尹秀婷，張 泓*，張 健，許 明，劉寄生，林居財(cái)(.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長(zhǎng)沙 4008；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)教研室，湖南 長(zhǎng)沙 4008）

不同時(shí)辰艾灸對(duì)急性胃黏膜損傷模型大鼠EGF及TGF-α的影響

尹秀婷1，張 泓2*，張 健1，許 明1，劉寄生1，林居財(cái)2
(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)教研室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的 觀察不同時(shí)辰艾灸對(duì)急性胃黏膜損傷模型大鼠表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)的影響，探討不同時(shí)辰艾灸對(duì)大鼠急性胃黏膜損傷修復(fù)是否存在差異，期以闡述施灸時(shí)機(jī)對(duì)艾灸療效的影響。方法 40只SD大鼠隨機(jī)分為空白組（A）、模型組（B）、辰時(shí)艾灸組（C）、未時(shí)艾灸組（D）、戌時(shí)艾灸組（E），每組8只，除A組以外，采用無水乙醇灌胃法將其余大鼠制備成急性胃黏膜損傷模型，其中A組、B組不予施灸;余三組選用兩組穴位:（1）“足三里”(雙)“中脘”;（2）“脾俞”(雙)“胃俞”(雙)施溫和灸20 min。各組予以相應(yīng)處理7 d后，取胃組織肉眼下觀察胃黏膜損傷指數(shù)（UI），Elisa法檢測(cè)胃黏膜組織中EGF、TGF-α的含量。結(jié)果 （1）相比于A組，其余各組UI值明顯提高(P＜0.01)；相比于B組，各艾灸組UI值明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)；艾灸組之間比較，C組、E組UI值低于D組(P＜0.05)。（2）與B組相比，各艾灸組胃黏膜EGF、TGF-α含量顯著增加(P＜0.05或P＜0.01)；艾灸組之間比較，C組胃黏膜EGF、TGF-α的含量高于D組、E組(P＜0.05)。結(jié)論 （1）不同時(shí)辰艾灸“足三里”“中脘”“脾俞”“胃俞”對(duì)大鼠急性胃黏膜損傷具有一定的修復(fù)作用，可能是通過提高胃黏膜中EGF、TGF-α的表達(dá)發(fā)揮修復(fù)作用的；（2）以辰時(shí)艾灸組療效最優(yōu)，提示辰時(shí)艾灸存在相對(duì)特異性，部分證實(shí)施灸時(shí)機(jī)對(duì)艾灸效應(yīng)的影響。

時(shí)辰；急性胃黏膜損傷；艾灸；表皮生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α

急性胃黏膜損傷是多種胃疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)[1]，是消化系統(tǒng)的最常見病變之一。大量的臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)針灸有保護(hù)和促進(jìn)胃黏膜損傷修復(fù)的作用[2]。前期研究表明[3-4]，常規(guī)針刺基礎(chǔ)上結(jié)合子午流注針法對(duì)胃黏膜損傷修復(fù)的療效更優(yōu)，提示針刺時(shí)機(jī)是影響療效的重要因素。本項(xiàng)目從時(shí)辰是影響艾灸療效因素的假說為切入點(diǎn)，以急性胃黏膜損傷模型大鼠為研究對(duì)象，通過觀察胃黏膜損傷指數(shù) (ulcer index,UI)與表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)的水平表達(dá)，探討不同時(shí)辰艾灸治療效應(yīng)是否存在差異，以進(jìn)一步闡述施灸時(shí)機(jī)對(duì)艾灸療效的影響，期為臨床艾灸治療胃黏膜損傷性疾病及擇時(shí)艾灸以提高臨床療效提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

40只，雌雄各半，10～12周齡，體質(zhì)量200～250 g，健康Sprague-Dawley大鼠，SPF級(jí)，飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50%～70%，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(湘)2013-0004]。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于本實(shí)驗(yàn)，40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法為空白組（A）、模型組（B）、辰時(shí)艾灸組（C）、未時(shí)艾灸組（D）、戌時(shí)艾灸組（E），每組8只。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》[5]相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例。

