姚血明，梁爽，馬武開，寧喬怡，鐘琴，侯雷，黃穎，唐芳

(1貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴陽550001；2天津市海河醫(yī)院)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見的炎性關(guān)節(jié)病，常表現(xiàn)為全身對稱性、持久性多關(guān)節(jié)炎，其病因及發(fā)病機制尚不清楚[1]。RA的常用治療藥物包括非甾體類抗炎藥(NSAIDs)、改善病情抗風(fēng)濕藥(DMARDs)、生物制劑、糖皮質(zhì)激素等，其中DMARDs治療是控制RA病情進(jìn)展、延緩關(guān)節(jié)破壞進(jìn)程的關(guān)鍵。甲氨蝶呤(MTX)屬于DMARDs，因服藥簡便、價格低廉、不良反應(yīng)發(fā)生率低、無遠(yuǎn)期致癌作用等特點，被作為RA治療的首選用藥廣泛應(yīng)用于臨床。但臨床治療發(fā)現(xiàn)，約50%的RA患者在使用MTX后療效不佳或復(fù)發(fā)后再次用藥不敏感，提示存在MTX耐藥。多藥耐藥(MDR)最初在腫瘤領(lǐng)域被發(fā)現(xiàn)，目前多項研究證實核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)參與介導(dǎo)了MDR[2～4]，但對其在RA治療中發(fā)生MDR的原因卻尚不明確。近期研究[5]顯示，MDR1基因的突變或者其表達(dá)水平的改變會通過影響P糖蛋白(P-gp)進(jìn)而改變患者對藥物的反應(yīng)性，導(dǎo)致RA患者耐藥，該反應(yīng)是否與NF-κB信號通路相關(guān)，尚未得到證實。2015年1～12月，我們檢測了120例RA患者發(fā)生MTX耐藥后MDR1及NF-κB通路的表達(dá)變化，探討NF-κB信號通路在RA患者M(jìn)TX耐藥形成機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1～12月在我院住院及門診治療的RA患者120例，均符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟中對RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～70歲；符合RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且28個關(guān)節(jié)疾病活動度(DAS28，包括雙肩、肘、腕、掌指、近端指間、膝關(guān)節(jié))>3.2；未伴有其他影響治療和檢測指標(biāo)的疾??；單獨服用MTX，未聯(lián)用其他DMARDs或糖皮質(zhì)激素；愿接受檢查治療者，并簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：未按規(guī)定用藥者；中途退出或資料不全，無法判斷療效，或因其他原因影響療效及安全性評價者；不能合作者。選擇我院未患有冠心病、糖尿病等慢性疾病，且血常規(guī)、肝腎功能、自身抗體檢測均正常的體檢健康人員20例作為正常對照組，男6例、女14例，年齡(43.70±10.10)歲。

1.2 治療及分組方法 RA患者均給予MTX規(guī)范治療，第1周1次口服MTX 10 mg，1次/周，每周遞增2.5 mg，至15 mg維持。治療12周后評價DAS28，如DAS28≤3.2者，納入MTX敏感組；DAS28>3.2者，繼續(xù)服藥1次/周，每周遞增2.5 mg，至20 mg維持，共服藥24周后評價。其中DAS28≤3.2者，納入MTX敏感組，DAS28評分仍>3.2者，納入MTX耐藥組。共納入MTX敏感組67例、MTX耐藥組53例，其中MTX敏感組男12例、女55例，年齡(42.71±7.89)歲，病程(14.85±5.30)年；MTX耐藥組男11例、女42例，年齡(43.50±10.10)歲，病程(13.13±5.10)年。三組間年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義，MTX敏感組、MTX耐藥組間病程差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

1.3 血清NF-κB、抑制蛋白IκBα(IκBα)、TNF-α及IL-1β水平檢測 MTX敏感組、MTX耐藥組于服用MTX后第3日清晨空腹抽取肘靜脈血，正常對照組采集清晨空腹肘靜脈血，采用ELISA法檢測各組血清NF-κB、IκBα、TNF-α及IL-1β水平。

1.4 外周血淋巴細(xì)胞(PBMCs)中MDR1、TNF-α及IL-1β mRNA表達(dá)檢測 MTX敏感組、MTX耐藥組于服用MTX后第3日清晨空腹抽取肘靜脈血，采用熒光PCR法，提取RNA后，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，配置反應(yīng)體系，每個樣本設(shè)兩個復(fù)孔，反應(yīng)條件為95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共40個循環(huán)，用7500 Real-time PCR儀及自帶軟件進(jìn)行分析。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對含量。

