劉淼，谷江，張永春，夏劍鋒，楊錦春，董安濤

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴陽550004)

腎結(jié)石是一種以間歇性腎絞痛和血尿為主要表現(xiàn)的疾病，發(fā)病率、復發(fā)率高，對腎功能危害大，嚴重危害人群健康。從腎結(jié)石成分來看，腎結(jié)石主要以含鈣結(jié)石為主，其中又以草酸鈣結(jié)石最多。既往研究認為，鈣鹽沉積、腎鈣斑沉積可能與腎結(jié)石的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，納米細菌(NB)在95%的腎結(jié)石患者血液中檢測到，是腎結(jié)石形成的起始核心[2]。在人體內(nèi)，NB可利用機體血液中的鈣源發(fā)揮生物礦化作用，與炎性介質(zhì)、基質(zhì)蛋白一起形成早期腎結(jié)石的晶核，進而導致結(jié)石的形成[3]。烏梅是由薔薇科植物梅的干燥近成熟果實加工而成，其主要化學成分為有機酸、黃酮、萜類、甾醇等[4]，其中高富含量的檸檬酸、蘋果酸、丁二酸等，對泌尿系結(jié)石的形成具有有效拮抗作用[5,6]。但烏梅對NB導致腎結(jié)石形成的影響及作用機制尚不明確。2015年2月～2016年9月，我們采用NB建立了大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型，探討烏梅提取物對NB所致腎草酸鈣結(jié)石形成的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 8周齡雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，由貴州醫(yī)科大學動物中心提供。烏梅提取物購自西安賽奧生物技術(shù)有限公司；8-羥基脫氧鳥苷(8-OHDG)測試盒、丙二醛(MDA)試劑盒、檸檬酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所；PCR擴增試劑盒及引物由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2 NB分離、培養(yǎng)及制備

1.2.1 標本采集 選擇2015年2月～2016年6月于我院泌尿外科行開放手術(shù)取石的腎結(jié)石患者16例，男9例、女7例，年齡32～49歲，排除感染、內(nèi)分泌疾病、多系統(tǒng)結(jié)石等患者。術(shù)中無菌采集結(jié)石標本，并保存于-80 ℃低溫冰箱。將結(jié)石放置于1 mol/L HCl中去礦物質(zhì)處理，然后PBS中和、洗滌，碾碎成粉末狀，20 000 r/min離心40 min后，經(jīng)0.22 μm的濾頭加壓過濾，收集濾過液。

1.2.2 NB的培養(yǎng)及制備 取處理后的結(jié)石濾過液1 mL，加入含10%熱滅活γ-胎牛血清(γ-FBS)的PMBI1640，30 d換液一次，培養(yǎng)條件為37 ℃、pH 7.4、5%CO2、95%空氣。培養(yǎng)4周后，培養(yǎng)管底部出現(xiàn)白色菌群沉淀，棄去培養(yǎng)管中的培養(yǎng)液，留取管底部分，徹底混勻后，移入離心管中，加入適量生理鹽水，4 ℃離心40 min，去上清。沉淀中加入1 mol/L HCl 0.5 mL混勻，37 ℃放置30 min；加入Tris中和，4 ℃離心40 min，留沉淀，配制為NB混懸液備用。經(jīng)RT-PCR反應(yīng)鑒定NB中16s rRNA基因，PCR擴增產(chǎn)物電泳可見1 409 bp處出現(xiàn)目的片段，確定NB培養(yǎng)成功。

1.3 動物分組及模型建立 30只大鼠隨機分為A、B、C、D、E組各6只。A組第1天以尾靜脈一次性注射生理鹽水1 mL作為正常對照，B、C、D、E組均于第1天以尾靜脈一次性注射NB混懸液1 mL制備大鼠腎結(jié)石模型。

1.4 干預(yù)方法 A、B組第2天起均以生理鹽水2 mL/d灌胃，C、D、E組第2天起分別以0.05、0.10、0.15 g/mL烏梅提取物2 mL/d灌胃。各組大鼠均灌胃干預(yù)4周。

1.5 尿液草酸(Ox)、鈣(Ca2+)、檸檬酸、8-OHDG水平測定 各組干預(yù)4周后，用代謝籠收集24 h尿液，應(yīng)用高錳酸鉀褪色法測定尿液Ox 水平，全自動生化儀測定尿液Ca2+水平，檸檬酸試劑盒測定尿液檸檬酸水平，8-OHDG測試盒以及酶標儀測定尿液8-OHDG水平。

