田沛，南志標(草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學草地農業(yè)科技學院,甘肅 蘭州 730020)

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內生真菌與寄主互惠共生的分子機制

田沛*，南志標
(草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學草地農業(yè)科技學院,甘肅 蘭州 730020)

在自然界中廣泛存在真菌與植物形成的共生體，這種共生作用可以引起真菌和其寄主植物發(fā)生重要的適應性變化。內生真菌與冷季型草坪草高羊茅和黑麥草形成互惠共生體，與病原真菌生長方式的不同，內生真菌僅在寄主細胞間生存，與寄主保持協(xié)同生長，這些獨特的生長方式使得內生真菌生活在植物特定組織內，從不侵染植物細胞，因而寄主缺乏防御反應，二者通過信號交流和調控建立并維持這種互惠共生關系。內生真菌和寄主信號交流包括了多種已知的途徑，其中確定的有活性氧調控途徑，有絲分裂原活化蛋白(mitogen-activated protein，MAP) 激酶級聯(lián)信號途徑及cAMP和Ca2+作為第二信使的信號途徑，本文綜述了通過顯微鏡等各種技術確定的內生真菌在寄主細胞間的生長方式和目前通過基因敲除技術已知的與維持內生真菌與寄主互惠共生相關的基因，期望為深入揭示內生真菌與寄主的信號轉導途徑提供參考。

內生真菌；寄主；互惠共生；活性氧；信號途徑

植物與微生物共生關系的形成使植物能適應陸地上不同的環(huán)境，其中研究最多的是植物與固氮細菌(rhizobia)、菌根真菌(mycorhizae)和內生真菌(endophyte)的共生關系[1-2]。禾草內生真菌指在禾草體內度過全部或大部分生活周期，而禾草本身不顯示任何外部癥狀的一大類真菌[3]。廣泛研究的內生真菌主要是子囊菌門(Ascomycota)麥角科(Clavicipitaceae)的有性世代Epichloё和其所對應無性世代Neotyphodium屬內生真菌。由于該屬內生真菌對家畜的毒性，近50年來國內外科學家已展開了一系列研究，包括內生真菌的分類學、系統(tǒng)學、協(xié)同進化、生物多樣性、生態(tài)學和生物活性物質篩選等，以期深入了解內生真菌并去除其毒性，特別是分子生物學技術的應用，使內生真菌的檢測、鑒定、遺傳多樣性等方面的研究獲得了突破性進展[4-6]。內生真菌與禾草形成互惠共生體，內生真菌在寄主細胞間生存，從寄主獲得糖類、氨基酸等營養(yǎng)以維持其生長，為了更好的生存，內生真菌合成生物堿提高共生體對環(huán)境適應性[7-8]，并同時提高寄主對生物脅迫和非生物脅迫的抗性[9-13]。植物與另外兩種共生菌-固氮細菌和菌根真菌的共生機制及其寄主與真菌間的信號交流途徑研究得較多，已經有了比較深入的了解[1,14]，但是由于對禾草內生真菌研究歷史相對較短，其與寄主植物形成互惠共生體并進行信號交流和調控的機制還知之甚少。本文擬對目前國內外寄主植物與內生真菌之間，尤其是Epichloёfestucae-多年生黑麥草(Loliumperenne)共生體之間的信號傳導及其調控功能等進行了綜述，旨在為內生真菌如何與寄主形成共生機制提供有價值的參考，以期更好地利用內生真菌進行禾草育種。

1 內生真菌菌絲與寄主協(xié)同生長

內生真菌存在于植物組織內，與宿主建立復雜的相互作用，利用不同的方式進行傳播。根據內生真菌的生活周期和對寄主的影響，將內生真菌分為3種類型。第1種類型，真菌在寄主體內度過大部分生活周期，但是當寄主開花時，真菌沿著花序生長并在其基部形成子座，子座產生的有性孢子借助昆蟲、風和雨水進行水平傳播。第2種，真菌在寄主少數(shù)分蘗上形成子座，其他分蘗仍然沒有癥狀，內生真菌可以通過無癥狀分蘗產生的種子垂直傳播給下一代，也可以通過子座產生的有性孢子進行水平傳播。第3種類型，內生真菌在寄主外不產生任何癥狀，整個生活史中都不產生有子座的有性世代，僅依靠種子進行垂直傳播。但是菌絲在寄主葉片上偶有分布，這些菌絲體產生分生孢子，使此類內生真菌仍然可能進行水平傳播[15]。大多數(shù)內生真菌均屬于這一類型[3,16-17]。因此本文后面描述的內生真菌均指第3種內生真菌。這種內生真菌菌絲體通常分布于宿主禾草葉鞘、莖稈、根狀莖的細胞間隙,偶爾在宿主禾草葉片表面分布[18-20]。