1.5 PBMCS中P-gp表達(dá)及功能檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測P-gp表達(dá)，采用羅丹明123(Rh123)間接法檢測P-gp功能[7]。MTX敏感組、MTX耐藥組于服用MTX后第3日清晨空腹抽取肘靜脈血，正常對照組采集清晨空腹肘靜脈血，以流式細(xì)胞儀檢測到的細(xì)胞內(nèi)Rh123熒光強度代表Rh123的蓄積量，作為反映P-gp功能的指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 各組血清NF-κB、IκBα、TNF-α及IL-1β水平比較 MTX敏感組及MTX耐藥組血清NF-κB、TNF-α、IL-1β水平均高于正常對照組，IκBα水平均低于正常對照組(P均<0.05)；MTX耐藥組血清NF-κB、TNF-α、IL-1β水平均高于MTX敏感組，IκBα水平低于MTX敏感組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組血清NF-κB、IκBα、TNF-α及IL-1β水平比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與MTX敏感組比較，#P<0.05。

2.2 MTX敏感組及MTX耐藥組MDR1、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)比較 MTX耐藥組MDR1、TNF-α及IL-1β mRNA表達(dá)均高于MTX敏感組(P均<0.05)。見表2。

表2 MTX敏感組及MTX耐藥組MDR1、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)比較

注：與MTX敏感組比較，*P<0.05。

2.3 各組PBMCs中P-gp表達(dá)及功能比較 MTX敏感組及MTX耐藥組P-gp熒光值均高于正常對照組，Rh123熒光值均低于正常對照組(P均<0.05)。MTX耐藥組P-gp熒光值高于MTX敏感組，Rh123熒光值低于MTX敏感組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組PBMCs中P-gp、Rh123熒光值表達(dá)比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與MTX敏感組比較，#P<0.05。

3 討論

RA是一種慢性進(jìn)行性自身免疫性疾病，因醫(yī)療費用高和關(guān)節(jié)致殘喪失勞動，給社會造成沉重經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，影響全球0.5%～1%的人口[1,8]。目前，MTX作為治療RA的首選藥物，已廣泛應(yīng)用于臨床。MTX通過抑制二氫葉酸還原酶，從而阻礙DNA的合成而發(fā)揮作用，其抗RA的機制尚不清楚，可能與抑制免疫反應(yīng)及抗炎作用有關(guān)。雖然MTX作為抗風(fēng)濕治療的一線用藥可以減輕關(guān)節(jié)癥狀、控制滑膜炎癥、延緩病情進(jìn)展，從而使患者病情得到有效控制，但仍有近一半患者在使用MTX后療效不佳或復(fù)發(fā)后再次用藥不敏感。荷蘭的一項研究[9]報告顯示，RA患者用MTX治療失敗后，采用常規(guī)的DMARDs治療也無效。循證醫(yī)學(xué)證據(jù)顯示，對比MTX單藥治療失敗的RA患者，MTX聯(lián)合治療也沒有顯著優(yōu)勢[10]。因此，MTX治療失敗的RA患者可能存在類似于腫瘤患者的MDR問題。由于RA患者需長期服藥，保持MTX的藥物效果具有重要意義，雖然單純通過增加藥物劑量可能提高療效，但勢必會增加其不良反應(yīng)。因此，對RA患者M(jìn)TX耐藥的機制尚需進(jìn)行深入研究。

在有關(guān)MDR機制的研究中，對于MDR基因的研究是最多的。人類MDR基因族主要由MDR1、MDR2組成，前者的作用是參與抗腫瘤藥物的轉(zhuǎn)運，在耐藥中起主導(dǎo)作用，后者主要參與磷脂的轉(zhuǎn)運。MDR1基因位于7號染色體長臂2區(qū)1帶1亞帶上，其大小約210 kb，包含29個外顯子，是較早發(fā)現(xiàn)的MOR基因。MDR1 的表達(dá)除受Y盒結(jié)合蛋白-1(YB-1)影響外，還受 NF-κB、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、細(xì)胞色素P450酶3A4(CYP3A4)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)等多種物質(zhì)、信號通路的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在MDR1基因啟動子區(qū)存在NF-κB作用的結(jié)合位點，考慮MDR1可能是NF-κB 的下游基因[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn)，MTX耐藥組MDR1 mRNA表達(dá)高于MTX敏感組，提示發(fā)生MTX耐藥的RA患者M(jìn)DR1 mRNA表達(dá)增高，MDR1基因的表達(dá)與RA患者M(jìn)TX耐藥相關(guān)[5]。

