田平，孫利利，董海波，田靖，端木永前，陶詩煜，倪迎冬(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物生理生化重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

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飼喂高精料日糧對泌乳期山羊泌乳性能及抗氧化能力的影響

田平，孫利利，董海波，田靖，端木永前，陶詩煜，倪迎冬*
(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物生理生化重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

為了研究長期飼喂高精料日糧對泌乳期山羊泌乳性能和乳腺組織抗氧化能力的影響，實(shí)驗(yàn)選用12只健康經(jīng)產(chǎn)泌乳中期關(guān)中奶山羊，隨機(jī)分為兩組，分別飼喂精粗比為35∶65(低精料組, LC,n=6)和65∶35(高精料組, HC,n=6)的日糧。實(shí)驗(yàn)期共10周，實(shí)驗(yàn)期間采集羊奶與血液；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用靜脈注射的方法對山羊進(jìn)行安樂死，隨后采集乳腺組織并迅速置于液氮中速凍后保存于-70 ℃待測。結(jié)果顯示,HC組山羊乳產(chǎn)量顯著高于LC組(P<0.01)，同時乳中乳糖，乳蛋白的比例隨著泌乳時間的增加而顯著升高。與LC組山羊比較，HC組山羊乳腺組織中SREBP1和GLUT1 mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05);磷酸化AKT1蛋白表達(dá)呈下降趨勢(P=0.08)；除此之外，HC組山羊乳腺組織的總抗氧化能力T-AOC(P=0.06)和GSH酶活均呈下降趨勢(P=0.08)。這些結(jié)果表明，長期飼喂高精料日糧可降低乳腺組織的抗氧化能力，同時可降低乳中乳脂率以及乳腺組織中SREBP-1和P-AKT的表達(dá)。

高精料日糧；泌乳性能；抗氧化；乳腺；山羊

近年來，我國奶業(yè)得到了快速發(fā)展，為消費(fèi)者提供了優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)來源。但奶業(yè)發(fā)展過程中也出現(xiàn)了較多的問題，尤其是乳品質(zhì)較低的問題。為了滿足奶牛高產(chǎn)奶的能量需求，通常在飼料里添加大量的精飼料，這在一定時期和一定程度上提高了奶產(chǎn)量，但高精料極易引發(fā)瘤胃酸中毒和腸道的異常發(fā)酵，引起代謝病的發(fā)生從而降低了奶牛的產(chǎn)奶性能。以往的資料表明，長期飼喂高精料日糧導(dǎo)致血液皮質(zhì)醇的升高及胃腸道內(nèi)毒素LPS(lipopolysaccharide LPS)含量的顯著增加，后腸(結(jié)腸和盲腸)黏膜結(jié)構(gòu)的完整性和屏障功能受損[1]。黏膜上皮組織尤其是后段腸道單層黏膜上皮細(xì)胞受損后，LPS易從消化道遷移到血液中，引起全身性的炎癥反應(yīng)[1]。

在較少的成型組織中，乳腺是仍能夠在正常生長發(fā)育過程中強(qiáng)烈誘導(dǎo)脂肪合成的器官之一，乳腺內(nèi)脂肪酸合成對乳脂含量和乳產(chǎn)量具有重要作用[2]。乳脂的合成主要受膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins, SREBP)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。葡萄糖是乳糖合成的前體，通過維持乳的滲透壓來控制乳產(chǎn)量。乳腺內(nèi)的葡萄糖吸收對乳產(chǎn)量具有重要的調(diào)節(jié)作用。哺乳動物細(xì)胞膜的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體主要有葡萄糖運(yùn)輸載體家族蛋白(glucose transporters, GLUT)和鈉離子依賴葡萄糖運(yùn)輸載體蛋白(sodium-dependent glucose transport carrier protein, SGLT)，其中GLUT1是泌乳期乳腺細(xì)胞膜上主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體[3]。絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine-threonine kinase, AKT)是多種信號調(diào)節(jié)的下游信號分子，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。此外，AKT1還具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)[4-7]和脂質(zhì)合成[8-11]的作用。AKT1在調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和部分脂生成方面起著重要的作用[12]。已有研究表明，AKT蛋白激酶在乳腺發(fā)育階段，尤其是在妊娠和泌乳期顯著上調(diào)，參與泌乳期乳合成的調(diào)節(jié)[13]。