1.6 腎組織草酸鈣結(jié)晶形態(tài)觀察及結(jié)晶量分級評分 收集尿液次日，乙醚麻醉大鼠，縱向剖開雙腎，取左側(cè)腎臟，用10%甲醛固定，石蠟包埋，3 mm切片，行HE染色觀察腎組織草酸鈣結(jié)晶形態(tài)。計數(shù)平均每個高倍視野內(nèi)大鼠左腎草酸鈣結(jié)晶數(shù)量。評判標準為腎臟剖面結(jié)晶量分級：0級為無結(jié)石、結(jié)晶形成；1級為少量結(jié)石、結(jié)晶形成，每個視野3個以下；2級為較多結(jié)石、結(jié)晶形成，每個視野3～5個；3級為較多結(jié)石、結(jié)晶形成，每個視野6～10個；4級為大量結(jié)石、結(jié)晶形成，每個視野10個以上，甚至結(jié)石、結(jié)晶成團，堵塞腎小管。將0～4級分別記為 1、2、3、4、5分。

1.7 腎組織MDA水平檢測 采用硫代巴比妥酸法。取右腎皮質(zhì)研磨制成10%的勻漿，保存于PBS中，離心取上清，應(yīng)用MDA試劑盒檢測腎組織MDA水平。

2 結(jié)果

2.1 各組尿液Ox、Ca2+、檸檬酸、8-OHDG水平比較 B組尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均高于A組，檸檬酸水平低于A組(P均<0.05)。C、D、E組尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均低于B組，檸檬酸水平均高于B組(P均<0.05)。D、E組尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均低于C組，檸檬酸水平均高于C組(P均<0.05)。E組尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均低于D組，檸檬酸水平均高于D組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組尿液Ox、Ca2+、檸檬酸、8-OHDG水平比較

注： 與A組比較，*P<0.05；與B組比較，﹟P<0.05；與C組比較，△P<0.05；與D組比較，▲P<0.05。

2.2 各組腎組織草酸鈣結(jié)晶形態(tài)及結(jié)晶量評分比較 A組無草酸鈣結(jié)晶，B組草酸鈣結(jié)晶明顯較多，C、D、E組草酸鈣結(jié)晶數(shù)量較B組明顯減少。見圖1。A、B、C、D、E組草酸鈣結(jié)晶量評分分別為(1.00±0)、(4.83±0.40)、(3.83±0.41)、(3.00±0.63)、(2.50±0.84)分，B、C、D、E組草酸鈣結(jié)晶量評分均高于A組，C、D、E組草酸鈣結(jié)晶量評分均低于B組(P均<0.05)。

圖1 各組腎組織草酸鈣結(jié)晶形態(tài)(HE染色，×200)

2.3 各組腎組織MDA水平比較 A、B、C、D、E組腎組織MDA水平分別為(3.41±0.05)、(3.95±0.15)、(3.90±0.04)、(3.68±0.10)、(3.55±0.07)分，B、C、D、E組MDA水平均高于A組，D、E組MDA水平均低于B組(P均<0.05)。

3 討論

腎結(jié)石是泌尿外科最常見的疾病之一。近年來，腎結(jié)石在我國的發(fā)病率呈上升趨勢，5%～15%的人一生中會罹患腎結(jié)石，其中約80%為草酸鈣腎結(jié)石。草酸鈣腎結(jié)石的形成學說有多種觀點，包括腎鈣斑形成、過飽和結(jié)晶、抑制物缺乏、免疫損傷等[7]。

NB為革蘭陰性菌，廣泛存在于自然界的礦物質(zhì)中和生物體內(nèi)，可耐高溫、強酸等。近年研究發(fā)現(xiàn)，NB具有特殊的生物礦化能力，能在菌體周圍產(chǎn)生羥磷灰石碳酸鹽結(jié)晶，從而導致結(jié)石的形成[6]。NB在pH7.4的生理性鈣磷水平中能形成羥基磷灰石碳酸鹽結(jié)晶，產(chǎn)生堅硬的礦化外殼覆蓋于菌體周圍。此外，NB可聚集環(huán)境中的鈣離子并形成礦化納米顆粒，作為活性中心，黏附、侵入并破壞腎集合管的上皮細胞和腎乳頭細胞，形成磷灰石晶核，從而誘發(fā)結(jié)石形成[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，B組腎組織草酸鈣結(jié)晶量評分均高于A組，腎組織草酸鈣結(jié)晶明顯較多，提示NB能夠促進大鼠腎草酸鈣結(jié)晶、結(jié)石的形成。因此，抑制NB的生物礦化作用，對于抑制大鼠腎草酸鈣結(jié)晶、結(jié)石的形成具有重要意義。

