蘇 靖，劉守金*，朱晶晶，朱玉蕓,(.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 30000；.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 0070）

中藥菊花過(guò)氧化物酶酶學(xué)特性及炮制工藝的研究

蘇 靖1，劉守金1*，朱晶晶2，朱玉蕓1,2
(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230000；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 10070）

目的 探討中藥菊花過(guò)氧化物酶酶學(xué)特性及炮制工藝。方法 以愈創(chuàng)木酚為底物,采用分光光度法測(cè)定菊花過(guò)氧化物酶的酶學(xué)特性，并比較不同加工工藝下菊花過(guò)氧化物酶學(xué)特性及總黃酮含量。結(jié)果 菊花反應(yīng)時(shí)間不宜超過(guò)2 min,最適pH 7.0,最適溫度36℃,100℃處理30 s后，過(guò)氧化物酶活性完全喪失。過(guò)氧化物酶催化的酶促褐變反應(yīng)動(dòng)力學(xué)符合米氏方程，動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km=1.58×10-2mol/L,Vmax=14.278 U/min。四種炮制工藝比較過(guò)氧化物酶的抑制效果為水蒸汽＞微波干燥＞80℃熱風(fēng)干燥＞自然陰干。分光光度計(jì)法測(cè)定樣品總黃酮含量,蒸制干燥＞微波干燥＞80℃熱風(fēng)干燥＞自然陰干。結(jié)論 菊花過(guò)氧化物酶適應(yīng)溫度范圍廣，20～80℃，相對(duì)耐熱性好。本研究可為中藥菊花炮制工藝的改善提供理論參考。

菊花；過(guò)氧化物酶；酶學(xué)特性；炮制工藝；黃酮

中藥菊花為菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序[1]。菊花性能辛、甘、苦，微寒。歸肺、肝經(jīng)。功效，疏散風(fēng)熱，平抑肝陽(yáng)，清肝明目，清熱解毒[2]。9-11月花盛開(kāi)時(shí)分批花采收后，陰

干或焙干，或熏、蒸后曬干，生用[3]。主產(chǎn)于浙江、安徽、河南等省。多栽培。因?yàn)榫栈ㄖ械闹饕钚猿煞謽O易發(fā)生酶促褐變,即其所含的酚類(lèi)物質(zhì)在過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶的作用下氧化成醌,再經(jīng)聚合形成褐色物質(zhì),而產(chǎn)生顏色裂變,嚴(yán)重影響產(chǎn)品的外觀(guān)和質(zhì)量[4-5]。過(guò)氧化物酶酶學(xué)特性目前農(nóng)作物報(bào)道多[6]，香蕉[7-8]、雪蓮果[9]、橄欖[10]、甘薯葉[11]、楊桃[12]等。針對(duì)菊花過(guò)氧化物酶的酶學(xué)特性鮮見(jiàn)報(bào)道[13]。菊花中目前知道的化合物主要是黃酮、多酚等[1]，研究表明，不同干燥方法對(duì)菊花的多酚、黃酮類(lèi)活性成分均有一定影響[4]，菊花藥材按產(chǎn)地和加工方法的不同，分為“亳菊”“滁菊”“貢菊”“杭菊”等，以亳菊和滁菊品質(zhì)最優(yōu)。我國(guó)菊花的藥用類(lèi)群通過(guò)人工長(zhǎng)期栽培選育,已形成一些相對(duì)穩(wěn)定的栽培變種,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)新栽培變種大馬牙菊花過(guò)氧化物酶的部分酶學(xué)特性進(jìn)行分析[14-15]，探討總黃酮的含量與酶的活性變化趨勢(shì)關(guān)系，以期為菊花炮制工藝提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

菊花2015年11月6日-11月12日采自安徽亳州十九里鎮(zhèn)農(nóng)戶(hù)地里，采集全花，經(jīng)安徽普仁中藥飲片有限公司質(zhì)量負(fù)責(zé)人段體斌老師鑒定為大馬牙菊花Dendranthema morifolium(Ramat.)Tzvel.Damay a'cv.nov，新栽培變種。在亳州安徽普仁中藥飲片公司采用不同炮制方法制備，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。愈?chuàng)木酚：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；二氧化硅：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；過(guò)氧化氫、磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉：北京化工廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