動物機(jī)體在正常生理狀態(tài)下也會有自由基的產(chǎn)生，但體內(nèi)同時存在著高效和完善的清除自由基系統(tǒng)。體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除處于一種動態(tài)平衡，若平衡被打破即會引起機(jī)體的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞。然而，長期飼喂高精料對泌乳期山羊乳腺組織抗氧化能力的影響卻少有報道。本研究以泌乳中期奶山羊?yàn)閯游锬Ｐ?，旨在研究長期飼喂高精料日糧對其泌乳性能、乳腺抗氧化能力、乳脂合成的影響及相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

TRIzol Reagent購自上海英俊生物技術(shù)有限公司；Ex TaqTM購自Takara 公司；冷凍離心機(jī)(Allegra TM64R,BECKMAN COULTERTM,美國);組織勻漿器；PCR儀(STRATAGENE,美國)；酶標(biāo)儀(Synergy2，Biotek，美國)；NanoDrop TM1000 (Thermo Scientific，美國)。

1.2 試驗(yàn)動物與飼養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)于2013年5月開始，選取12只2～3胎次的泌乳中期關(guān)中奶山羊，體重(49.7±5.5) kg，2周自由采食飲水過渡期。之后隨機(jī)分為兩組，飼喂精粗比為35∶65(低精料組，LC)和65∶35(高精料組，HC)的日糧[由羊草(Leymuschinensis)、苜蓿(Medicagosativa)和精料組成]，自由飲水。飼喂10周后屠殺山羊，取樣。飼料營養(yǎng)成分同以往的研究報道[1]。

1.3 樣品處理與分析測定

1.3.1 樣品總RNA提取和cDNA的制備 稱取100 mg左右的乳腺組織，用Trizol方法提取總的RNA，每個樣品每次取2 μL，用Nano Drop分光光度計檢測RNA濃度(260/280=1.8～2.0)，2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA質(zhì)量，-70 ℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄酶體系及Tap酶為Promega產(chǎn)品，SYBR購自TaKaRa公司。引物采用Primer 5.0軟件自行設(shè)計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物見表1。PCR的反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min, 95 ℃變性30 s,64 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共40個循環(huán)。實(shí)時熒光定量分析采用2-ΔΔCT法，以內(nèi)標(biāo)基因GAPDH為參照，計算目的基因轉(zhuǎn)錄的相對量，通過以下公式計算出每一個樣本的ΔΔCT值，最后每一個樣本值以2-ΔΔCT 表示，X表示任意一個樣本，公式如下：ΔΔCT=(CT·目的基因-CT·內(nèi)參基因)x-(CT·目的基因-CT·內(nèi)參基因)control。

表1 目的基因序列Table 1 The primer sequences of the target genes

F:上游引物 Forward primer; R:下游引物Reverse primer.GAPDH: 甘油醛-3-磷酸脫氫酶Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;FASN:脂肪酸合酶Fatty acid synthase;FABP4:脂肪酸結(jié)合蛋白4 Fatty acid binding protein 4;SCD:硬脂酰脫氫酶 Stearoyl-CoA desaturase；PPARG:過氧化物酶增殖物激活受體-γ Peroxisome proliferator-activated receptor gamma;SREBP1:固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1 Sterol regulatory element-binding protein 1;LPL:脂蛋白脂肪酶Lipoprotein lipase；GLUT1:葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 Glucose transport 1；GLUT8:葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8 Glucose transport 8;SGLT1:鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1 Sodium-glucose cotransporter 1.

