羅 佩，侯麗瑩，鄧麗玲，趙 娜，全春梅，楊正望，余曦明*（.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 4008；.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 長沙 40007）

補腎化瘀方對PCOS大鼠子宮內(nèi)膜整合素αvβ3及LIF表達的影響

羅 佩1，侯麗瑩1，鄧麗玲1，趙 娜1，全春梅1，楊正望2，余曦明1*
（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 長沙 410007）

目的 觀察補腎化瘀方對多囊卵巢綜合征（PCOS）大鼠子宮內(nèi)膜整合素αvβ3及白血病抑制因子（LIF）的影響。方法 100只SD大鼠隨機分為25只為空白對照組，75只為模型制備組，予頸背部皮下注射脫氫表雄酮（dehydroepiandrostexone，DHEA）溶液建立PCOS大鼠模型，判定造模成功后隨機分為模型對照組、達英-35組、補腎化瘀方組，分別用蒸餾水、達英-35及補腎化瘀方對大鼠灌胃給藥，連續(xù)灌胃21 d，停藥7 d為1周期，3個周期后停藥，按雌雄鼠1∶1合籠，并于妊娠第4天處死大鼠，采用免疫組化法檢測PCOS大鼠子宮內(nèi)膜整合素αvβ3及LIF的表達。結果 （1）與空白對照組比較，模型對照組、達英-35組、補腎化瘀方組整合素αvβ3表達均較低（P＜0.05）；與模型對照組比較，補腎化瘀方組整合素αvβ3較高（P＜0.05），達英-35組整合素αvβ3較低（P＞0.05）。（2）與空白對照組比較，模型對照組和達英-35組LIF較低（P＜0.05）；與模型對照組比較，補腎化瘀方組LIF較高（P＜0.05）。結論 補腎化瘀方可提高PCOS大鼠子宮內(nèi)膜整合素αvβ3及LIF的表達，這可能是其改善子宮內(nèi)膜容受性的機制之一。

多囊卵巢綜合征；子宮內(nèi)膜容受性；整合素；白血病抑制因子；補腎化瘀

多囊卵巢綜合征 （polycystic ovary syndrome, PCOS）是一種遺傳異質(zhì)性、發(fā)病多因性、臨床表現(xiàn)多態(tài)性的內(nèi)分泌紊亂及代謝異常性疾病，以高雄激素血癥及持續(xù)性無排卵為主要病理生理特征，臨床多表現(xiàn)為不孕、月經(jīng)不調(diào)、肥胖、痤瘡等。既往多囊卵巢綜合征性不孕的治療多從藥物促排卵方向考慮，但據(jù)統(tǒng)計藥物促排卵治療后臨床排卵率雖高（75%～80%），妊娠率卻低于40%[1]。究其原因多與PCOS患者子宮內(nèi)膜容受性下降有關。既往實驗研究從肝論治，在一定程度可改善多囊卵巢綜合征[2]，但隨著研究的深入加之前期研究基礎[3]，補腎化瘀方亦可有效改善PCOS患者卵巢局部微環(huán)境及子宮內(nèi)環(huán)境。本實驗通過觀察補腎化瘀方對子宮內(nèi)膜整合素αvβ3及LIF表達的影響，進一步研究該方對PCOS大鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響及其作用機制。

1 材料

1.1 動物與分組

選用21日齡SPF級SD大鼠100只，雌性，體質(zhì)量(75±15)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號SCXK（湘）2011-0003，飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物實驗室，許可證號SYXK（湘）2013-0005。環(huán)境溫度20～26℃，濕度40%～60%，每天光照10 h，自由飲水，喂以顆粒飼料。

1.2 藥物、試劑與儀器

補腎化瘀方處方為：紫石英15 g，補骨脂8 g，菟絲子8 g,桑寄生8 g，茺蔚子5 g，澤蘭8 g，澤瀉8 g，土鱉蟲8 g，三七3 g，覆盆子8 g，蓮子心3 g，甘草3 g，飲片由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供。浸泡30 min，煎煮2次藥汁混合，濾過，于水浴鍋內(nèi)蒸發(fā)濃縮為含生藥0.9 g/mL，滅菌分裝，4℃冰箱冷藏備用。