梅特勒-托利多XSE150分析天平 （瑞士蘇黎世）；TGL20MW臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) （湖南赫西儀器裝備有限公司）；T6 UV-VIS分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)）；EYELA水浴鍋SB-1100（上海愛(ài)朗儀器有限公司）;Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菊花過(guò)氧化物酶粗酶液的提取 稱(chēng)取新鮮菊花0.5 g,加適量石英砂，5 mL pH 7.0磷酸緩沖液冰浴研磨。提取物在4℃條件下以6 000 r/min離心6 min，收集上清液作為粗酶液待測(cè)。

1.3.2 菊花過(guò)氧化物酶的活性測(cè)定 取光徑1 cm比色皿2只，于1只加入50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0)50 μL，含有愈創(chuàng)木酚的反應(yīng)混合液2.9 mL，過(guò)氧化氫60 μL，作為對(duì)照；另1只中加入酶液50 μL，含有愈創(chuàng)木酚的反應(yīng)混合液2.9 mL和過(guò)氧化氫60 μL,立即開(kāi)啟秒表記錄時(shí)間，于分光光度計(jì)上測(cè)量波長(zhǎng)470 nm處吸光度值，每隔1分鐘讀數(shù)1次。以每分鐘變化0.01為一個(gè)酶活性單位。1.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)過(guò)氧化物酶的活性影響 按照“1.3.2”的測(cè)定方法,總反應(yīng)體系分別反應(yīng)1、2、3、4、5 min,測(cè)其吸光值。

1.3.4 pH對(duì)過(guò)氧化物酶活性的影響 配制pH值分別為5.29、5.59、5.91、6.24、6.47、6.64、6.81、6.98、7.17、7.38、7.73、8.04的磷酸緩沖液。按“1.3.2”的方法，在室溫下測(cè)定不同pH值的吸光值。

1.3.5 反應(yīng)溫度對(duì)過(guò)氧化物酶活性的影響 按“1.3.2”方法建立反應(yīng)體系,反應(yīng)底物分別于20、30、40、50、60、70、80℃下預(yù)先保溫10 min,再加入粗酶液50 μL,在波長(zhǎng)470 nm處測(cè)定吸光值。

1.3.6 過(guò)氧化物酶的熱穩(wěn)定性研究 取等量粗酶液4份,在100℃水浴中分別熱燙5、10、15、30 s，取出后迅速冷卻，按“1.3.2”的方法測(cè)定不同熱燙時(shí)間的吸光值。

1.3.7 底物濃度對(duì)過(guò)氧化物酶活性的影響 分別配制濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%的愈創(chuàng)木酚溶液為底物,按照“1.3.2”的測(cè)定方法,測(cè)其在最適溫度、最適pH值及酶液濃度保持固定條件下的吸光值，計(jì)算酶的活性。

1.3.8 不同炮制工藝對(duì)過(guò)氧化物酶活性的影響 探討水蒸氣、80℃熱風(fēng)干燥、微波干燥、自然陰干四種炮制工藝，對(duì)過(guò)氧化物酶的活性抑制。按“1.3.1”“1.3.2”的方法，提取不同炮制工藝的粗酶液測(cè)定其吸光值。

1.3.9 總黃酮含量測(cè)定 取干燥菊花1 g，精密稱(chēng)定，加入30 mL 60%甲醇于60℃水浴中溫浸1 h，直接加熱回流45 min,過(guò)濾，濾液定容至50 mL。精確取出1 mL,減壓濃縮至浸膏，用甲醇稀釋至50 mL容量瓶中定容，搖勻后得甲醇提取液。以試劑為空白，用3 cm比色皿于510 nm處測(cè)定吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算出不同干燥方法所得樣品中黃酮含量,分析不同炮制工藝干燥條件對(duì)黃酮的含量影響。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立：以蘆丁標(biāo)樣進(jìn)行總黃酮含量的測(cè)定，稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品制成濃度為0.148 0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述方法測(cè)定，分別移取標(biāo)準(zhǔn)樣品0～5.0 mL,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：

Y(mg/mL)=0.084 2X-0.000 68,R2=0.989 1其中X為吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花過(guò)氧化物酶反應(yīng)進(jìn)程曲線(xiàn)