1.3.2 組織總蛋白提取 蛋白酶抑制劑混合片(Roche，4693132001)，購于上海羅氏制藥有限公司；BCA蛋白測定試劑盒(Thermo，23225)，購于南京生興生物技術(shù)有限公司，NC膜(PALL，T91375)，購于巴傲得生物科技有限公司；Pierce發(fā)光檢測試劑盒(Thermo，NC15080或34076)，購于南京生興生物技術(shù)有限公司。

從-80 ℃冰箱取出乳腺組織，稱取100 mg左右，按1∶10(w∶v)加入冰浴的RIPA(radio immuno precipitation assay buffer，RIPA裂解液)總蛋白裂解液；用勻漿器勻漿組織冰上靜置10 min后，12000 r/min離心，4 ℃，20 min，取上清。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白統(tǒng)一用蛋白裂解液稀釋至合適的濃度，變性，-80 ℃冰箱儲存。上樣量60 μg，分離膠10%，濃縮膠4%，電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上，之后室溫封閉2 h，接著一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST洗膜5 min 6次，再用二抗室溫孵育2 h，1×TBST洗膜5 min 6次，最后，用Pierce發(fā)光試劑盒和Versa DocTM imaging system成像系統(tǒng)，檢測蛋白條帶，并用Quantity One Software軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.3.3 氧化應(yīng)激酶活的測定 山羊總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)，還原型谷胱甘肽(reduced glutathione tablets，GSH)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)采用酶聯(lián)免疫分析進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單變量雙因素分析，主效應(yīng)分別為日糧處理和泌乳時間；用ANOVA進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精料比日糧對乳產(chǎn)量及乳成分的影響

由表2可見，與LC組相比，高精料日糧極顯著提高了奶山羊的產(chǎn)奶量(P<0.01)，但對乳中乳糖、乳脂和乳蛋白的比例沒有顯著影響(P>0.05); 泌乳時間對奶山羊乳中乳糖和乳脂的比例有顯著影響(P<0.05)，但對乳產(chǎn)量及乳中乳蛋白的比例無顯著影響(P>0.05)。在對乳產(chǎn)量及乳中乳糖、乳脂、乳蛋白比例的影響上，泌乳時間和飼喂日糧之間沒有明顯的互作效應(yīng)(P>0.05)。

表2 不同精粗比日糧對乳成分含量的影響Table 2 Effect of different concentrate diet ratio on milk yields and milk components percentage

LC:低精料組Low concentrate; HC:高精料組 High concentrate；下同The same below.

2.2 不同精粗比日糧對乳腺乳脂和乳糖合成關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

如圖1所示，與LC組相比，HC組山羊乳腺組織中SREBP1 mRNA 的表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)，但FASN、FABP4、SCD、PPARG和LPL基因表達(dá)無顯著變化(P>0.05)。此外，在HC組乳腺中GLUT1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05), 但GLUT8和SGLT1基因表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。提示高精料日糧可通過影響SREBP1以及GLUT1的表達(dá)水平來調(diào)節(jié)乳脂和乳糖在乳中的百分比。

圖1 不同精粗比日糧對乳脂及乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.1 Effect of different concentrate diet ration on genes expression involved milk fat synthesis and lactose transport *表示組間差異顯著(P<0.05),**表示組間差異極顯著(P<0.01)。 * means significant (P<0.05) and ** means markedly significant (P<0.01) difference between two groups.

2.3 不同精粗比日糧對乳腺脂代謝相關(guān)蛋白和AKT1蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與LC組相比，HC組山羊乳腺組織中SREBP1和SCD1的蛋白表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)，但磷酸化AKT1的蛋白表達(dá)水平(圖3)呈現(xiàn)出下降的趨勢(P=0.08)。

2.4 不同精粗比日糧對乳腺組織抗氧化能力的影響

如表3所示，與LC組相比，HC組山羊乳腺組織中T-AOC和GSH酶活均呈現(xiàn)下降的趨勢(P>0.05)，而SOD和MDA的含量沒有明顯的變化。說明高精料日糧的飼喂會使乳腺組織的抗氧化能力降低。

圖2 不同精粗比日糧對乳腺組織SREBP1和SCD1蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of different concentrate diet ration on SREBP1 and SCD1 protein expression in mammary gland

圖3 不同精粗比日糧對乳腺組織中AKT1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of different concentrate diet ration on AKT1 protein expression in mammary gland