達英-35（國藥準字J20140114）由拜耳醫(yī)藥保健公司廣州分公司提供。脫氫表雄酮由湖北芳通藥業(yè)有限公司提供。注射用大豆油（Y12080204-3-07）由蘇州捷易龍貿(mào)易有限公司提供。整合素αvβ3 及LIF試劑盒（K723318）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

輪轉石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司RM2235），生物組織攤片機（金迪YD-A），電冰箱（海爾BCD-226SKA），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒DNP-9162），微波爐（格蘭仕），研究型顯微鏡（Motic BA410），Motic Images Plus 6.0計算機圖像分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 PCOS模型制備與評價

21日齡SD大鼠苦味酸標記后按隨機數(shù)字表法隨機分為2組，即空白對照組25只，模型制備組75只，適應性喂養(yǎng)至23日齡。（1）參照李燕等[4]造模方法，模型制備組75只于每日上午10點頸背部皮下注射DHEA6 mg/(100 g·d)+0.2 mL大豆油，在溶劑用量恒定0.2 mL不變的基礎上對DHEA注射液的配制進行調(diào)整。按DHEA6 mg/(100 g·d)+0.2 mL大豆油來換算，100 g體質(zhì)量大鼠應配制注射液濃度為6 mg/0.2 mL，即30 mg/mL,將此作為DHEA注射液的標準濃度，注射量按0.2 mL/100 g體質(zhì)量來計算。每日大鼠稱質(zhì)量后，配制當日DHEA溶液并予酒精燈加熱溶解均勻，按不同大鼠質(zhì)量抽吸不同體積的注射液即可；（2）空白對照組每日同時段頸背部皮下注射0.2 mL/100 g大豆油，連續(xù)20 d。自注射10 d開始每天下午4時進行1次陰道脫落細胞學觀察，用光滑吸管取少量生理鹽水，滴入大鼠陰道，吹打3～4次，吸出陰道液，涂于載玻片上直接光鏡觀察，判斷其動情周期變化。陰道涂片顯示模型制備組大鼠光鏡下細胞總數(shù)少，白細胞為主，偶見有核上皮細胞提示其失去規(guī)律動情周期，空白對照組有規(guī)律動情周期。注射第20天當晚8時禁食，次日晨起各組隨機抽取5只大鼠稱質(zhì)量，頸椎脫臼法處死大鼠，摘取雙側卵巢，以卵巢最大平面作為待檢平面石蠟包埋，進行HE染色觀察卵巢形態(tài)學變化，大鼠失去規(guī)律動情周期，卵巢呈多囊樣改變，可判定造模成功。造模后將模型制備成功大鼠隨機分為3組，盡量保證每組均衡，分別是模型對照組、達英-35組，補腎化瘀方組。不成功者剔除，保證每組20只。

2.2 給藥

造模成功后，補腎化瘀方組每天按時灌服補腎化瘀方，1次/d，給藥劑量參照《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表》和《實驗動物學》，按成人女性平均體質(zhì)量60 kg體表面積換算，折合到大鼠用藥劑量為0.88 g/（100 g·d），結合“1.2”所述中藥湯劑濃度即1 mL/（100 g·d）。達英-35組每天灌服達英-35，臨床劑量為1片/d，折合到大鼠約為0.1片/（kg·d），即1/99片，將1片達英-35溶于100 mL蒸餾水中，約為1 mL/100 g。空白對照組以與模型制備組同等量的蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃21 d，停藥7 d為1個周期，共給藥3個周期。停藥5 d后按雌雄鼠1∶1的比例合籠，次日清晨檢查大鼠陰道栓，發(fā)現(xiàn)陰道栓日記為妊娠第1天。