1.2 主要試劑與儀器

艾條:李時(shí)珍蘄艾條微煙艾條（規(guī)格：4 mm×10 cm, 100支/盒）；自制艾灸架:用于固定艾條；隔熱材料:薄紙板，再在此板上打一個(gè)直徑為3 mm的小孔，用于暴露穴位處皮膚；16號(hào)灌胃針；EGF、TGF-α酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒，TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙科威實(shí)業(yè)有限公司)；AEU-210電子分析天平(長(zhǎng)沙湘儀天平儀器廠)；PW-812全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（濟(jì)南安暢醫(yī)療設(shè)備有限公司）；MB-530酶標(biāo)儀（濟(jì)南安暢醫(yī)療設(shè)備有限公司）；THZ-C恒溫振蕩器（長(zhǎng)沙強(qiáng)樂有限公司）；Motic B 1顯微鏡(福建麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；OLYMPUS Bx-70顯微鏡成像系統(tǒng) (日本OLYMPUS公司)；圖像分析軟件Image Pro-Plus(美國(guó)Media Cybernetics公司)；石蠟切片機(jī)(美國(guó)820型AO切片機(jī))；10%水合氯醛；0.9%生理鹽水；95%乙醇；10%中性福爾馬林溶液。

1.3 造模方法

空白組大鼠以生理鹽水(0.6 mL/100 g)灌胃，同時(shí)其余各組大鼠以95%無水乙醇灌胃 (0.6 mL/ 100 g)制備成急性胃黏膜損傷大鼠模型。急性胃黏膜損傷大鼠模型造模成功標(biāo)準(zhǔn)[6]:（1）肉眼可見模型組胃體前壁黏膜層見缺損狀病灶,周圍充血水腫,黏膜表面附有出血,胃體部見多處出血、糜爛;（2）在光鏡下模型組大鼠胃黏膜出現(xiàn)明顯破損、脫落、出血、水腫,黏膜下可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.4 治療方法

穴位定位參照李忠仁主編的“十一五”國(guó)家級(jí)規(guī)劃教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位并模擬人體骨度分寸法量取，以胸鎖聯(lián)合和恥骨聯(lián)合連線下1/4與上3/4交點(diǎn)為肚臍。足三里：膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處；中脘：臍與胸骨劍突連線中點(diǎn)，約臍上20 mm處；脾俞：第十二胸椎下，旁開5 mm；胃俞：第十三胸椎下，旁開5 mm。艾灸方法：從急性胃黏膜損傷模型造模后的第1天開始，A組、B組大鼠不予施灸;每天捆綁縛于鼠板約20 min;C組（7:00—9:00）、D組（13:00—15:00)、E組（19:00—21:00）大鼠捆縛固定于鼠板上施灸，選用兩組穴位:（1）“足三里”(雙)、“中脘”;（2）“脾俞”(雙)、“胃俞”(雙)，兩組穴每天交替進(jìn)行。定穴后局部剪毛，用透明膠布把隔熱紙板粘貼覆蓋大鼠局部，自制艾灸架用于固定艾條，使艾條垂直距離大鼠穴位體表2～3 cm，點(diǎn)燃施灸，并隨時(shí)調(diào)整艾條與穴位之間的距離，施灸前用體表溫度計(jì)測(cè)量大鼠表皮溫度，灸后復(fù)測(cè)大鼠表皮溫度，以便觀察記錄。每日1次，每次每穴（點(diǎn)）灸20 min，共7 d。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

