李敏，吳汪麗，彭云，肖一平

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州510260)

糖尿病腎病是終末期腎臟疾病的主要發(fā)病原因，也是糖尿病患者致死、致殘的主要原因[1]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，主要通過調(diào)節(jié)蛋白編碼基因，影響蛋白質(zhì)編碼基因的表達水平、穩(wěn)定性和細胞定位等，參與調(diào)控多種進程，如細胞分化、生長發(fā)育、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等[2,3]。研究發(fā)現(xiàn)，許多l(xiāng)ncRNA在腎臟發(fā)育和腎臟疾病發(fā)病中發(fā)揮一定的調(diào)控作用[4]。漿細胞瘤異位基因1(PVT1)為lncRNA，是目前惟一一個與腎臟疾病相關(guān)的lncRNA[5]，與糖尿病腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，PVT1在糖尿病患者的腎小球系膜細胞表達豐富，但不表達相關(guān)蛋白，其可能代表一個非編碼RNA，當發(fā)生擴增和過度表達時，可促進細胞增殖[6]。腎小球細胞外基質(zhì)(ECM)的過度堆積在糖尿病腎病發(fā)展中發(fā)揮核心作用[7,8]。2015年2月～2016年5月，我們采用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)抑制腎小球系膜細胞PVT1 mRNA表達，觀察下調(diào)PVT1表達對高糖環(huán)境下腎小球系膜細胞增殖及ECM相關(guān)蛋白表達的影響，探討PVT1在糖尿病腎臟疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 人腎小球系膜細胞購自美國Scien Cell公司。胎牛血清和DMEM購自美國Gibco公司；siRNA轉(zhuǎn)染試劑Lipofecttamine2000購自美國Invitrogen公司；Annexinv-FITC/PI凋亡試劑盒和周期檢測試劑盒購自中國凱基公司；PVT1、纖維連接蛋白(FN)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制因子(PAT-1)、羊抗兔IgG購自美國Abcam公司；總蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE 膠試劑盒購自中國碧云天公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR 試劑盒購自日本Takara公司；PVT1 siRNA和control siRNA由上海吉凱制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2 細胞分組、干預(yù)及轉(zhuǎn)染方法 細胞培養(yǎng)后，以2×105/孔常規(guī)培養(yǎng)于6孔板，分為正常對照組、高糖組、高糖+control siRNA組、高糖+PVT1 siRNA組。正常對照組在5.55 mmol/L的低糖DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，高糖組、高糖+control siRNA組、高糖+PVT1 siRNA組均在25 mmol/L的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待融合度達70%時，將高糖+control siRNA組、高糖+PVT1 siRNA組培養(yǎng)基換成Opti-MEM培養(yǎng)基，嚴格按GenePharma RNAi產(chǎn)品使用手冊的Protocol進行操作，分別轉(zhuǎn)染control siRNA、PVT1 siRNA。

1.3 細胞增殖檢測 采用CCK-8法。各組細胞于37 ℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)0、24、48、72 h后，嚴格按CCK-8試劑盒說明書步驟進行操作，測定每個時間點各組細胞OD值，以實驗組OD值/陰性對照組OD值×100%計算細胞增殖率。

1.4 細胞周期檢測 采用流式細胞術(shù)。將各組細胞消化收集，制備單細胞懸液，預(yù)冷PBS清洗2～3次，重懸細胞于EP管中，70%乙醇固定，-20 ℃過夜，PI/Rnas染色，按細胞周期檢測試劑盒說明書操作，于流式細胞儀上檢測細胞G1、S期的比例。

1.5 PVT1 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。各組細胞培養(yǎng)48 h時，去掉原培養(yǎng)基，使用預(yù)冷的PBS洗滌細胞；TRIzol法提取細胞總RNA，以提取的總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)體系為70 ℃，保溫10 min后迅速在冰上冷卻2 min，42 ℃ 60 s，72 ℃ 15 s。按照 qRT-PCR試劑盒(RR420A)SYBR Green法進行擴增，擴增40個循環(huán)周期，每個標本3個復(fù)孔。人PVT1引物序列為上游：5′-GCCCTCCAGCCTGATCTTTT-3′，下游 5′-CAGCGTTATTCCCCAGACCA-3′。檢測PVT1 mRNA的相對表達量。