圖1 Epichloё 內生真菌與寄主共生時的關鍵特征[24,27]Fig.1 Key features of Epichloё symbioses with grasses a) EGFP表達菌株Epichloё festucae菌絲在種胚中分布(標尺=250 μm)；b)苯胺藍染色后，E. festucae var. lolii 菌絲在黑麥草葉鞘中的分布，與長葉軸(虛線)平行排列[標尺(實線)=100 μm]；c)透射電子顯微鏡展示兩條E. festucae var. lolii 菌絲在黑麥草葉鞘橫切面的胞間分布 (標尺=1 μm)；d)內生真菌在葉片中生長的模式，在莖尖分生組織(SAM)和葉原基兩個分生組織區(qū)(MZ)，頂端生長，隨著葉片細胞成熟，他們在擴展區(qū)(EZ)尺寸持續(xù)增加，一旦葉組織成熟，生長停止；e)掃描電子顯微鏡展示了E. coenophiala菌絲(H)與寄主高羊茅細胞壁緊密連接(標尺=5 μm)；f)共聚焦顯微鏡展示了EGFP表達菌株E. festucae菌絲在生長的黑麥草葉片葉舌區(qū)(LZ)的分布，此區(qū)域有很多橫向分支，紅色是葉綠素自發(fā)熒光，葉片上兩個黑色區(qū)域是維管束(標尺=100 μm)；g)EGFP表達菌株E. festucae菌絲在葉片基部擴展區(qū)25 mm處的共聚焦掃描電鏡照片。箭頭表示在菌絲間測量長度，兩個平行菌絲表示在間隔190 min后拍照(標尺=100 μm)；h)根據共聚焦掃描電鏡照片g描繪的菌絲生長圖；i)繪圖表示內生真菌菌絲(綠色)和寄主細胞(黃色)協(xié)同生長。當寄主細胞擴展時，內生真菌在胞間菌絲長度增加，橫向菌絲隨著菌絲擴展移動，分開更多。 a) Ryegrass embryo infected with hyphae of EGFP-expressing E. festucae strain Fl1 (Scale bar=250 μm); b) E. festucae var. lolii hyphae in a ryegrass leaf sheath. Hyphae, stained with aniline blue, are orientated parallel to the longitudinal leaf axis (dashed). Scale bar (solid)=100 μm; c) Transmission electron microscope (TEM) micrograph showing two E. festucae var. lolii hyphae in the intercellular spaces of a young ryegrass leaf blade (Scale bar=1 μm); d) Model illustrating successive stages in development of the grass leaf. Cells dividing in the meristematic zone (MZ) containing the shoot apical meristem (SAM) and leaf primordia displace older cells upward. As leaf cells mature they undergo a substantial increase in size in the expansion zone (EZ). Once fully expanded the leaf tissue is mature and growth ceases; e) Freeze-fracture Scanning Electron Microscope (SEM) micrograph showing a hypha; hyphae (H) of E. coenophiala in close contact with tall fescue leaf cells (Scale bar=5 μm); f) Confocal micrograph showing EGFP-expressing hyphae of E. festucae strain Fl1 in the ligular zone (LZ) of an elongating ryegrass leaf. Note the presence of many lateral branches in this region of the expanding leaf. The red pigment is autofluorescence of chlorophyll, the two dark regions in the blade are vascular bundles (Scale bar=100 μm); g) Confocal microscope images of E. festucae Fl1 25 mm above the leaf base in the expansion zone. The two parallel hyphae in the foreground were photographed twice at an interval of 190 min. Arrows indicate the lateral branches between which measurements were taken. Scale bar=100 μm; h) Schematic representation of the confocal images presented in (g); i) Diagrammatic representation of synchronised intercalary growth in host cells (yellow boxes) and endophyte compartments (green). As host cells expand, endophyte intercalary hyphal length increases, lateral branches move further apart and remain intact.