治療結(jié)束后第二天將各組大鼠用10%水合氯醛以（3.5 mL/kg）腹腔麻醉。將胃的幽門部和賁門部分別用結(jié)扎線結(jié)扎，在兩結(jié)扎線的兩端切斷食道及十二指腸，摘下全胃。沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗，放在冰塊上用10倍放大鏡肉眼觀察大鼠的胃黏膜損傷情況，參照Guth法[8-9]計(jì)算UI值。Guth法的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)是:斑點(diǎn)糜爛計(jì)1分；糜爛長(zhǎng)度＜1 mm計(jì)2分；糜爛長(zhǎng)度1～2 mm計(jì)3分；糜爛長(zhǎng)度2～3 mm 計(jì)4分；糜爛長(zhǎng)度＞4 mm計(jì)5分；寬度＞1 mm時(shí)分值×2。取胃組織一小塊(5 mm×10 mm)，然后放入40 g/L多聚甲醛中4℃固定，用于HE染色，另取一小塊(10 mm×10 mm)入氮液凍存于-80℃冰箱，用于Elisa法檢測(cè)EGF及TGF-α的表達(dá)。

EGF、TGF-α的含量測(cè)定:嚴(yán)格按酶聯(lián)免疫EGF、TGF-α試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)比較

由表1可見，與A組相比，其余各組UI值顯著升高(P＜0.01)，說明無水乙醇灌胃導(dǎo)致胃黏膜損傷，造模成功;C組、D組、E組UI值明顯低于B組 (P＜0.05或P＜0.01)，說明艾灸能明顯降低胃黏膜損傷指數(shù)，對(duì)胃黏膜有修復(fù)作用；與D組相比，C組、E組UI值呈降低趨勢(shì)(P＜0.05);C組UI值稍低于E組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠UI值的比較 (±s，分)

表1 各組大鼠UI值的比較 (±s，分)

注：與A組比較，**P＜0.01；與B組比較，▲▲P＜0.01,▲P＜0.05；與D組相比，◆P＜0.05。

2.2 艾灸對(duì)急性胃黏膜損傷大鼠胃黏膜 EGF、TGF-α含量的影響

從表2中可知，相比于A組，其余各組胃黏膜EGF、TGF-α含量升高(P＜0.05或P＜0.01)，表明無水乙醇灌胃后，胃黏膜損傷周圍EGF、TGF-α表達(dá)增強(qiáng)；相比于B組，各艾灸組胃黏膜EGF、TGF-α含量明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)；三個(gè)不同時(shí)辰艾灸組之間比較，C組胃黏膜EGF、TGF-α的含量高于D組、E組(P＜0.05)。表明不同時(shí)辰艾灸能提高大鼠急性胃黏膜損傷EGF、TGF-α的含量，且以辰時(shí)艾灸效果最佳。

表2 各組大鼠胃黏膜中EGF、TGF-α含量比較 (±s,n=8，μg/μL)

表2 各組大鼠胃黏膜中EGF、TGF-α含量比較 (±s,n=8，μg/μL)

注：與A組比較，**P＜0.01,*P＜0.05；與B組比較，▲▲P＜0.01,▲P＜0.05；與D組比較，◆◆P＜0.01，◆P＜0.05；與E組比較，●P＜0.05。

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3 討論

急性胃黏膜損傷 （acute gastric mucosal lesion, AGML）是指由于嚴(yán)重創(chuàng)傷、藥物、酒精或辛辣飲食等應(yīng)激性因素所導(dǎo)致的一種急性胃黏膜病變，它以胃黏膜的糜爛、潰瘍甚至出血為主要特征，是消化系統(tǒng)最常見的一種病理變化。它屬于中醫(yī)學(xué)中的“胃脘痛”范疇，其病位在脾胃，與足陽明經(jīng)密切相關(guān),氣血循環(huán)中足陽明胃經(jīng)是多氣多血之經(jīng)，是臨床上治療胃腑病證的首選經(jīng)脈。針灸治療胃黏膜損傷性疾病，俞募配穴和下合穴是常用的取穴方法，胃之下合穴(足三里)，脾之背俞穴(脾俞)，胃之背俞穴(胃俞)和胃之募穴(中脘)這4個(gè)穴位是針灸治療胃黏膜損傷性疾病使用頻率最高的主要穴位[10～12]。艾灸療法作為一種溫?zé)崃夹源碳ぴ?，具有溫?zé)?、溫補(bǔ)、溫通的作用，在促進(jìn)胃黏膜損傷后修復(fù)、防治胃潰瘍性疾病等方面，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