由圖1可見(jiàn)，在反應(yīng)初期，即2 min內(nèi)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，OD值（產(chǎn)物生成量）呈直線(xiàn)上升，屬于反應(yīng)初速度。因此,本實(shí)驗(yàn)確定酶促反應(yīng)時(shí)間以不超過(guò)2 min為宜。

2.2 pH對(duì)菊花過(guò)氧化物酶活性的影響

由圖2可見(jiàn)，過(guò)氧化物酶在pH值為6.8時(shí)，酶活性最高，表明該酶的最適pH值為6.8,當(dāng)pH值為5.3和8.0時(shí),過(guò)氧化物酶的活性分別為最大時(shí)的30%和55%。

圖1 POD反應(yīng)進(jìn)程曲線(xiàn)

圖2 pH對(duì)POD活性的影響

2.3 溫度對(duì)菊花過(guò)氧化物酶活性的影響

由圖3可以看出,36℃以下酶的活性逐漸升高, 36℃以上酶的活性逐漸降低。36℃吸光值達(dá)到峰值，酶的活性達(dá)到最高。當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)，過(guò)氧化物酶的相對(duì)活性是13.2%,當(dāng)溫度20℃時(shí),過(guò)氧化物酶的相對(duì)活性是40.9%。

2.4 菊花過(guò)氧化物酶熱穩(wěn)定性

由圖4可知,隨著處理時(shí)間的增加,過(guò)氧化物酶活性迅速下降。15 s時(shí)，殘存活性?xún)H剩19.8%。30 s時(shí)，殘存活性近乎為零。

圖3 溫度對(duì)POD活性的影響

圖 4 POD的熱穩(wěn)定性

2.5 菊花過(guò)氧化物酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

由圖5可以看出,當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí) (0.01根據(jù)%),反應(yīng)速率與底物濃度的關(guān)系呈正比關(guān)系,表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)。隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速率不再按正比升高，反應(yīng)表現(xiàn)為混合級(jí)反應(yīng)。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到相當(dāng)高時(shí)，底物濃度對(duì)反應(yīng)速率影響變小，最后反應(yīng)速率與底物濃度幾乎無(wú)關(guān)，反應(yīng)達(dá)到最大速率（Vmax）,表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。

Lineweaver-Burk雙例數(shù)作圖法方程式 1/V= Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax,以1/V～1/[S]作圖，得出一直線(xiàn)，如圖6。得直線(xiàn)方程Y=0.004X+0.028,根據(jù)直線(xiàn)斜率和截距求得該反應(yīng)的米氏常數(shù)Km=1.58×10-2mol/L,最大反應(yīng)速率Vmax=14.278 U/min。動(dòng)力學(xué)方程為V=14.278[S]/(0.015 8+[S])(U/min)擬和直線(xiàn)相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.998,得到菊花的過(guò)氧化物酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)符合米氏方程。

圖5 底物濃度對(duì)POD活性的影響

圖6 POD酶促反應(yīng)雙倒數(shù)曲線(xiàn)

2.6 不同炮制工藝對(duì)菊花過(guò)氧化物酶的活性影響

由圖7可見(jiàn)，水蒸氣蒸30 s,酶的活性完全被抑制。反應(yīng)活性與反應(yīng)時(shí)間呈近直線(xiàn)關(guān)系，表示該炮制工藝受熱均勻。

圖7 水蒸汽對(duì)POD活性的影響

由圖8可見(jiàn)80℃熱風(fēng)干燥，酶的活性在加工6 h后完全被抑制，反應(yīng)活性與反應(yīng)時(shí)間呈曲線(xiàn)關(guān)系，表示該酶耐熱性高。

由圖9可見(jiàn)微波干燥，酶的活性在加工12 min后完全被抑制，反應(yīng)活性與反應(yīng)時(shí)間不成直線(xiàn)關(guān)系，表明該炮制工藝受熱不均勻。

由圖10可見(jiàn)自然陰干過(guò)程，酶的活性一直存在。反應(yīng)活性與反應(yīng)時(shí)間成曲線(xiàn)關(guān)系，表明該炮制工藝酶的活性不能得到抑制。