隨著顯微技術的發(fā)展，以Michael Christensen為首的科學家借助于光學、透射電子和掃描電子顯微鏡開展了大量的細微觀測以闡明內生真菌在寄主體內的生長方式[21-28]，發(fā)現(xiàn)內生真菌僅在寄主細胞間生存，與寄主保持同步生長，菌絲有兩種不同的生長模式，在分生組織區(qū)(包括莖尖分生組織區(qū)，葉片和葉鞘分化區(qū)三部分)，內生真菌通過頂端生長在葉原基和腋芽進行分化的細胞間形成濃密的菌絲網。在葉鞘和葉片部位，菌絲受寄主細胞機械拉伸，與寄主保持同步生長，當植物器官成熟，菌絲也停止生長。這種獨一無二的生長方式可以分為3個階段。第一階段：胚乳內的內生真菌菌絲隨著種子萌發(fā)在寄主分生組織擴繁，在細胞間進行頂端生長，在葉原基和腋芽部位生長并產生分支，在分生組織區(qū)形成菌絲網。第二階段：內生真菌菌絲在葉鞘和葉片部位受嚴格控制，僅在寄主細胞外生長，菌絲在未知成分的胞外基質作用下緊緊粘附在寄主細胞壁上(圖1)，從胞外質體空間中獲得營養(yǎng)，隨寄主組織生長而生長。菌絲與長葉軸平行，很少分支，偶然有垂直菌絲融合，使菌絲形成內部網絡，促進細胞間信號和營養(yǎng)物質交換。菌絲在葉鞘部位與葉肉細胞壁緊密相連，在葉片部位與活細胞壁相連，菌絲構成葉片組織的一部分，植物細胞不受菌絲的任何影響，被粘附的細胞細胞質變得濃密，沒有液泡，沒有菌絲粘附的細胞有大液泡，說明內生真菌與寄主間發(fā)生了物質交換。當寄主細胞分化和擴展時，隨著寄主細胞增大，粘附在細胞壁上的菌絲細胞得到拉伸(圖1)。在植物生殖發(fā)育過程中，當花序原基從分蘗基部分生組織分化時，菌絲與花序同步生長，菌絲繼續(xù)感染子房和花藥，隨著寄主的進一步生長和種子成熟，菌絲感染種子的盾片和珠心層，然后繼續(xù)感染胚珠、心皮等,在胚形成以后，菌絲廣泛分布在胚及周圍包括胚芽尖、胚軸、糊粉層、胚乳和盾片，侵入葉原基和胚芽鞘原基,但不侵入根原基和胚根鞘原基。這些菌絲隨著種子的萌發(fā)在新的植株中重復其第一、二階段的生長。第三階段：菌絲在寄主植物成熟細胞間停止生長，但是仍保持較高的代謝活性，產生生物堿。菌絲體數(shù)目不隨葉片年齡增加而提高，但是菌絲的直徑隨葉片年齡增加而提高，細胞質成分變得復雜。比如在延伸葉片的葉基部以下，內生真菌細胞質相似且簡單，包括核糖體，線粒體和細胞核。葉基部以上，由于代謝活動的持續(xù)，菌絲濃密缺少液泡，內生真菌細胞質比較復雜，多了脂質體、蛋白質晶體和管狀體。這種協(xié)同生長的方式確保了內生真菌在寄主整個地上部分分布并不對寄主帶來負面影響，并且完成垂直傳播的過程。有時，E.festucae菌絲也在宿主禾草葉片表面無癥狀的分布，并不形成菌絲濃密的子座和香柱病[29-31]，這是內生真菌與葉片協(xié)同生長的過程中，內生真菌菌絲在葉片表皮細胞間生長時產生一種類似真菌附著胞的結構-expressorium，這種結構產生輕微壓力使內生真菌菌絲從表皮細胞間穿透葉片角質層，在胞外生長，這些植物表面生長的菌絲仍與寄主體內精密分布的內生真菌菌絲相連，在葉片停止生長后菌絲也停止生長[32]。這些都說明了內生真菌與病原真菌生長方式的不同，這些獨特的生長方式使得內生真菌生活在植物特定組織內，從不侵染植物細胞，因而寄主缺乏防御反應。已經確認內生真菌和寄主之間通過信號交流以啟動和維持這種互惠共生關系，通過基因工程技術已經證實了多種信號途徑參與控制菌絲的協(xié)同生長。