1.6 ECM相關(guān)蛋白表達檢測 采用Western blot法，檢測ECM相關(guān)蛋白FN、TGF-β1及PAT-1蛋白的表達。各組細胞培養(yǎng)48 h時，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。上樣量為20 μg 總蛋白，經(jīng)5%的濃縮膠和6%的分離膠SDS-PAGE電泳；濃縮膠60 V電泳60 min，分離膠120 V電泳70 min。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜100 V，60 min，5%BSA封閉60 min，免疫抗體反應(yīng)(稀釋比例，一抗 1∶1 000；二抗1∶5 000)。ECL化學(xué)發(fā)光，醫(yī)用X光底片顯影。使用Quantity One分析電泳條帶的灰度值，與GAPDH比較計算相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間細胞增殖率比較 高糖組細胞各時點細胞增殖率均高于正常對照組，高糖+PVT1 siRNA組各時點細胞增殖率均低于高糖組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間細胞增殖率比較

注：與正常對照組比較，#P<0.05，△P<0.01；與高糖組比較，*P<0.05，▲P<0.01。

2.2 各組細胞周期比例比較 與正常對照組比較，高糖組細胞G1期比例減少、S期比例增多；與高糖組比較，高糖+PVT1 siRNA組細胞G1比例增加、S期比例減少(P均<0.05)。見表2。

表2 各組細胞周期比例比較

注：與正常對照組比較，△P<0.01；與高糖組比較，*P<0.05，▲P<0.01。

2.3 各組細胞PVT1 mRNA表達比較 正常對照組、高糖組、高糖+control siRNA組、高糖+PVT1 siRNA組PVT1 mRNA相對表達量分別為1.00±0.03、7.73±0.06、7.12±0.10、1.92±0.05，高糖組、高糖+control siRNA組PVT1 mRNA相對表達量均高于正常對照組，高糖+PVT1 siRNA組PVT1 mRNA相對表達量低于高糖組(P均<0.05)。

2.4 各組細胞FN、TGF-β1及PAT-1蛋白表達比較 高糖組、高糖+control siRNA組、高糖+PVT1 siRNA組FN、TGF-β1、PAT-1表達均高于正常對照組，高糖+PVT1 siRNA組FN、TGF-β1、PAT-1表達均低于高糖組(P均<0.05)。見表3、圖1。

表3 各組細胞FN、TGF-β1及PAT-1蛋白表達比較

注：與正常對照組比較，△P<0.01；與高糖組比較，*P<0.05，▲P<0.01。

注：1為正常對照組；2為高糖組；3為高糖+control siRNA組；4為高糖+PVT1 siRNA組。

圖1 各組細胞FN、TGF-β1及PAT-1蛋白表達情況(Western blot法)

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病引起的嚴重和危害較大的一種慢性并發(fā)癥，是終末期腎病患者的主要死因之一。糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展主要由遺傳易感性及高糖環(huán)境因素相互作用引起的。高血糖可改變腎小球內(nèi)血流動力學(xué)，促進腎臟ECM沉積。糖尿病腎病在早期可因糖尿病微血管病變導(dǎo)致腎小球濾過功能亢進，而在后期可發(fā)生ECM積聚和腎小球硬化，其中腎小球系膜細胞發(fā)揮了中心作用[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA與慢性腎臟疾病的發(fā)病有關(guān)。Lorenzen 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在急性腎損傷危重患者血液中可檢測到lncRNA Tap SAKI，且其水平與疾病的嚴重程度相關(guān)。Sui等[10]通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，非IgA原發(fā)性腎小球疾病患者系膜區(qū)系膜細胞lncRNA明顯增多。但目前，lncRNA在腎臟疾病中的研究主要集中在檢測其表達差異，而其作用機制研究相對較少。

