郭秀霞，李靈芝，馬太光，雷逢進(jìn)，張瑞騰，李海平

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運城044000）

西葫蘆ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

郭秀霞1，李靈芝1，馬太光1，雷逢進(jìn)2，張瑞騰1，李海平1

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運城044000）

為了確定西葫蘆ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系，以西葫蘆基因組DNA為模板，采用正交試驗方法，對模板DNA、引物及2×Taq PCR Master Mix的用量進(jìn)行了優(yōu)化，并通過梯度PCR確定不同引物的最佳退火溫度。結(jié)果表明，最佳反應(yīng)體系為：在20 μL的體系中，模板DNA（50 ng/μL）1 L，引物（10 μmol/L）3 L，Master Mix 10 μL；利用該體系從50條ISSR引物中篩選出18條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的引物。這一體系的建立及引物篩選為以后利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對西葫蘆進(jìn)行研究提供了科學(xué)依據(jù)。

西葫蘆；ISSR-PCR；正交設(shè)計；引物篩選

西葫蘆（Cucurbita pepo L.）又名美洲南瓜，是葫蘆科南瓜屬中的一個栽培種[1]，為1年生草本植物[2]。西葫蘆生長迅速、適應(yīng)性強、結(jié)瓜早，經(jīng)濟(jì)效益高[3]，隨著種植面積的擴(kuò)大，西葫蘆已成為我國廣泛栽培的重要蔬菜之一。為了適應(yīng)生產(chǎn)的需要，要培育高品質(zhì)、多抗、專用的西葫蘆新品種，就需要充分利用優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。

近年來，DNA分子技術(shù)已被廣泛用于植物育種，涉及植物品種鑒定、基因定位、遺傳多樣性等方面。目前，國內(nèi)外用于西葫蘆遺傳關(guān)系分析的分子標(biāo)記主要有SSR和RAPD，采用的分子標(biāo)記比較單一。ISSR標(biāo)記技術(shù)（inter-simple sequence repeat，簡單重復(fù)序列區(qū)間標(biāo)記技術(shù)）是1994年加拿大蒙特利爾大學(xué)的ZIETKIEWICZ等[4]提出的，是在SSR分子標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上創(chuàng)建的，該技術(shù)快速簡便，成本較低，有較好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，能有效地對種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性的分析，在苦瓜、南瓜、絲瓜、甜瓜方面都有報道[5-11]。雖然ISSR技術(shù)較簡單，但它的反應(yīng)結(jié)果容易受模板、引物等因素的影響，因此，需要對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。ISSR引物雖然具有通用性，但是不同的植物適用的引物也不同，同一引物在不同植物PCR時，退火溫度也不同[12]，比如引物827在蘆筍、稗屬植物、暴馬丁香中的最佳退火溫度分別分47.0，51.7，48.2℃[12-14]。因此，必須篩選引物的最佳退火溫度。

本研究采用正交試驗設(shè)計方法對影響ISSR反應(yīng)的模板、引物及Master Mix和退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行西葫蘆種質(zhì)資源遺傳多樣性、種質(zhì)資源鑒定等研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用的DNA Marker DL2000，2×Taq PCR Master Mix購自中科瑞泰生物技術(shù)有限公司；引物是根據(jù)哥倫比亞大學(xué)公布的引物序列以及盧亞楠[15]、司旻星[16]、鐘開勤[17]等研究中所用的ISSR引物所設(shè)計的，共50條，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采用改良的CTAB法提取西葫蘆幼嫩葉片基因組DNA。采用NANODROP2000c核酸蛋白儀測定DNA的濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，-20℃保存以備后期使用。

1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化 用L16（43）正交試驗設(shè)計方法，在20 μL的反應(yīng)體系中，對影響ISSRPCR試驗的模板DNA、引物和Master Mix 3個因素（每個因素設(shè)置4個水平）進(jìn)行篩選（表1），共16個處理（表2）。試驗所用的模板DNA質(zhì)量濃度均稀釋為50 ng/μL，引物濃度均為10 μmol/L。

表1 西葫蘆ISSR-PCR反應(yīng)的因素和水平

表2 ISSR-PCR反應(yīng)正交試驗設(shè)計L16（43）

擴(kuò)增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性45 s，退火1 min，72℃延伸90 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min；4℃保存[15]。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，并用凝膠成像儀觀察并拍照。