2 與維持內生真菌與寄主互惠共生相關的信號途徑

隨著生物學技術的發(fā)展，內生真菌與寄主保持互惠共生作用的分子機制是現(xiàn)在國際上關于內生真菌研究的熱點[33-57]。Tanaka等[33]利用質粒和T-DNA插入突變技術篩選與寄主失去互惠共生關系的突變菌株，首次揭示了NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)氧化酶基因noxA的缺失使內生真菌失去與寄主互惠共生作用，從而發(fā)現(xiàn)了活性氧物質(reactive oxygen species，ROS)對維持互惠共生的關鍵作用。通過一系列正向和反向基因篩選，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種蛋白質或多肽在控制內生真菌生長和維持互惠共生中發(fā)揮關鍵作用。除了noxA基因，其他調控NADPH氧化酶復合體(Nox)活性的基因如noxR和racA，壓力激活有絲分裂蛋白激酶(MAPK)-sakA基因，P21激活激酶pakA基因(表1)；進行鈣離子通道調控的cnaA基因(表2)；CAMP信號通路基因acyA(表3);細胞完整性(CWI)MAPK激酶基因mkkA和mpkA等(表4)的缺失，都會導致內生真菌與寄主從互惠共生變?yōu)檗卓棺饔?，表現(xiàn)為寄主矮化，細小分蘗增多，過早衰老，而內生真菌在共生體中生長不受限制，菌絲分支增多，不再與葉軸平行，維管束也被菌絲感染，真菌生物量顯著提高(表1)，這種不受限制的生長模式與野生型菌株(WT)的限制型生長呈鮮明對照。初步推斷以下4種信號通路對維持互惠共生的作用極其顯著。

2.1 真菌NADPH氧化酶復合體(Nox)調控的ROS信號途徑

NADPH氧化酶主要存在于哺乳動物嗜中性粒細胞、植物細胞和絲狀真菌細胞中，以胞質NADPH為電子供體，催化細胞胞外O2生成超氧陰離子(O2-·)，是產生ROS的主要來源。這些ROS與胞外信號分子和細胞表面受體相互作用，參與cGMP相關、蛋白酪氨酸激酶相關和Ca2+相關途徑等多種信號轉導途徑，對寄主防御反應和細胞分化具有重要的功能[34]。真菌Nox復合體有多個亞基以調控胞間合成活性氧ROS。ROS抑制內生真菌菌絲頂端生長，防止了菌絲在寄主分生組織葉片和腋芽原基處大量的擴增和在成熟葉片中的頂端生長。內生真菌Nox復合體基因(noxA,noxR,racA和bemA)缺失或突變都會使活性氧信號途徑失去控制，因而導致寄主感病和矮化，菌絲無序生長，喪失互惠共生關系(表1)[33-36]，證明了Nox復合體在調控內生真菌與寄主互惠共生關系的重要作用。Nox復合體具有NoxA,NoxB和NoxC三個亞體(圖2)，NoxA對維持互惠共生和抑制菌絲生長非常重要[34]，而NoxB對互惠共生關系影響不大(表1)，表明NoxA和NoxB亞基在內生真菌中具有不同的功能[33]。NoxA和NoxB亞基需要Nox調控亞基NoxR和GTP酶結合蛋白RacA的激活，RacA和NoxR通過質膜和內膜催化亞基與NoxA或NoxB形成多酶復合物，催化轉換O2超氧(O2-)[33,35]；同時Nox復合體也需要極性蛋白BemA將其定位至內生真菌菌絲進行形態(tài)分化和生長的位點[37]。RacA受Cdc24和PAK調控，Cdc24可能是一種鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)，PAK是P21活化激酶，PAK將抑制RacA的RhoGDI蛋白進行磷酸化，從而將RacA解離，解離后的RacA被GEF(Cdc24)激活，使GDP轉化為GTP，從而發(fā)揮RacA對Nox復合體的調控作用(圖2)。而有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路也可以調控Nox酶活性，編碼壓力激活MAPK的sakA基因的缺失也會導致互惠共生關系破壞，寄主矮化和早熟(表1)[31]，ROS含量增加，但是noxA和noxR基因表達不受影響，說明MAPK在轉錄后水平調控Nox復合體活性[38]。