3 討論

3.1 不同精粗比日糧對乳產(chǎn)量及乳成分的影響

為了滿足奶牛高產(chǎn)奶的需求，生產(chǎn)上常給泌乳期奶牛飼喂高精料日糧，高精料日糧的飼喂可以在短時間內(nèi)提高泌乳期奶牛的產(chǎn)奶量，但對乳品質(zhì)卻會產(chǎn)生不利的影響。Khafipour等[14]報道含有50%的小麥和50%的大麥代替21%的干物質(zhì)，用精粗比為50∶50的日糧飼喂泌乳期奶牛，結(jié)果導(dǎo)致乳產(chǎn)量和乳脂率下降。Dong等[15]的研究表明，用60∶40的高精料日糧飼喂泌乳期奶山羊可以使乳中的乳脂和乳蛋白的比例顯著降低，乳糖的含量顯著升高，且這種趨勢隨著飼喂高精料的時間而愈加明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高精料日糧可使乳產(chǎn)量顯著升高，對乳中的乳糖、乳脂、乳蛋白的比例沒有太大影響，但是如果考慮到日糧和時間因素后，發(fā)現(xiàn)飼喂時間對乳成分有顯著的影響，加入時間因素后，高精料組乳中乳脂的比例隨時間的增加而顯著降低，乳糖，乳蛋白的比例顯著升高；說明高精料日糧的飼喂可以改變泌乳期奶山羊乳成分，使乳品質(zhì)下降。

表3 不同精粗比日糧對乳腺組織抗氧化能力的影響Table 3 Effect of different concentrate diet ratio on the anti-oxidant capacity of mammary gland

3.2 不同精粗比日糧對乳腺乳脂與乳蛋白合成的影響

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子。它與動物體內(nèi)的膽固醇和脂肪的代謝密切相關(guān)[16-17]。李楠[18]和許會芬等[19]采用乳腺上皮細(xì)胞SREBP1過表達(dá)的方法對其功能進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，在SREBP1過表達(dá)后，乳脂合成相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著升高，說明SREBP1在乳脂合成過程中起重要的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高精料組SREBP1的基因表達(dá)水平顯著降低。另外，還發(fā)現(xiàn)乳腺中SREBP1和SCD1的蛋白表達(dá)水平也有所下降。這進(jìn)一步解釋了高精料日糧組乳中乳脂率降低的原因。

絲氨酸-蘇氨酸激酶AKT1是乳腺上皮細(xì)胞在泌乳階段新陳代謝反應(yīng)中重要的激酶，能夠促進(jìn)GLUT1遷移到細(xì)胞膜從而上調(diào)葡萄糖的吸收，并能誘導(dǎo)乳腺泌乳的啟動。在乳腺的泌乳階段，AKT1是一個重要的代謝調(diào)節(jié)器[9]。在乳腺發(fā)育的妊娠和泌乳階段AKT1顯著上調(diào)。Lin等[20]采用siRNA干擾的方法發(fā)現(xiàn)，對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中AKT1基因表達(dá)進(jìn)行抑制之后，細(xì)胞中GLUT1，HK1等與乳糖合成相關(guān)的基因表達(dá)水平顯著降低，表明AKT1與乳糖合成密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HC組，P-AKT1的蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢，而GLUT1的基因表達(dá)顯著降低。說明高精料日糧通過抑制AKT1的表達(dá)，進(jìn)而影響乳腺上皮細(xì)胞對葡萄糖的吸收，從而對乳糖合成產(chǎn)生影響。

