丁婕妤，王璇，翁苓苓，李琦，張閩光，邢東煒

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海200071；2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院)

原發(fā)性肝癌(以下簡稱肝癌)是一種發(fā)病率高，發(fā)生、發(fā)展復(fù)雜的惡性腫瘤，病死率僅次于肺癌和胃癌[1,2]。我國的肝癌患者大多數(shù)由肝炎、肝硬化演變而來，肝纖維化使得肝臟整體缺乏供血，加之肝癌細(xì)胞的快速增殖特性，造成了肝癌組織的局部低氧微環(huán)境生物學(xué)特征。近年研究發(fā)現(xiàn)，低氧微環(huán)境與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，是導(dǎo)致腫瘤治療失敗和預(yù)后不良的原因之一。肝癌在低氧條件下可出現(xiàn)適應(yīng)性反應(yīng)，誘導(dǎo)許多適應(yīng)性反應(yīng)因子的生成，促進(jìn)血管新生、腫瘤生長。因此，探討低氧條件下治療肝癌的方法，對于肝癌的臨床治療及預(yù)后具有重要意義。天冬是我國傳統(tǒng)的中草藥，《中醫(yī)藥典》認(rèn)為天冬甘、苦、寒，主治咽干口渴、腸燥便秘等。天冬多糖是天冬提取物中的主要成分之一，具有提高免疫力、改善肝功能等作用[3,4]。研究發(fā)現(xiàn)，天冬多糖在體外可抑制肝癌細(xì)胞生長，在體內(nèi)可延長荷瘤動物的存活期[5～8]。但天冬多糖對低氧條件下肝癌的抑制作用及機(jī)制尚不明確。2015年6月～2016年2月，我們觀察了天冬多糖對低氧條件下人肝癌細(xì)胞生長及侵襲遷移能力的影響，為進(jìn)一步研究天冬多糖的抗腫瘤作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 人肝癌細(xì)胞系 HepG2細(xì)胞(上海中科院細(xì)胞所)。天冬多糖(西安斯諾特公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；雙抗(青霉素-鏈霉素)(美國Gibco公司)；胰酶(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)；Transwell 小室(美國康寧公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104～8×104/mL，然后用移液器以100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，加入等體積PBS。待細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)基。

1.3 天冬多糖對低氧條件下HepG2細(xì)胞的生長抑制作用觀察 采用CCK-8法。細(xì)胞培養(yǎng)后，在96孔培養(yǎng)板中，分別加入天冬多糖500、1 000、1 500、2 000、3 000、4 000 μg/mL，另設(shè)空白對照孔加入生理鹽水。每個劑量設(shè)6個復(fù)孔，放入低氧培養(yǎng)箱(95%N2，5%CO2，1%O2)繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時，將96孔板轉(zhuǎn)移至超凈工作臺中，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入CCK，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后取出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放入酶標(biāo)儀中，波長設(shè)定為450 nm，檢測各孔吸光度(OD)值。以對照孔平均值調(diào)零，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率及抑制率：細(xì)胞存活率(%)=各濃度天冬多糖孔OD值/空白對照孔OD值×100%。生長抑制率(%)=1-細(xì)胞存活率。半數(shù)抑制濃度(IC50)為細(xì)胞存活率達(dá)到一半時的藥物作用濃度，非毒性劑量(IC20、IC10)為細(xì)胞存活率分別達(dá)到80 %、90 %時的藥物作用濃度。

1.4 細(xì)胞分組及干預(yù)方法 超凈臺內(nèi)，消化貼壁細(xì)胞，按照計(jì)算出的天冬多糖IC50(2 480 μg/mL)、IC20(992 μg/mL)、IC10(496 μg/mL)分別作為高、中、低濃度干預(yù)HepG2細(xì)胞，作為天冬多糖高濃度組、天冬多糖中濃度組、天冬多糖低濃度組，空白對照組不干預(yù)。均用完全培養(yǎng)基配制成 2×104/mL的細(xì)胞液。在低氧培養(yǎng)箱(95%N2，5%CO2，1%O2)中培養(yǎng)24 h。