2.2 鈣離子(Ca2+)信號通路

Ca2+是細胞內普遍使用的信號轉導因子，作為第二信使調控鈣靶蛋白進行信號轉導。Ca2+信號通路能夠與ROS信號途徑進行互作，很多ROS產生依賴于鈣離子信號，Nox酶直接受鈣信號調控[39]。ROS可能會激活鈣離子通道，可能通過調節(jié)鈣離子在胞質內外的流動影響鈣離子信號通路[40]。鈣調蛋白是一種鈣離子應答蛋白，在真核細胞內普遍存在，其與鈣離子結合形成活化的復合體，活化下游酶類，構成復雜的鈣信號轉導系統(tǒng)，從而啟動基因表達與細胞生命活動[41]。激活鈣調蛋白的激酶和磷酸酶是寄主與病原真菌反應中必不可少的[42]。內生真菌E.festucae菌株的cmkA，cmkB和cmkC基因編碼多功能的鈣調蛋白激酶，基因cnaA編碼鈣依賴蛋白磷酸酶(calcineurin)催化亞基，通過比較3個基因分別缺失的菌株與野生型菌株的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)激活鈣調蛋白的激酶cmkA，cmkB和cmkC基因的缺失并不影響內生真菌的ROS產量和與寄主建立互惠共生關系[43]。鈣依賴蛋白磷酸酶進行各種蛋白的去磷酸化，參與多種受Ca2+信號轉導途徑，對維持內生真菌與寄主互惠共生作用至關重要，基因cnaA缺失嚴重破壞了互惠共生關系，寄主產生過敏致死反應(表2)[43]。雖然其他真菌的研究表明ROS信號途徑與Ca2+信號通路能相互調控[44]，但是內生真菌中二者如何相互作用尚不確定。

圖2 真菌Nox復合體激活途徑的設想[34]Fig.2 A proposed scheme for the activation of fungal Nox complexes including NoxA and NoxB RacA和NoxR通過質膜和內膜催化亞基的NoxA或NoxB形成多酶復合物，催化轉換O2超氧(O2-)。通過自我催化或細胞壁超氧化物歧化酶的催化，高活性的活性氧迅速轉化為過氧化氫(H2O2)。活性氧有可能直接作用于真菌細胞壁，或直接作用于質膜受體或離子通道以激活內部信號通路?；蛘?，膜溶性的過氧化氫首先穿過細胞膜然后激活信號轉導通路。虛線框顯示的通過與已知哺乳動物Nox比較，推測的Nox復合體調控者。適配器蛋白BemA，可能與哺乳動物p40phox蛋白具有相同功能，參與了p67phox同源物NoxR亞基的招募。p38 MAPK同源蛋白SakA通過亞基NoxR調控Nox復合體活性。 P21活化激酶(PAK)可能誘導RacA從抑制蛋白RhoGDI中解離。Rac隨后被一個鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)激活導致GDP 轉化為GTP。 RacA and NoxR form a multi-enzyme complex with the integral membrane catalytic subunit NoxA or NoxB which catalyses the conversion of O2 to superoxide (O2-). With spontaneous dismutation or a cell wall SOD (superoxide dismutase) catalytic activity, highly reactive ROS will be rapidly converted to hydrogen peroxide (H2O2). These ROS have the potential to activate internal signalling pathways by acting directly on the fungal cell wall or directly on the plasma membrane receptors or ion channels. Alternatively, the membrane-soluble H2O2 may first diffuse across the membrane, and then activate signalling pathways. The predicted regulators of the Nox complex are shown in dashed boxes. The adapter protein BemA, has similar function with p40phox protein in mammal, may be involved in the recruitment of the p67phox homologue, NoxR. The p38 MAPK homologue SakA may regulate the Nox complex via interaction with NoxR. A p21-activated kinase (PAK) may induce the dissociation of RacA from the inhibitor protein, RhoGDI. Rac is subsequently activated by a guanine nucleotide exchange factor (GEF) causing exchange of GDP for GTP.

2.3 cAMP信號通路

cAMP是一種普遍的信號通路，又稱為PKA系統(tǒng)(蛋白激酶A系統(tǒng)，protein kinase A system)，是通過細胞外信號與相應受體結合，調節(jié)細胞內第二信使cAMP的水平變化，cAMP特異地活化cAMP依賴的蛋白激酶，使下游靶蛋白磷酸化，改變這些蛋白的活性，從而調節(jié)細胞功能。cAMP的水平變化主要靠腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase)[45]。該信號通路是真菌侵染寄主產生致病性必需的，而內生真菌E.festucae的腺苷酸環(huán)化酶基因(acyA, adenylate cyclase gene)的缺失破壞了cAMP級聯(lián)反應，使菌絲生長從協(xié)同生長變得雜亂無序(表3)，表明cAMP級聯(lián)反應也是維持互惠共生所必須[46]。

2.4 細胞壁完整性(cell-wall integrity，CWI)有絲分裂原活化蛋白(mitogen-activated protein，MAP)激酶(MAPK)級聯(lián)信號途徑