1.2.3 引物篩選 隨機抽取5個品種的DNA為試材，在試驗確定的最佳反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，從試驗初步篩選的50條引物中選出能擴(kuò)增出多個清晰條帶的引物。

1.2.4 最佳退火溫度篩選 以其中1個品種為樣本，每個引物的退火溫度設(shè)置為理論退火溫度上下5℃范圍，采用PCR儀自動生成8個溫度，PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對篩選出的引物在不同退火溫度下的擴(kuò)增效果進(jìn)行檢驗，以篩選出最佳退火溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量檢測

用核酸蛋白儀對提取的西葫蘆DNA進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，所提取的DNA OD260/OD280在1.90左右，純度較高。從圖1可以看出，所提取的DNA主帶清晰，排列整齊，能夠滿足ISSR分析的要求。

2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗結(jié)果分析

從圖2可以看出，16個處理的擴(kuò)增效果具有一定的差異性，除處理2，5，9，13外，其他處理都有條帶，處理3，4，7，8，10擴(kuò)增的條帶多態(tài)性均豐富，通過后期的進(jìn)一步驗證，認(rèn)為處理3的穩(wěn)定性最佳。因此，確定處理3為西葫蘆ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系。

2.3 不同引物退火溫度的確定及其篩選

各引物的退火溫度不一定等于它的Tm值，而是在其附近波動，也有可能偏離嚴(yán)重[10]。采用PCR儀自動生成的8個溫度梯度對初選的50條引物進(jìn)行退火溫度優(yōu)化，根據(jù)不同退火溫度下的擴(kuò)增效果確定各引物的最佳退火溫度。

從圖3可以看出，第3，12，21泳道的擴(kuò)增條帶數(shù)多且清晰，因此，引物807，810，812的最佳退火溫度分別為48.9，50.9，53.2℃。18條引物的最佳退火溫度結(jié)果列于表3。

從表3可以看出，不同引物的最佳退火溫度差別較大，為了驗證所選出來的18條引物的有效性和體系的可行性，用這18個引物對23個不同的西葫蘆品種進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，這些引物擴(kuò)增出的條帶清晰可見，說明該體系以及篩選出的引物可以用于研究西葫蘆的遺傳多樣性（圖4）。

表3 篩選出的有效ISSR引物及其退火溫度

3 結(jié)論與討論

ISSR以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)，其反應(yīng)結(jié)果容易受模板、引物、dNTPs和Taq DNA聚合酶、Mg2+等因素的影響。其中，引物的濃度尤為重要，若濃度太高，會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增和大量引物二聚體，還會使堿基發(fā)生錯配；若濃度太低，擴(kuò)增產(chǎn)物量少且穩(wěn)定性差。模板DNA的濃度對PCR反應(yīng)的影響不是很大，只要保證其質(zhì)量就可以了。本試驗采用了Master Mix，它包含了dNTPs，Taq DNA聚合酶和Mg2+，穩(wěn)定性好、靈敏度高、多態(tài)性好，不僅避免了污染，還大大節(jié)省了時間，并且便于分析[18]。正交試驗結(jié)果表明，在西葫蘆ISSR-PCR 20 μL體系中，3個因素的最佳水平為：模板DNA（50 ng/μL）1 μL，引物（10 μmol/L）3 μL，Master Mix 10 μL。

ISSR的引物具有通用性，但如果植物不同，適用的ISSR引物也不同；同一個引物應(yīng)用到不同的植物，其退火溫度也會不同。劉威生等[19]研究認(rèn)為，退火溫度對ISSR-PCR反應(yīng)的結(jié)果影響較大，若溫度太高，會影響引物與模板的結(jié)合；若溫度太低，會降低特異性。最佳的退火溫度與理論值可能相差5℃左右，也有可能相差很大[20]。本試驗對所篩選的引物進(jìn)行了最佳退火溫度的篩選，且它與其Tm值之間沒有規(guī)律性，沒有嚴(yán)重的偏離，可對今后西葫蘆ISSR分子標(biāo)記的研究提供幫助。

本試驗利用最佳擴(kuò)增體系從50條ISSR引物中篩選出18條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的引物，并對目的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，表現(xiàn)出較豐富的多態(tài)性，說明西葫蘆保留了豐富的遺傳多樣性，對西葫蘆育種具有重要的意義。

［1］吳會昌.我國西葫蘆育種現(xiàn)狀、問題及對策[J].北方園藝，2006（2）：48-49.