2.3 取材與指標測定

妊娠第4天清晨以頸椎脫臼法處死大鼠，摘取子宮及雙側卵巢，將其表面脂肪去除干凈后，均以4%多聚甲醛固定，卵巢HE染色后在顯微鏡下行形態(tài)學觀察。子宮內(nèi)膜行免疫組化法檢測整合素αvβ3、LIF，子宮內(nèi)膜切片常規(guī)脫蠟至水，置于DTEA抗原修復液進行微波修復，3%H2O2去離子水孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS液沖洗，滴加一抗，稀釋比均為1∶100，室溫孵育1～2 h，PBS沖洗，滴加二抗，室溫孵育20 min，PBS液沖洗，應用DAB溶液顯色，自來水反復沖洗、復染、脫水、透明、封片。每組內(nèi)每張切片隨機選擇5個400倍視野進行觀察，采用Motic Images Plus 6.0計算機圖像分析系統(tǒng)選取細胞質(zhì)中相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，以切片背景的灰度值作背底校正，對每張照片進行分析，測定平均光密度值（average optical density,AOD）。

2.4 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學軟件SPSS 16.0處理有關數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)“±s”表示。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)性及方差齊性，則按照完全隨機設計，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計；若不滿足正態(tài)性及方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗的Kruskal-Wallis H檢驗，各組間兩兩比較用Nemenyi法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠卵巢組織形態(tài)學

空白對照組卵巢肉眼觀色澤較為紅潤。鏡下可見不同發(fā)育階段的卵泡，多層排列整齊的顆粒細胞，及多個黃體（圖1-A）；模型制備組肉眼觀色澤較為蒼白，鏡下可見多個囊狀擴張卵泡，其內(nèi)卵母細胞及放射冠消失，顆粒細胞層數(shù)減少，且排列疏松（圖1-B），結合“2.1”其動情周期失去規(guī)律變化，提示PCOS大鼠模型造模成功。

圖1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)（HE，×400）

3.2 各組大鼠子宮內(nèi)膜整合素αvβ3的表達比較

整合素αvβ3主要表達于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞中（圖2：A-D）。與空白對照組比較，模型對照組、達英-35組、補腎化瘀方組整合素αvβ3 AOD值均明顯較低（P＜0.01，P＜0.05）；與模型對照組比較，補腎化瘀方組整合素αvβ3 AOD值明顯較高（P＜0.05），達英-35組整合素αvβ3 AOD值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

3.3 各組大鼠子宮內(nèi)膜LIF的表達比較

LIF主要表達于子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮細胞中（圖3：A-D）。與空白對照組比較，模型對照組、達英-35組LIF AOD值明顯較低（P＜0.01，P＜0.05），補腎化瘀方組LIF AOD值差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；與模型對照組比較，補腎化瘀方組LIF AOD值明顯較高（P＜0.01），達英-35組LIFAOD值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜整合素αvβ3及LIF的表達 （±s，AOD）

表1 各組大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜整合素αvβ3及LIF的表達 （±s，AOD）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

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4 討論

精子與卵子在輸卵管壺腹部結合形成受精卵，4～5 d之后發(fā)育成桑葚胚或囊胚進入子宮腔并侵入子宮內(nèi)膜稱為胚胎著床。這是一個十分復雜的涉及到胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)同步化的過程。對于PCOS患者來說，完成這一過程需要克服排卵及子宮內(nèi)膜容受性兩大難題。研究表明多囊卵巢綜合征占不排卵性不孕的50%～70%[1]，以往助孕治療以促排卵為主，但高排卵率低妊娠率[5]，使研究者的目光轉向如何改善PCOS患者子宮內(nèi)膜容受性，以使其與胚胎發(fā)育同步化，進而提高妊娠率。子宮內(nèi)膜容受性具有嚴格的時間及空間限制，在這一“種植窗”期內(nèi)，子宮內(nèi)膜通過一系列內(nèi)分泌變化為受精卵的定位、粘附、侵入做好準備[6]。PCOS患者由于長期處于內(nèi)分泌紊亂狀態(tài)，使得子宮內(nèi)膜的形態(tài)及一系列細胞因子、分泌蛋白紊亂，導致其容受性下降[7]。整合素及LIF是目前比較熱門的反應子宮內(nèi)膜容受性的標志物。

圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜種植窗期整合素αvβ3的表達（免疫組織化學法，×400）