1.5 HepG2細(xì)胞遷移能力檢測 采用Transwell法。將各組細(xì)胞加入 Transwell小室的上室，每孔150 μL。制備含10 μg/mL Fibronectin和15%血清的培養(yǎng)液，加入Transwell 小室的下室，每孔600 μL，放于培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出Transwell小室，泡入4%多聚甲醛中10 min，10%結(jié)晶紫30 min。用濕潤的衛(wèi)生棉棒輕輕抹去膜上面的細(xì)胞，將小室倒置。顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)穿過Transwell小室PVPF膜的細(xì)胞個數(shù)，以穿過的細(xì)胞數(shù)評價遷移能力。

1.6 HepG2細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell法。超凈臺內(nèi)，將Matrigel 基質(zhì)膠(提前用DMEM培養(yǎng)基稀釋至一定濃度)，加入Transwell小室的上室(每室50 μL)，過夜風(fēng)干；次日，超凈臺內(nèi)，將培養(yǎng)液加入小室，每孔100 μL，室溫靜置 90 min，而后棄上清液，完全去除 Martigel；消化貼壁細(xì)胞，將各組細(xì)胞加入Transwell小室的上室，每孔150 μL。制備含10 μg/mL Fibronectin和15%血清的培養(yǎng)液，加入Transwell小室的下室，每孔600 μL，放于培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出Transwell小室，泡入4%多聚甲醛中10 min，10%結(jié)晶紫30 min。用濕潤的衛(wèi)生棉棒，輕輕抹去膜上面的細(xì)胞，將小室倒置。顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)穿過Transwell小室PVPF膜的細(xì)胞個數(shù)，以穿過的細(xì)胞數(shù)評價侵襲能力。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度天冬多糖對低氧條件下HepG2細(xì)胞的生長抑制作用 不同濃度、不同作用時間的天冬多糖對HepG2細(xì)胞均有明顯的生長抑制作用。細(xì)胞生長抑制率與天冬多糖濃度呈正相關(guān)(r=0.980，P<0.05)，隨著天冬多糖的濃度升高，HepG2細(xì)胞的生長抑制率增加，具有劑量依賴性。見表1。

表1 不同濃度天冬多糖對低氧條件下HepG2細(xì)胞的生長抑制作用

2.2 各組細(xì)胞侵襲能力比較 空白對照組、天冬多糖低濃度組、天冬多糖中濃度組、天冬多糖高濃度組分別有(196±5)、(91±6)、(64±7)、(40±4)個細(xì)胞穿過Transwell小室PVPF膜，天冬多糖低濃度組、天冬多糖中濃度組、天冬多糖高濃度組的侵襲細(xì)胞數(shù)均低于空白對照組(P均<0.01)。見圖1。

圖1 不同濃度天冬多糖對低氧下HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響(Transwell法，×200)

2.3 各組細(xì)胞遷移能力比較 空白對照組、天冬多糖低濃度組、天冬多糖中濃度組、天冬多糖高濃度組分別有(182±4)、(96±7)、(72±5)、(37±3)個細(xì)胞穿過Transwell小室PVPF膜，天冬多糖低濃度組、天冬多糖中濃度組、天冬多糖高濃度組的遷移細(xì)胞數(shù)均低于空白對照組(P均<0.01)。見圖2。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有65萬人死于肝癌，其中我國原發(fā)性肝癌患者死亡人數(shù)約占全球的50%以上。雖然已有多種方法治療肝癌，但肝癌的預(yù)后較差，患者動脈化療栓塞(TACE)術(shù)后5年生存率僅為10%左右[9]，其中的一個重要原因是腫瘤血管生成，導(dǎo)致腫瘤向其他臟器的侵襲轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)體瘤可通過細(xì)胞保護(hù)機(jī)制在缺氧條件(又稱低氧條件，指限制細(xì)胞獲得氧氣的腫瘤高細(xì)胞密度)下生存，這些保護(hù)機(jī)制包括誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、Bcl-2、MMPs等表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子激活，以及有利于細(xì)胞增殖、血管新生和多藥耐藥的葡萄糖重新編碼機(jī)制等。低氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境特征之一，與腫瘤發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，是導(dǎo)致腫瘤治療失敗和預(yù)后不良的重要因素[10]。低氧時，肝癌細(xì)胞可通過誘導(dǎo)多種血管生成相關(guān)因子刺激血管的新生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，如胰島素樣生長因子Ⅱ和VEGF，成為促進(jìn)腫瘤生長的重要原因之一。肝TACE治療中晚期肝癌栓塞腫瘤血管時，如果栓塞不完全，可使肝內(nèi)局部形成缺血缺氧微環(huán)境，促進(jìn)大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，從而導(dǎo)致肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，對低氧條件下抑制肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力進(jìn)行研究，對于減少肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有重要意義。