Ca2+梯度與特殊質膜鈣離子通道激活與鈣離子信號產生的機械壓力有關，決定了內生真菌胞間擴展的位點。這樣的調控機制需要細胞壁結構彈性的動態(tài)變化和細胞壁完整(cell-wall integrity，CWI)的(mitogen-activated protein，MAP)激酶(MAPK)信號途徑。MAPK是存在于細胞信號轉導途徑中關鍵的蛋白激酶。MAPKKK(mitogen-activated protein kinase kinase kinase)-MAPKK (mitogen-activated protein kinase kinase)-MAPK (mitogen-activated protein kinase)組成的三酶級聯(lián)反應調控MAPK的活性，MAPK的激酶(MAPPK)是一種雙重特異蛋白激酶，能磷酸化其唯一底物MAPK使之激活，而激活的MAPK是蛋白激酶磷酸化級聯(lián)反應中最重要的組分，該級聯(lián)途徑激活轉錄因子，從而調控下游一系列基因表達，產生對外界信號的響應[47-48]。CWI-MAPK途徑通過調控細胞壁形成基因、細胞周期基因等基因的表達調控細胞壁的形態(tài)建成及介導細胞與外界環(huán)境之間的反應[49-50]。E.festucae菌株中的基因mkkA和mpkA分別編碼CWI-MAPK途徑中重要酶MkkA和MpkA，激活下游轉錄因子，從而誘導脅迫條件下細胞周期和細胞壁的變化。該途徑通常與真菌菌絲融合，孢子產生，附著胞形成，感染植物和子實體形成等細胞發(fā)育階段有關。而基因mkkA和mpkA缺失的E.festucae突變體菌株菌絲不能融合，產生一系列畸形結構，而與寄主共生時使共生體早衰死亡(表4)[51]，這些結果證明CWI-MAPK信號途徑對維持互惠共生作用非常重要。

上述提到的4種信號通路分別或者協(xié)同啟動細胞各種信號傳遞途徑，構成一個復雜的信號網絡系統(tǒng)。在后3種信號途徑中，雖然Ca2+途徑以Ca2+為第二信使，cAMP途徑以cAMP為第二信使，而MAPK級聯(lián)信號途徑則以MAPKKK-MAPKK-MAPK三級激酶為模式，但是這3種信號途徑最終都需要蛋白激酶和蛋白磷酸酶的催化作用調節(jié)下游靶蛋白活性，從而調節(jié)細胞活性和功能。但是這3種信號途徑是否相互作用以及如何相互關聯(lián)與ROS信號途徑共同控制內生真菌與寄主的互惠共生仍然是需要值得深入研究的方向。

3 維持內生真菌與寄主互惠共生的胞間調控因子

除了上述4種信號途徑，還有一些其他調控因子對維持互惠共生關系也是非常重要的(表5)。內生真菌僅在寄主胞間生存，并且內生真菌沒有像其他真菌一樣的吸器或者叢枝一樣的結構從寄主獲取營養(yǎng)，必須從質體外空間直接吸收營養(yǎng)或者通過菌絲與其粘附細胞進行營養(yǎng)轉運。質體外空間條件及離子變化對內生真菌的生長至關重要。

3.1 胞外嗜鐵素A調控鐵離子平衡

鐵離子是質體外空間中一種最關鍵的成分，是所有真核生物進行DNA合成和呼吸作用等一系列代謝反應必不可少的微量元素[58]。但是自由鐵離子能調控產生具有細胞毒害作用的ROS，而微生物通過精密的鐵離子吸收系統(tǒng)以獲得自身所需鐵離子，調控鐵離子的穩(wěn)態(tài)平衡。內生真菌利用鐵通透酶介導的還原性鐵吸收系統(tǒng)(reductive iron assimilation, RIA)或直接通過嗜鐵蛋白進行鐵離子吸收[5]。利用嗜鐵蛋白進行鐵離子吸收需要分泌嗜鐵蛋白(可螯合三價鐵離子的低分子量蛋白)。內生真菌產生兩種不同功能的嗜鐵蛋白-Epichloёnin A和鐵色素型的鐵菌素(ferricrocin)，在細胞間進行鐵離子的貯存和轉運，Epichloёnin A是具有獨特結構的鐵色素型嗜鐵蛋白，在細胞內和細胞外同時存在，而鐵菌素只在細胞內存在。非核糖體多肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases，NRPS)是合成嗜鐵蛋白的關鍵酶。而NRPS基因sidN編碼的SidN合成Epichloёnin A，sidC編碼的SidC合成鐵菌素。sidN基因缺失的突變體導致與寄主共生關系由互惠性向拮抗性轉換，是由于該菌株缺乏Epichloёnin A，破壞了鐵離子的穩(wěn)態(tài)平衡，過量的自由鐵離子催化具有細胞毒性的ROS，寄主細胞中ROS水平升高，破壞了內生真菌與寄主的ROS調控途徑，對寄主有害，寄主中與抑制鐵離子相關基因顯著上調。而sidC基因缺失菌株對共生關系則無影響，表明細胞內鐵菌素對調控內生真菌鐵離子平衡并不重要，而在細胞內和細胞外同時存在的嗜鐵蛋白-Epichloёnin A對鐵離子吸收和貯存以及維持互惠共生有重要作用[53]。