圖3 各組大鼠子宮內(nèi)膜種植窗期LIF的表達（免疫組織化學法，×400）

整合素是細胞粘附分子家族中的一大分支，由α及β兩個亞基構成，其通過Ca+介導細胞內(nèi)、外環(huán)境之間的相互作用，參與細胞的增殖、分化、粘附、遷徙等過程，從而在包括精卵結合、胚胎著床等病理、生理過程中發(fā)揮重要功能[8]。大量的動物及臨床試驗也證實整合素αvβ3與子宮內(nèi)膜容受性有密切關系，在高LH排卵峰后整合素αvβ3的表達顯著增加，而在不孕女性中，如不明原因性不孕、輸卵管積水、子宮內(nèi)膜異位癥等，其具有特異性低表達[9-10]。因此整合素αvβ3在種植窗期子宮內(nèi)膜上的高表達是良好子宮內(nèi)膜容受性的標志，通過監(jiān)測整合素αvβ3可對臨床上PCOS患者子宮內(nèi)膜容受性及藥物療效進行有效的評價。本研究利用免疫組化法檢測整合素αvβ3在種植窗期子宮內(nèi)膜上的表達情況，結果表明整合素αvβ3主要表達于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞中，與空白對照組比較，其余各組整合素αvβ3表達明顯降低，這與國內(nèi)外實驗研究一致，說明PCOS大鼠子宮內(nèi)膜容受性下降。與模型對照組比較，補腎化瘀方組子宮內(nèi)膜上整合素αvβ3的表達明顯較高。因此我們認為補腎化瘀方可提高子宮內(nèi)膜上整合素αvβ3的表達，這可能是其改善PCOS患者子宮內(nèi)膜容受性的機制之一。

LIF是一種分泌型糖蛋白，屬白介素-6家族，其受體分布十分廣泛，且在不同的部位具有調(diào)節(jié)細胞增殖、分化等不同的生物活性。Vogiagis等[11]發(fā)現(xiàn)LIF表達量可隨月經(jīng)周期變化，在排卵之后LIF在子宮內(nèi)膜上的表達達到高峰，參與誘導良好子宮內(nèi)膜容受性的建立。有研究[12]顯示子宮內(nèi)膜上LIF及其受體的表達與胞飲突出現(xiàn)及衰退時間一致，并可定位表達于胚胎著床附近[13]，LIF表達低下者其妊娠率低且胚胎著床后發(fā)育不良[14]。因此LIF可以作為判斷子宮內(nèi)膜容受性的細胞因子之一。本研究顯示LIF主要表達于子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮細胞中，與空白對照組比較，模型制備組LIF表達均較低，表明PCOS大鼠LIF表達受限。與模型對照組比較，補腎化瘀方組LIF表達較高，提示補腎化瘀方改善子宮內(nèi)膜內(nèi)膜容受性可能與LIF表達增高有關。

中醫(yī)認為腎為先天之本，元氣之根，主藏精氣，是人體生長、發(fā)育和生殖之根本。腎精者血之源，腎中陰精虧虛則沖任乏源，無以凝精受孕，卵子，內(nèi)膜亦無生長發(fā)育之物質(zhì)基礎，故卵子難以發(fā)育成熟，內(nèi)膜難以成易受之勢。腎氣，亦乃腎精所化之氣，腎氣虧虛，沖任不固，無以攝精受孕，氣者亦是機體溫煦氣化的原動力，其溫煦氣化失司，一方面無以鼓舞腎精化生氣血，另一方面如王清任《醫(yī)林改錯》曰：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀”，腎氣虧虛，氣血運行無力，日久氣血淤滯沖任胞宮，排卵乏力，內(nèi)膜無以轉化為分泌期，不能觸發(fā)氤氳樂育之時，而致不孕?？梢娔I虛乃多囊卵巢綜合征之根本病機，可兼有肝郁、血瘀、痰濕、痰瘀，故補腎乃其根本治則，可兼以疏肝、化瘀、祛痰、除濕。本研究采用導師多年來治療PCOS基礎方補腎化瘀方，方中補骨脂、紫石英補腎助陽，以行“善補陰者必于陽中求陰,則陰得陽升而泉源不竭”之效，此二藥為君。菟絲子入腎經(jīng)，潤燥補虛，補而不峻，溫而不燥，平調(diào)陰陽。桑寄生、覆盆子歸肝腎二經(jīng)，填精補血，滋補沖任。蓮心清心安神，交通心腎，以對抗補骨脂、紫石英之溫燥，上四味為臣藥。澤蘭、澤瀉、三七、茺蔚子活血調(diào)經(jīng)，以利肝腎之瘀滯。甘草調(diào)和諸藥，縱觀全方，具補腎益精，活血化瘀之功，使得陰陽平調(diào)，腎精腎氣充足，沖任得養(yǎng)，氣血調(diào)暢，卵子如期發(fā)育，內(nèi)膜血運豐富，成易孕之勢，進而提高妊娠率。