烏梅是一種安全性高的藥食同源藥材，其藥理作用廣泛，在抑菌、抗腫瘤、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、治療結(jié)腸炎方面具有明顯作用。王萍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，烏梅含有檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、天冬氨酸、熊果酸等能明顯抑制結(jié)石形成的有機酸，各有機酸的協(xié)同作用能與Ca2+螯合，降低結(jié)石形成的風險。檸檬酸是烏梅有機酸中的主要成分，占烏梅有機酸總量的19%，較Ox而言，檸檬酸能優(yōu)先螯合Ca2+形成可溶性鹽并抑制草酸鈣結(jié)晶形成[10]，有實驗已證實檸檬酸及檸檬酸鹽在體外可抑制一水草酸鈣的形成及聚集[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與B組相比，C、D、E組尿液腎組織草酸鈣結(jié)晶數(shù)量及評分均明顯降低，尿液檸檬酸水平均明顯增高，提示烏梅提取物可使腎結(jié)石大鼠的草酸鈣結(jié)晶明顯減少，隨著烏梅提取物干預(yù)濃度的增加，結(jié)晶結(jié)石級別逐漸下降，尿檸檬酸的排泄逐漸增加，表明烏梅能有效抑制NB的礦化作用，減少大鼠草酸鈣結(jié)晶、結(jié)石的形成。

Ox是一種簡單的二羥基酸，是很多動、植物和微生物的一種代謝終產(chǎn)物，在動物體內(nèi)常以鹽的形式存在，在自然界中最普通的形式是草酸鈣。研究發(fā)現(xiàn)，尿液中輕微的Ox超載即比嚴重的鈣超載對草酸鈣形成的影響更明顯[11]。近期研究表明，腎小管上皮細胞暴露于Ox將會產(chǎn)生細胞膜表面性質(zhì)改變、線粒體功能中斷、活性氧(ROS)形成等毒性反應(yīng)，而高Ox誘導的高活性氧水平進一步導致氧化還原失衡、脂質(zhì)過氧化，導致腎臟炎性反應(yīng)發(fā)生、細胞膜完整性喪失以及腎上皮組織損傷，繼而利于晶體在細胞膜上黏附以及結(jié)晶在腎組織內(nèi)的聚集[12]，同時Ox超載誘導的腎小管上皮細胞膜完整性的喪失將引起腎小管重吸收障礙，導致腎鈣的泄漏，表現(xiàn)為尿鈣排泄量的增多[10,13]。ROS作用于細胞核中DNA后可發(fā)生過氧化反應(yīng)，導致DNA-蛋白交聯(lián)、嘌呤氧化等許多化學修飾，引起DNA氧化損傷，使羥基自由基從穩(wěn)定的生物分子如蛋白質(zhì)和代謝物中獲取電子和H+，導致堿基修復系統(tǒng)損傷，產(chǎn)生錯誤的堿基配對，出現(xiàn)基因突變甚至DNA裂解，產(chǎn)生大量8-OHDG[14]。8-OHDG 是反映DNA過氧化損傷的標記物，存在于氧化損傷的腎小管上皮細胞的細胞核[15]。而自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的氧化終產(chǎn)物為MDA。MDA可以引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細胞毒性。本研究發(fā)現(xiàn)，B組尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平及腎組織MDA水平均高于A組，提示NB能夠促進大鼠尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平增高，并促進腎組織過氧化損傷；C、D、E組尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均低于B組，D、E組腎組織MDA水平均低于B組，提示烏梅提取物能降低大鼠尿液Ox水平，進而減少尿Ca2+的排泄，并對自由基有較好的清除作用，減少過氧化損傷，從而抑制草酸鈣結(jié)石的形成。

綜上所述，烏梅提取物對NB所致的大鼠腎草酸鈣結(jié)石具有明顯的抑制作用，其機制可能與降低大鼠尿液Ox水平，進而減少尿Ca2+的排泄，減少脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)。