圖8 80℃熱風(fēng)干燥對(duì)POD活性的影響

圖9 微波干燥對(duì)POD活性的影響

圖10 陰干干燥對(duì)POD活性的影響

2.7 不同炮制工藝干燥總黃酮含量比較

由圖11可見(jiàn)不同炮制工藝干燥總黃酮含量，蒸制干燥＞微波干燥＞80℃熱風(fēng)干燥＞自然陰干。

圖11 不同炮制工藝對(duì)總黃酮含量的影響

3 結(jié)論與討論

過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在且活性較高的一種酶，該酶催化以H2O2為氧化劑的氧化還原反應(yīng)，在氧化其他物質(zhì)的同時(shí)，將H2O2還原為H2O，用以清除細(xì)胞內(nèi)的H2O2，是植物體內(nèi)的保護(hù)酶之一，此外過(guò)氧化物酶與植物的呼吸作用、光合作用、生長(zhǎng)素的氧化以及木質(zhì)素的形成等有關(guān)，其活性隨植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程以及環(huán)境條件的改變而變化[14-15]。在H2O2存在下，它能催化酚類(lèi)、從而導(dǎo)致組織褐變[14-17]。菊花過(guò)氧化物酶最適溫度36℃，最適pH7.0,最適底物濃度0.03%。菊花過(guò)氧化酶耐熱性高，80℃熱風(fēng)干燥6 h,酶的活性才完全抑制。對(duì)熱敏感，100℃水蒸汽蒸，30 s酶活性則被鈍化。對(duì)于酶促褐變，在適宜溫度下，反應(yīng)酶活性越強(qiáng)，對(duì)酶促褐變程度越高。在過(guò)氧化物酶活性測(cè)定系統(tǒng)中，以愈創(chuàng)木酚為底物的菊花過(guò)氧化物酶的Km=1.58×10-2mol/L。

通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量顯示，蒸汽干燥總黃酮含量最高，多酚氧化酶的活性趨勢(shì)與黃酮含量有相關(guān)性，但仍需實(shí)驗(yàn)證明。黃酮類(lèi)物質(zhì)是菊花的主要成分之一，炮制工藝中微波干燥菊花受熱不均勻[18-19]，硫熏工藝在農(nóng)產(chǎn)品及中藥飲片加工中都是不推薦的[19-20]，因此菊花的炮制工藝可通過(guò)閃速高溫滅酶來(lái)抑制菊花酶促褐變。

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（本文編輯 楊 瑛）

Study on Characters of Peroxidase in Chinese Medicine Chrysanthemum and its Processing Technology

SU Jing1,LIU Shoujing1*,ZHU Jingjing2,ZHU Yuyun1,2
(1.Anhui University of Chinese Medicine,Hefei,Anhui 230000,China; 2.Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China)

Objective To observe the peroxidase(POD)character and processing technology of chrysanthemum.Methods The enzymatic characteristics of POD from chrysanthemum were investigated by spectrophotometry,with the guaiacol as substrate.The POD and total flavonoid content under different processing technology were compared.Results The reaction time for POD should not exceed 2 min,the optimum pH and temperature of POD were 7.0 and 36℃,respectively.The POD activity was completely inactivated when it was incubated at 100℃ for 30s.The reaction kinetic of enzymatic browning was accordant withkinetic parameters.The Km and Vmax were 1.58×10-2mol/L,14.278 U/min,respectively.Four processing methods show different effects on POD activity,and their inhibitory capacity was steaming drying＞microwave drying＞ 80 ℃ hot air drying＞natural shade drying.Conclusion The POD in chrysanthemum has a wide range of adapting temperature,20～80℃, and good relative thermal stability.This research can provide reference for the processing technology of chrysanthemum.

chrysanthemum;peroxidase;enzymatic characteristics;processing technology;flavonoids

R283

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.03.007

2016-01-02

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373960,81573600)；國(guó)家中醫(yī)藥管理局行業(yè)專(zhuān)項(xiàng)(201307008-04)。

蘇 靖，女，碩士研究生，研究方向：藥用植物學(xué)與中藥資源化學(xué)。

*劉守金，男，教授，博士研究生導(dǎo)師,E-mail:shjiuliu@sina.com。

本文引用：蘇 靖，劉守金，朱晶晶，朱玉蕓.中藥菊花過(guò)氧化物酶酶學(xué)特性及炮制工藝的研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（3）：259-263.