PVT1位于人染色體8q24，參與該部位以及2、22號染色體之間的復(fù)發(fā)性易位，參與細胞周期、細胞凋亡和細胞轉(zhuǎn)化重要進程[11]。Hanson等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PVT1位點與2型糖尿病的發(fā)病顯著相關(guān)，PVT1是終末期腎病的易感基因部位。PVT1與1型糖尿病引起的終末期腎病有關(guān)。研究表明，PVT1可導(dǎo)致腎小球ECM沉積。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖組PVT1 mRNA相對表達量均高于正常對照組，結(jié)合高糖組細胞增殖率高于正常對照組、S期細胞比例增多的結(jié)果，考慮高糖環(huán)境下，腎小球系膜細胞的增殖明顯加快，可能與PVT1表達增加有關(guān)；高糖+PVT1 siRNA組PVT1 mRNA相對表達量低于高糖組，結(jié)合高糖+PVT1 siRNA組細胞增殖率低于高糖組、S期比例減少的結(jié)果，考慮抑制PVT1表達后，可明顯抑制高糖環(huán)境下腎小球系膜細胞的增殖。

ECM是由細胞合成并分泌到胞外、分布在細胞表面和細胞之間的大分子，主要是多糖、蛋白或蛋白聚糖。ECM不屬于任何細胞，其決定結(jié)締組織的特性，為細胞的生存及活動提供適宜的場所，并通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)影響細胞的形狀、代謝、遷移、增殖和分化。ECM積聚是糖尿病腎病的特點之一。高糖可引起纖溶酶原激活物抑制物過度表達，纖溶酶原轉(zhuǎn)變纖溶酶受抑制，ECM降解減少，導(dǎo)致腎小球硬化、腎臟纖維化。腎小球系膜細胞功能紊亂，分泌大量的細胞因子，包括TGF-β1、FN、COL4A1、PAI-1等ECM合成成分。TGF-β1在ECM作用主要是增加基質(zhì)合成，此外，TGF-β1可通過抑制MMPs和促進TIMPs的合成，直接影響ECM的表達[13]。TGF-β1表達增加時，可刺激腎小球系膜細胞內(nèi)蛋白多糖、膠原和纖維連接蛋白的產(chǎn)生，引起ECM合成增加。FN主要是促使細胞與基質(zhì)結(jié)合，使ECM形成網(wǎng)絡(luò)；或與細胞表面的受體結(jié)合，使細胞附著于ECM上，并通過膜整合蛋白將細胞外與細胞內(nèi)連成一個整體。PAI-1可激活多種蛋白溶解酶，降解ECM、基底膜；促進uPA-uPAR的細胞降解內(nèi)吞，防止ECM降解過度。ECM蛋白的關(guān)鍵調(diào)控因子PAI-1表達升高時，可破壞系膜細胞產(chǎn)生纖維蛋白誘導(dǎo)的能力，使ECM降解緩慢，系膜增生。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖組FN、TGF-β1、PAT-1表達均高于正常對照組，提示高糖環(huán)境下，腎小球系膜細胞中的TGF-β1、FN、PAI-1蛋白表達增加，可能參與了腎小球系膜細胞增殖的過程；高糖+PVT1 siRNA組FN、TGF-β1、PAT-1表達均低于高糖組，提示抑制PVT1表達后，F(xiàn)N、PAI-1、TGF-β1蛋白表達均降低，可能與高糖環(huán)境下腎小球系膜細胞增殖受到抑制有關(guān)。

綜上所述，高糖環(huán)境可明顯促進腎小球系膜細胞的增殖，且ECM相關(guān)蛋白表達增加，可能是導(dǎo)致ECM積聚的機制之一；抑制PVT1表達后，腎小球系膜細胞增殖受到抑制、ECM相關(guān)蛋白表達減低，表明下調(diào)PVT1表達可通過抑制腎小球系膜細胞增殖及ECM積聚，減緩或抑制糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。