綜上所述，補腎化瘀方對子宮內(nèi)膜容受性具有積極影響，其可能機制是增強整合素αvβ3及LIF的表達。但胚胎著床過程十分復雜，子宮內(nèi)膜容受性影響因素眾多，目前發(fā)現(xiàn)的指標只能作為輔助評價指標，無法作為評價子宮內(nèi)膜容受性的黃金標準，在后期研究中亟需發(fā)現(xiàn)可行的、有效的標志物以評價子宮內(nèi)膜容受性，預測種植窗期，提高臨床妊娠率。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Bushen Huayu Precription on the Expression of Endometrial Integrin αvβ3 and LIF in PCOS Rats

LUO Pei1,HOU Liying1,DENG Liling1,ZHAO Na1,QUAN Chunmei1,YANG Zhengwang2,YU Ximing1*
（1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Department of Gynecology and Obestrics,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To explore the influence of Bushen Huayu prescription on endometrial integrin-αvβ3 and leukaemia inhibitory factor(LIF)in polycystic ovary syndrome(PCOS)rats.Methods One hundred SD rats were randomly devided into two groups of 25 rats in control group and 75 rats in model group.PCOS rat modules were to built by injecting dehydroepiandrostexone(DHEA)solution in the back of the neck subcutaneous of rats.After modules built successfully,the selected rats were randomly divided into model group,diane-35 group and Bushen Huayu prescription treatment group,given by gavage with distilled water,diane-35 and Bushen Huayu prescription separately for 21 d.Then stopped 7 d for a cycle. Drug withdraw after 3 discontinuous cycles,female rats were cohabited with male rats according to 1:1.The rats were executed after pregnancy for 4 d.The expressions of endometrial integrin-αvβ3 and LIF were detecting using immunohistomchemical method in PCOS rats.Results (1)Compared with the control group,the expressions of the integrin-αvβ3 were lower in model group,diane-35 group and Bushen huayu prescription group (P＜0.05).Compared with the module group,the expressions of the integrin-αvβ3 were higher in Bushen Huayu prescription group （P＜0.05)and were lower in diane-35 group (P＞0.05). (2)Compared with the control group,the expressions of the LIF were lower in model group,diane-35 group （P＜0.05）.Compared with the module group,the expressions of the LIF were higher in Bushen Huayu prescription group（P＜0.05).Conclusion Bushen Huayu prescription can increase the expressions of endometrium integrin-αvβ3 and LIF in PCOS rats,that may be one of the mechanisms of improving the receptivity of endometrium.

polycystic ovary syndrome;endometrial receptivity;integrin;leukemia inhibitory factor;tonifying kidney and removing blood stasis;Bushen Huayu prescription

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.03.006

2016-07-05

湖南省科技廳計劃一般項目（2014TT2007）。

羅 佩，女，在讀碩士研究生，研究方向：婦科生殖內(nèi)分泌疾病。

*余曦明，女，實驗師，E-mail：63175725@qq.com。

本文引用：羅 佩，侯麗瑩，鄧麗玲，趙 娜，全春梅，楊正望，余曦明.補腎化瘀方對PCOS大鼠子宮內(nèi)膜整合素αvβ3及LIF表達的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（3）：254-258.