EGF能促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞DNA合成、分裂及細(xì)胞增殖，具有很強(qiáng)的抑制胃酸分泌作用[13]。TGF-α是維持黏膜完整性的重要介質(zhì),它參與內(nèi)皮結(jié)構(gòu)重建，促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖及黏液生成，增加胃黏膜微循環(huán)，在受損胃黏膜修復(fù)及維持完整性中起重要作用[14]。艾灸可通過提高胃組織表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的表達(dá)，兩者均結(jié)合EGFR，激活后的EGFR介導(dǎo)ERK磷酸化從而激活EGFR/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，因而起到保護(hù)胃黏膜、促進(jìn)胃黏膜增殖修復(fù)的作用[15]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示不同時(shí)辰艾灸“足三里”“中脘”“脾俞”“胃俞”均能提高胃黏膜中EGF、TGF-α的表達(dá)水平,說明不同時(shí)辰艾灸“足三里”“中脘”“脾俞”“胃俞”對(duì)大鼠急性胃黏膜損傷都有一定的修復(fù)作用，一定程度上是通過提高胃組織EGF、TGF-α的表達(dá)發(fā)揮作用的。其中以辰時(shí)艾灸組對(duì)急性胃黏膜損傷修復(fù)作用最強(qiáng)，表明施灸時(shí)機(jī)對(duì)艾灸效應(yīng)的影響，提示時(shí)辰可能是影響艾灸效應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制之一。

子午流注法是把時(shí)間因素和針灸施治緊密結(jié)合在一起，著重以擇時(shí)作為針灸施治的主要條件，認(rèn)為不同時(shí)辰機(jī)體氣血盛衰狀況不同，針灸效應(yīng)也不同?！端貑枴め樈狻氛f:“補(bǔ)瀉之時(shí),與氣開闔相合也。”血?dú)鈶?yīng)時(shí)而至為盛，血?dú)膺^時(shí)而去為衰，逢時(shí)而開，過時(shí)為闔。子午流注中“開”是指開放、宣通的意思，經(jīng)氣流注相應(yīng)臟腑時(shí)，刺激與該臟腑密切相關(guān)的腧穴可使氣血宣通暢達(dá)而達(dá)到治療目的。子午流注納支法中與胃腑相對(duì)應(yīng)的時(shí)辰為“辰”時(shí)，此時(shí)氣血流經(jīng)相應(yīng)的經(jīng)脈臟腑，氣血大盛，故選取與胃腑密切相關(guān)腧穴灸之，達(dá)到最佳治療效應(yīng)?？紤]到大鼠是晝伏夜行動(dòng)物，一般認(rèn)為與人的生理節(jié)律相反，所以設(shè)置了“辰”時(shí)的對(duì)應(yīng)時(shí)辰“戌”時(shí)作為對(duì)照時(shí)辰進(jìn)行觀察。至于選擇“未”時(shí)作為對(duì)照觀察時(shí)間點(diǎn)是因?yàn)椤拔础睍r(shí)為“辰”時(shí)和“戌”時(shí)的中間點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)“辰”時(shí)的艾灸治療效應(yīng)優(yōu)于其它兩組，印證了“謹(jǐn)候其時(shí)，病可與期，失時(shí)反候者，百病不治”(《靈樞·衛(wèi)氣行篇》)的經(jīng)典論述。也表明“辰”時(shí)艾灸對(duì)急性胃黏膜損傷的修復(fù)具有相對(duì)的時(shí)辰特異性，說明了施灸時(shí)機(jī)對(duì)艾灸療效有著較為重要的作用，值得臨床重視。至于“戌時(shí)”效應(yīng)相對(duì)較差是否與實(shí)驗(yàn)過程中人為的打亂了動(dòng)物的生理節(jié)律有關(guān)亦或大鼠的生理節(jié)律本來就與人類相一致值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明（1）不同時(shí)辰艾灸“足三里”“中脘”“脾俞”“胃俞”對(duì)大鼠急性胃黏膜損傷具有一定的修復(fù)作用，可能是通過提高胃黏膜中EGF、TGF-α的表達(dá)發(fā)揮修復(fù)作用的；（2）以辰時(shí)艾灸組療效最優(yōu)，提示辰時(shí)艾灸存在相對(duì)特異性，部分證實(shí)施灸時(shí)機(jī)對(duì)艾灸效應(yīng)的影響，其具體內(nèi)涵仍需進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 匡靜之）