圖2 不同濃度天冬多糖對低氧下HepG2細(xì)胞遷移能力的影響(Transwell法，×200)

中醫(yī)藥在惡性腫瘤的綜合治療中有著重要的作用。與西醫(yī)化療藥相比，中藥具有不良反應(yīng)小、安全性高、多途徑、多靶點(diǎn)、適用范圍廣等治療特點(diǎn)。天冬始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，性甘、苦、寒，具有殺三蟲、去伏尸的功效。肝癌患者多為陰虛，而天冬是滋補(bǔ)陰虛的良品，可以保護(hù)陰液、肝陰, 另外天冬還有抗菌等作用[11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，天冬具有明確的抗腫瘤作用，已在臨床上用于治療乳腺癌、白血病、淋巴瘤等。天冬多糖由天冬經(jīng)脫蛋白提取而成，除具有抗癌作用外，還具有提高機(jī)體免疫力、保肝益腎的功效，既有驅(qū)邪之功，又有扶正之效。研究發(fā)現(xiàn)，天冬多糖對正常細(xì)胞尤其是造血細(xì)胞不具有損傷抑制作用或作用甚小，而有利于惡性腫瘤毒性的逆轉(zhuǎn)，且能通過促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖或提高免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而抑制腫瘤生長，對于放化療、手術(shù)后或腫瘤本身造成的機(jī)體免疫低下有一定改善作用，并可減輕放化療引起的不良反應(yīng)[12]。將天冬多糖制成膠劑后，除了天冬多糖本身的抗腫瘤作用外，可同時起到栓塞腫瘤血管的作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)肝動脈給予荷肝癌大鼠動物模型精制天冬膠樣制劑進(jìn)行栓塞治療，可明顯下調(diào)腫瘤組織中VEGF的表達(dá)，抑制肝癌的血管新生，既減輕了不良反應(yīng)，相對延長了原位移植肝癌大鼠的生存時間，又起到抗血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，抗腫瘤作用溫和[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的天冬多糖對低氧條件下的人肝癌細(xì)胞均有明顯的生長抑制作用，且細(xì)胞生長抑制率與天冬多糖濃度呈正相關(guān)，具有劑量依賴性，提示天冬多糖對低氧下肝癌細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用，且隨著天冬多糖的濃度增加，對細(xì)胞的生長抑制更加顯著。

遷移和侵襲是惡性腫瘤的重要特征，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲的能力，依賴于細(xì)胞外基質(zhì)降解的能力，而低氧條件可大大影響細(xì)胞的黏附和侵入。近年研究表明，中藥可以通過激活相關(guān)miRNA而抑制其靶基因的表達(dá)，抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，最終影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]?？拱┧幬锾崛〉挠行С煞智埸S素可引起尿激酶、纖維酶原激活因子的表達(dá)下降，降低尿激酶活性，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶分泌，顯著抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，天冬多糖低濃度組、天冬多糖中濃度組、天冬多糖高濃度組的侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)均低于空白對照組，提示天冬多糖能有效抑制低氧條件下人肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移，可能與其發(fā)揮抗腫瘤作用有一定關(guān)系。

綜上所述，天冬多糖對低氧條件下人肝癌細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，并能有效抑制人肝癌細(xì)胞的侵襲與遷移，為進(jìn)一步研究天冬多糖抗腫瘤的機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。