3.2 胞間pH調控

寄主質體外空間在調控植物細胞營養(yǎng)，離子平衡和激素水平等方面發(fā)揮著重要作用，胞間pH值變化受環(huán)境條件的調控會影響細胞功能[54]。內生真菌在胞間生存，必須能感應并響應胞間pH變化。而對已失去互惠共生關系的noxA，proA和sakA基因缺失菌株轉錄組研究發(fā)現(xiàn)感應pH變化的Pal通道中的鋅指(zinc finger)蛋白轉錄因子PacC的調控基因pacC上調，表明PacC對維持互惠共生關系非常重要。但是pacC基因缺失菌株僅提高了菌株對鹽脅迫的敏感，并不影響與寄主的互惠共生，而該基因過量表達的菌株在寄主中形成畸形卷曲的菌絲結構，菌絲多被破壞，而寄主分蘗數(shù)增多，說明pacC過量表達影響了內生真菌與寄主間信號通路，造成植物表型改變[54]。但是PacC如何維持胞質外pH，pH如何干擾內生真菌與寄主間信號通路有待于進一步研究。

3.3 菌絲胞間生長融合相關基因

菌絲結合或者營養(yǎng)菌絲的融合使菌絲間構建了完整的菌絲網。內生真菌在寄主細胞間協(xié)同生長構成菌絲網，其中菌絲融合相關基因soft(so)發(fā)揮了重要作用，E.festucae中so基因的缺失使該菌株菌絲不能結合，與寄主形成共生體時使寄主細胞變性、解體，進而造成寄主死亡[55]。而上述提到的使互惠共生關系喪失的noxA，noxR，proA基因缺失菌株也同時喪失了菌絲結合能力，這就說明了菌絲結合對互惠共生的維持具有重要作用。so基因的缺失并不引起菌絲過度增殖，但是對寄主生長更具破壞作用，這可能是so基因除了控制菌絲結合，在維持互惠共生中還具有非常重要的其他未知作用。

除了上述基因，還發(fā)現(xiàn)ezhB和clrD基因分別編碼組蛋白H3K27和H3K9甲基轉移酶，從而催化組蛋白H3K27和H3K9甲基化，參與異染色質形成及基因轉錄調控。proA基因編碼鋅指蛋白轉錄調控因子，調控esdC(編碼肝糖原結合蛋白)和esdC基因的反方向轉錄基因EF320。這些基因缺失也造成互惠共生關系的喪失，說明在染色體水平調節(jié)內生真菌在寄主中基因轉錄的變化對維持互惠共生非常重要[56]。另外內生真菌在寄主細胞胞間生長還需要真菌進行細胞骨架的重組，包括微管和肌動蛋白絲的重組和囊泡轉運重定向，而解釋這些變化發(fā)生的分子和細胞機制仍是值得挑戰(zhàn)的領域。

雖然利用轉基因技術，已經對上述多個基因進行了研究，但是這些基因如何綜合作用控制真菌與寄主的互惠共生關系，到底有多少信號途徑參與了內生真菌與寄主間信號交流仍不確定。而基因組學的發(fā)展為全面評估內生真菌與寄主間基因變化提供了技術條件，比如Dupont等[59]利用高通量RNA測序技術比較E+和E-植株轉錄組的差異，發(fā)現(xiàn)內生真菌的感染E+植株有1/3以上的基因表達發(fā)生變化，這與寄主與病原真菌反應類似，其中一半基因是初級代謝產物，次生代謝物以及脅迫相關基因。初級代謝產物基因下調而次生代謝物基因上調，說明內生真菌感染改變了寄主植物代謝物合成，改變了植物的代謝進程，使更多底物向次生代謝物合成方向發(fā)生改變，以此為代價，寄主植物發(fā)育變緩。細胞壁合成受到影響，雖然細胞壁合成基因上調，但是寄主細胞壁變薄，而真菌菌絲粘附部位加厚。而脅迫相關基因表達發(fā)生不同程度的變化，比如抗旱相關基因下調，滲透調節(jié)物質基因和毛狀體合成上調，說明內生真菌感染調控寄主通過滲透調節(jié)避旱，并增加毛狀體和氣孔閉合以維持濕度，通過這些方式增加寄主的抗旱能力。而利用類似方法比較noxA,proA和sakA基因缺失3個菌株和野生型菌株之間轉錄組的表達，發(fā)現(xiàn)3個突變菌株中有182個基因表達變化一致，說明E.festucae菌株這182個基因維系共生關系。這些基因與營養(yǎng)饑餓反應相關，包括編碼降解酶類、轉運蛋白、初級代謝產物等基因表達上調，而包括編碼特定的小分子分泌蛋白和次生代謝相關酶類的相關基因表達下調。這些調控基因的變化說明失去互惠共生作用的突變體導致了寄主植物營養(yǎng)物質和細胞壁等降解，突變菌株從植物中獲得大量的營養(yǎng)物質，向致病菌轉化，由互惠共生轉變?yōu)榧纳P系[60]。但是從這些例子可以看出，內生真菌和寄主相互調控基因表達，發(fā)生變化的基因數(shù)目較多，闡明這些基因間的關聯(lián)以及如何受到信號調控還是現(xiàn)在的難點。