Effects of Different Time Moxibustion on EGF and TGF-α in Acute Gastric Mucosal Lesion Model Rats

YIN Xiuting1,ZHANG Hong2*,ZHANG Jian1,XU Ming1,LIU Jisheng1,LIN Jucai2
(1．Graduate School of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Department of Rehabilitation, Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To observe the effect of different time moxibustion on EGF and TGF-α contents in acute gastric mucosal lesion model rats,and to investigate whether differences exsit in different time moxibustion on acute stomach membrane damage repair.To elabrate the effect of moxibustion at different time.Methods 40 SD rats were randonly divided into the control group(group A),model group(group B),moxibution at 7 a.m to 9 a.m group（group C),moxibution at 1 p.m to 3 p.m group (group D),moxibution at 7 p.m to 9 p.m group (group E),eight rats in each group. The gastric mucosal injury rats models besides group A were built by intragastric administration of absolute alcohol.Group A and B were not given moxibustion.The other three groups were treated with mild moxibustion for 20 min at two sets of acupoints,(1)"Zusanli"(two),"Zhongwan",(2)"Pishu"(two),"Weishu"(two).After treatment for 7 d,the UI(gastric mucosal injury index)of gastric tissue was observed under naked eyes.The EGF and TGF-α in gastric tissue were determined by Elisa.Results(1)Compared with group A,the UI index in other groups increased significantly(P＜0.01).Compared with group B,UI index in other groups decreased markedly (P＜0.01 or P＜0.05).The UI of group C and group E was lower than that of group D(P＜0.05).(2)Compared with group B,EGF and TGF-α in the groups increased significantly(P＜0.01 or P＜0.05),while the EGF and TGF-α in group C were higher than that in group D and group E (P＜0.05).Conclusion (1)Different time moxibustion at"Zusanli""Zhongwan""Pishu"and"Weishu"have repairing effect on acute gastric mucosal injury rats,its repairing effect was probably played by up-regulating EGF and TGF-α protein expression. (2)The moxibution at the day of from 7 a.m to 9 a.m shows strongest effect on acute acute gastric mucosal lesion,which demonstrate that there is a relative specificity of different time moxibustion on the effect of moxibustion,partially confirm time on moxibustion effect.

time;acute gastric mucosal lesions;moxibustion;EGF;TGF-α

R245.81

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.03.017

2016-11-13

國(guó)家自然科學(xué)基金（85010001031）；湖南省研究生科研創(chuàng)新課題項(xiàng)目（0141-090100200311）。

尹秀婷，女，在讀碩士研究生，主要研究方向：針灸治病機(jī)理研究 。

*張 泓，男，教授 ，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:zh5381271@sina.com。

本文引用：尹秀婷，張 泓，張 健，許 明，劉寄生，林居財(cái).不同時(shí)辰艾灸對(duì)急性胃黏膜損傷模型大鼠EGF及TGF-α的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（3）：294-297.