MDR1編碼的P-gp在MTX的外排機制中具有重要地位，P-gp可通過兩個核苷酸結(jié)合位點水解ATP獲得的能量，將有毒性的親脂性藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出到細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低而產(chǎn)生耐藥。P-gp對藥物的特異性很小，能夠運輸多種結(jié)構(gòu)不同的底物，因此發(fā)生MDR的細(xì)胞能對許多結(jié)構(gòu)和作用機制不同的藥物產(chǎn)生耐藥。Tsujimura等[13]研究發(fā)現(xiàn)，人PBMCS上P-gp過度表達(dá)可引起DMARDs和糖皮質(zhì)激素的藥物外排，進(jìn)而導(dǎo)致RA患者產(chǎn)生MDR。本研究發(fā)現(xiàn)，MTX敏感組及耐藥組P-gp熒光值均高于正常對照組，MTX耐藥組P-gp熒光值高于MTX敏感組，提示RA患者P-gp的表達(dá)高于正常人群，且發(fā)生MTX耐藥的RA患者P-gp的表達(dá)高于MTX敏感患者；MTX敏感組及耐藥組Rh123熒光值均低于正常對照組，MTX耐藥組Rh123熒光值低于MTX敏感組，提示RA患者的P-gp功能高于正常人群，且發(fā)生MTX耐藥的RA患者P-gp功能高于MTX敏感患者，表明P-gp表達(dá)和功能影響了RA患者對MTX的療效，參與了RA的MOR。

既往研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路的激活與腫瘤治療中的MDR現(xiàn)象密切相關(guān)[2～4]。NF-κB是一種分布廣泛的核轉(zhuǎn)錄因子，由Rel家族中的成員以同源或異源二聚體的形式存在，參與機體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等。一般NF-κB與IκB結(jié)合以無生物學(xué)活性的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，經(jīng)過一系列級聯(lián)反應(yīng)IκB磷酸化、NF-κB發(fā)生核易位，活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與κB位點結(jié)合，誘導(dǎo)NF-κB調(diào)控MDR1的表達(dá)[14]。NF-κB激活后可使MDR1/P-gp表達(dá)升高，促進(jìn)MTX外排，導(dǎo)致耐藥，耐藥的產(chǎn)生又使疾病惡化，炎癥活動度增加，造成惡性循環(huán)。另一方面，活化的NF-κB調(diào)節(jié)多種炎癥基因的表達(dá)，如TNF-α、IL-1β等，而TNF-α、IL-1β又可以通過一系列級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)NF-κB的活化，形成正反饋機制。研究證實，RA患者的滑膜中有著NF-κB的大量表達(dá)，而NF-κB的下游炎癥因子TNF-α、IL-1β也與RA骨破壞密切相關(guān)[15,16]。TNF-α主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種多效應(yīng)性細(xì)胞因子，不僅可以刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶及前列素E2，誘導(dǎo)骨吸收，還可以體外抑制骨形成，導(dǎo)致骨骼的破壞[17]。IL-1β同TNF-α有著相似的功能及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，MTX敏感組及MTX耐藥組血清NF-κB、TNF-α、IL-1β水平均高于正常對照組，IκBα水平均低于正常對照組，提示RA患者體內(nèi)IκBα大量被降解，導(dǎo)致NF-κB激活釋放，下游炎癥因子TNF-α、IL-1β釋放增加；MTX耐藥組血清NF-κB、TNF-α、IL-1β水平及mRNA均高于MTX敏感組，IκBα水平低于MTX敏感組，提示對MTX耐藥的RA患者NF-κB進(jìn)一步激活，TNF-α、IL-1β釋放明顯增加，隨著大量炎癥因子的不斷堆積，MTX控制疾病的效果降低，難以控制疾??；IκBα在炎癥因子的不斷刺激下被降解，NF-κB不斷激活，通過NF-κB信號通路傳導(dǎo)使MDR1、P-gp表達(dá)升高，MTX在細(xì)胞內(nèi)濃度降低，導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。

綜上所述，RA患者M(jìn)TX耐藥的產(chǎn)生可能與NF-κB信號通路的激活有關(guān)，一方面使MDR1、P-gp表達(dá)增加，促進(jìn)MTX外排；另一方面可通過促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1β的釋放，形成正反饋機制，可能是介導(dǎo)MTX的耐藥產(chǎn)生的機制之一。