3.3 不同精粗比日糧對乳腺組織抗氧化能力的影響

正常情況下，機(jī)體受到細(xì)胞內(nèi)一些抗氧化酶的保護(hù)，如SOD(超氧化物歧化酶)，GSH(谷胱甘肽過氧化物酶)，CAT(過氧化氫酶)，在與金屬催化劑反應(yīng)前能夠形成更多的反應(yīng)復(fù)合物來消除超氧化物和過氧化物這些有毒物質(zhì)[21]，維持體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，從而保證機(jī)體不受自由基的破壞，保持生命活動的正常運(yùn)行。Celi[22]報道，當(dāng)體內(nèi)H2O2產(chǎn)量增加時，抗氧化酶CAT，GPx和谷胱甘肽的活性就會同時增加，從而消除自由基對機(jī)體的損傷。目前的結(jié)果表明，在高精料日糧組，乳腺組織的T-AOC和GSH的含量有下降趨勢，表明在高精料組乳腺組織的抗氧化能力要弱于對照組，進(jìn)一步揭示了長期飼喂高精料日糧可能會降低乳腺組織的抗氧化能力。

綜上所述，長期飼喂高精料日糧可以提高乳產(chǎn)量，長期飼喂高精料日糧可使乳腺組織乳脂，乳糖合成相關(guān)基因表達(dá)水平下降，可能是乳成分下降的原因之一；另外，長期飼喂高精料日糧使乳腺組織的抗氧化能力下降可能提示對機(jī)體健康的潛在威脅。

4 小結(jié)

長期飼喂高精料日糧在一定時期內(nèi)可提高泌乳期奶山羊的奶產(chǎn)量，但會使其乳脂率降低，泌乳性能下降，乳品質(zhì)降低；同時可能會使乳腺組織的抗氧化能力減弱。

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Effects of feeding high concentrate diets on lactation indicators and antioxidant levels in the mammary glands of lactating goats

TIAN Ping, SUN Li-Li, DONG Hai-Bo, TIAN Jing, DUANMU Yong-Qian, TAO Shi-Yu, NI Ying-Dong*

KeyLaboratoryofAnimalPhysiologyandBiochemistry,MinistryofAgriculture,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China

The effect of feeding high concentrate diets for extended periods on lactation indicators and antioxidant potential in the mammary glands of lactating goats, 12 health multiparous guanzhong goats in mid lactation were randomly allocated to two groups; one group receiving diets with low concentrate (concentrate∶roughage 35∶65) as the LC group (n=6), and another receiving high concentrate diet (concentrate∶roughage 65∶35) as the HC group (n=6). The experimental lasted for 12 weeks. At the end of the experiment, goats were slaughtered after overnight fasting. All goats were killed with neck vein injections of xylazine and pentobarbital. Mammary glands and other tissues were sampled and quickly placed in liquid nitrogen and stored at -70 ℃ for gene and protein expressions analysis. The results showed that milk production was significantly increased by feeding a high-concentrate diet and the percentage of milk lactose, protein and fat was significantly increased with lactation time. The expression of sterol regulatory element-binding protein 1 (SREBP1) and Glucose transport 1 (GLUT1) mRNA was significantly decreased (P<0.05), and AKT1 protein levels tended to be lower (P=0.08) in the HC group compared to the LC group. The HC diet moderately reduced the activity of T-AOC the enzyme (P=0.06) and GSH (P=0.08). These results suggest that feeding high concentrate diets reduced the antioxidant ability and significantly decreased the percentage of milk fat as well as down-regulated SREBP1 and p-AKT expression in the mammary glands.

concentrate to roughage ratio; mammary gland; lactation indicators; antioxidant ability; goats

10.11686/cyxb2016283

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-07-14；改回日期：2016-10-09

國家重大基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃973項(xiàng)目(No.2011CB100802)資助。

田平(1990-)，男，河南南陽人,在讀碩士。E-mail:634035259@qq.com*通信作者Corresponding author. E-mail: niyingdong@njau.edu.cn

田平, 孫利利, 董海波, 田靖, 端木永前, 陶詩煜, 倪迎冬. 飼喂高精料日糧對泌乳期山羊泌乳性能及抗氧化能力的影響. 草業(yè)學(xué)報, 2017, 26(4): 99-105.

TIAN Ping, SUN Li-Li, DONG Hai-Bo, TIAN Jing, DUANMU Yong-Qian, TAO Shi-Yu, NI Ying-Dong. Effects of feeding high concentrate diets on lactation indicators and antioxidant levels in the mammary glands of lactating goats. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(4): 99-105.