4 展望

確定激活ROS表達和次生代謝物合成的信號轉導途徑以及進行信號轉導的相關載體和植物代謝物，對更好地控制菌絲協(xié)同生長和調控次生代謝物的合成以維持內生真菌與寄主的互惠共生關系非常重要。內生真菌僅在植物細胞外存在，利用蛋白組學和基因組學僅比較E+和E-植株細胞外化合物的差異將有助于確定內生真菌與寄主信號途徑中的化合物和蛋白。分析質體外蛋白質和代謝物將會更好地理解內生真菌的營養(yǎng)需求和細胞信號轉導機制。比如通過比較E+和E-植株之間，細胞質和分泌成分之間蛋白組學的差異，發(fā)現(xiàn)了真菌Cu/Zn superoxide dismutase(SOD)可能保護內生真菌免受氧脅迫。而E+植株中較高含量的病原相關蛋白PR10則表明內生真菌激發(fā)寄主準備防御反應[61]。

內生真菌菌絲緊密黏合在植物細胞壁上與寄主進行營養(yǎng)和信號交流，真菌與寄主接觸的質膜上的蛋白和化合物可能包含一系列響應植物信號的受體和轉運體，利用轉錄組和代謝組學技術僅分析該部位的化合物將會更好地解釋內生真菌與寄主之間的信號通路。同時，利用同位素示蹤技術追蹤內生真菌和寄主間的離子交換過程，將有助于解釋二者信號交流如何調控代謝物的交換。

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Signaling in the mutualistic symbiotic interaction between endophytes and their hosts

TIAN Pei*, NAN Zhi-Biao

StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China

Symbioses between fungi and plants have occurred naturally and widely during long-term evolution. This relationship makes both fungi and plants more adaptable to environmental changes. Endophytes form symbiotic associations with temperate grasses includingFestucaandLoliumspp. The establishment and maintenance of these mutualistic associations involves mutual communication between the endophyte and the host. The growth of these endophytes is strictly intercellular and tightly regulated, and is synchronized with the growth of the host. Using this unique growth pattern, the endophyte does not trigger the host defense response and establishes a precise communication and regulatory pathway with the host. This communication will likely involve many well-known signaling pathways. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades and second messenger signaling pathways involving cAMP and calcium are the main pathways for signal transduction. Here, we review the endophyte growth pattern in the host, and discuss research on the genes involved in signaling pathways between the endophyte and host using modern molecular technologies. The information gained so far can be used to predict the possible functions of these pathways in endophyte associations, and provides a reference for further in-depth analyses of the communication network between the endophyte and the host.

endophyte; host; mutualistic; reactive oxygen species (ROS); signalling pathways

10.11686/cyxb2016176

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-04-21；改回日期：2016-06-07基金項目：國家基礎研究發(fā)展規(guī)劃“973”(2014CB138702)，國家自然科學基金項目(31502001)和中央高校基本科研業(yè)務費(lzujbky-2016-9)資助。作者簡介：田沛(1979-)，女，河南新鄭人，副教授，博士。E-mail: tianp@lzu.edu.cn*通信作者Corresponding author.

田沛, 南志標. 內生真菌與寄主互惠共生的分子機制. 草業(yè)學報, 2017, 26(4): 196-210.

TIAN Pei, NAN Zhi-Biao. Signaling in the mutualistic symbiotic interaction between endophytes and their hosts. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(4): 196-210.