裂期細(xì)胞比例減少，細(xì)胞凋亡率降低，提示氯沙坦可抑制動(dòng)脈粥樣硬化兔的主動(dòng)脈粥樣斑塊凋亡，表明氯沙坦可能通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡而延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。

Caspases蛋白酶是一組半胱氨酸蛋白酶家族，具有蛋白酶的生物學(xué)特性。人類Caspases基因有12種，多數(shù)與凋亡有關(guān)[9]，其中Caspases-3參與凋亡過(guò)程的終末期，在凋亡病理過(guò)程中起到重要作用。Hachani等[10]以高膽固醇飲食誘發(fā)去交感神經(jīng)大鼠動(dòng)脈壁內(nèi)細(xì)胞的凋亡，檢測(cè)到Caspases基因的表達(dá)顯著增加。Lloyd給予人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞以氧化應(yīng)激刺激，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡呈現(xiàn)Caspases依賴性，包括Caspases-3、7，說(shuō)明Caspases途徑在凋亡發(fā)生機(jī)制中的重要調(diào)節(jié)作用[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)缺氧導(dǎo)致的成人心肌細(xì)胞凋亡有Caspases基因的參與[12]，應(yīng)用Caspases 抑制劑可減少缺血及再灌注損傷[13]，同時(shí)Caspases-3還可以調(diào)控心肌病心衰患者的心肌細(xì)胞凋亡[14]?？傊珻aspases 與心血管疾病相關(guān)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，氯沙坦組動(dòng)脈組織Caspeses-3 mRNA表達(dá)低于高膽固醇組，提示氯沙坦可顯著抑制動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)Caspeses-3 mRNA的表達(dá)，可能參與抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的過(guò)程，從而延緩動(dòng)脈粥硬化的發(fā)生發(fā)展。

c-myc蛋白為核內(nèi)結(jié)合蛋白，具有細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用。c-myc蛋白被激活時(shí)，可結(jié)合到基因組中特定的調(diào)控序列，進(jìn)一步激活與細(xì)胞增殖和分化有關(guān)的基因，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡。在球囊損傷引起的大鼠平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)膜增生中存在c-myc表達(dá)的增加[15]，虎杖苷通過(guò)激活eNOS/SIRT1途徑，抑制c-myc表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖[16]。Inafuku等[17]研究了日本鵪鶉主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因和蛋白，發(fā)現(xiàn)c-myc mRNA的表達(dá)顯著增加。因此，c-myc是細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)的重要蛋白之一。本研究發(fā)現(xiàn)，氯沙坦組動(dòng)脈組織c-myc蛋白表達(dá)低于高膽固醇組，提示氯沙坦可顯著抑制動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)c-myc蛋白的表達(dá)，可能參與抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的過(guò)程，從而延緩動(dòng)脈粥硬化的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，氯沙坦可顯著抑制動(dòng)脈粥樣斑塊形成，其作用機(jī)制可能與下調(diào)c-myc、Caspases-3表達(dá)，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡密切有關(guān)。