［2］白玉.DNA分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（24）：7422-7424.

［3］李素珍，許晶，車星星.西葫蘆新品系比較試驗[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（1）：13-16.

［4］周延清.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用 [M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：1，143.

［5］高山，林碧英，許端祥，等.苦瓜種質(zhì)遺傳多樣性的RAPD和ISSR分析[J].植物遺傳資源學(xué)報，2010，11（1）：78-83.

［6］陳禪友，蘭紅，李亞木，等.苦瓜種質(zhì)資源ISSR遺傳多態(tài)性分析[J].長江蔬菜（學(xué)術(shù)版），2012（12）：19-22.

［7］楊正安，孟平紅，代賢，等.云南黑籽南瓜種質(zhì)遺傳多樣性的RAPD和 ISSR分析 [J].植物遺傳資源學(xué)報，2011，12（6）：860-864.

［8］龍榮華.云南地方南瓜資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

［9］陳朝文.絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2009.

［10］任光云，譚亮，李炳.絲瓜ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（1）：68-69.

［11］劉萬勃.RAPD和ISSR標(biāo)記對甜瓜種質(zhì)遺傳多樣性及雜種鑒定的研究[D].重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

［12］齊仙惠，李改珍，巫東堂.蘆筍ISSR引物篩選及遺傳多樣性分析[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，34（3）：249-251.

［13］劉德好，陸永良，婁玉霞.正交試驗優(yōu)化稗屬植物ISSR-PCR反應(yīng)體系[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，32（4）：17-21.

［14］楊曉霞，鄭健，冷平生.暴馬丁香ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J].分子植物育種，2014，12（5）：1018-1026.

［15］盧亞楠.利用RAPD、SSR及ISSR鑒定西葫蘆種質(zhì)資源親緣關(guān)系的研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［16］司旻星.黃瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析[D].上海：上海交通大學(xué)，2006.

［17］鐘開勤.瓠瓜種質(zhì)資源的RAPD和ISSR分析[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2007.

［18］趙建濤，尹延旭，常培培，等.番茄SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（12）：15-18.

［19］劉威生，馮晨靜，楊建民，等.杏ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化和指紋圖譜的構(gòu)建[J].果樹學(xué)報，2005，22（6）：30-33.

［20］劉紅艷，楊東，張繁榮，等.鱇浪白魚ISSR-PCR最佳退火溫度的篩選[J].北方園藝，2011（16）：164-166.

Optimization of ISSR-PCR Reaction System and Selection of Primers in Cucurbita pepo

GUOXiuxia1，LI Lingzhi1，MATaiguang1，LEI Fengjin2，ZHANGRuiteng1，LI Haiping1

（1.College ofHorticulture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Institute ofCotton，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Yuncheng 044000，China）

To determine the best ISSR-PCR reaction system for Cucurbita pepo,experiment with Cucurbita pepo genome DNA as the template,the concentrations of template DNA,primers and 2×Taq PCR Master Mix were optimized by an orthogonal experimental method.The optimal anneal temperature of different primers was determined by gradient PCR.The results showed that the best reaction system was as follows:template DNA（50 ng/μL）1 L,primers（10 μmol/L）3 L,Master Mix 10 μL.Using this system,18 primers with clear and multiple polymorphic bands were selected from 50 primers.The establishment of this system and polymorphism primers could provide a scientific basis for related research using ISSR molecular marker technology in Cucurbita pepo in the future.

Cucurbita pepo L.;ISSR-PCR;orthogonal design;selection ofprimer

S642.6

A

1002-2481（2017）03-0325-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.02

2016-10-19

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（2014GB2A300017）；山西省科技攻關(guān)項目（201303110084）；山西省回國留學(xué)人員科研資助項目（2011050）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才博士科研啟動基金項目（2013YJ23）

郭秀霞（1990-），女，山西孝義人，在讀碩士，研究方向：蔬菜栽培與生理。李靈芝為通信作者。