李欣春，梁 昊，胡志希*，胡思遠(yuǎn)，文 陽，鐘森杰，李 琳（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南 長沙 410007）

高血壓心力衰竭大鼠動物模型的研制

李欣春，梁 昊，胡志希*，胡思遠(yuǎn)，文 陽，鐘森杰，李 琳
（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南 長沙 410007）

目的 研制高血壓引起的心衰大鼠動物模型。方法 將18只Dahl鹽敏感性大鼠分為正常組和模型組并分別使用0.3%NaCl低鹽飼料和8%NaCl高鹽飼料喂養(yǎng)大鼠20周，觀察大鼠行為及體征，檢測大鼠血壓、血清氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal Pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP）含量，彩色超聲多普勒檢測大鼠左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction,LVEF）和左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening,LVFS）及電鏡觀察HE染色心肌細(xì)胞以及腎臟組織等。結(jié)果 正常組大鼠血壓一直維持在140 mmHg左右，而模型組大鼠從進(jìn)食高鹽飼料后血壓保持持續(xù)上升，最高可達(dá)250 mmHg；與正常組比較，模型組的NT-proBNP、LVEF、LVFS在統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異（P＜0.01）。結(jié)論 本研究制作的動物模型可較好地模擬正常大鼠繼發(fā)高血壓病進(jìn)而發(fā)展成高血壓心衰大鼠模型的過程，可用于高血壓心力衰竭疾病的研究。

高血壓；心力衰竭，Dahl鹽敏感性大鼠；大鼠動物模型

心力衰竭是各種心血管疾病的終末期表現(xiàn)和最主要的死因，其發(fā)病率高，5年存活率與惡性腫瘤相仿[1]。我國最近一次高血壓流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)：18歲以上人群高血壓患病率為18.8%，并且隨著年齡的增加，高血壓導(dǎo)致心衰患病率迅速增加，發(fā)病率居世界前列[2]。而高血壓性心臟病一般進(jìn)展為心室肥大和纖維化，最終導(dǎo)致舒張性心力衰竭（diastolic heart failure,DHF）。世界衛(wèi)生組織研究發(fā)現(xiàn)，高血壓、左室肥厚（left ventricular hypertrophy,LVH）和冠心病是導(dǎo)致舒張功能障礙的主要危險因素。Bonow等發(fā)現(xiàn)左室DHF中53%～60%為高血壓性心臟病，20%～26%為冠心病，10%為肥厚性心肌病。以上數(shù)據(jù)證明高血壓是引起左室DHF的常見病因之一[3]。DiNicolantonio研究發(fā)現(xiàn)，攝入過量食鹽能引起高血壓及與其相關(guān)的并發(fā)癥，如舒張性心力衰竭，而控制高血壓可有效降低發(fā)生心力衰竭的危險[4]。

高患病率、高住院率、高病死率及由此帶來的巨大經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，使得心力衰竭一直為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的重點和熱點。為了更好地研究高血壓心衰疾病，迫切需要研制一種穩(wěn)定、可靠，且具有較高重復(fù)性的高血壓心衰動物模型。因此，本文以Dahl鹽敏感性大鼠為材料，闡述了高血壓心衰大鼠的制作以及模型評價方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級Dahl鹽敏感性大鼠18只，體質(zhì)量（220±10）g，由北京維通利華動物公司提供，動物合格證編號為：No.11400700134072，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF級實驗室內(nèi)。

1.2 儀器與主要試劑

超低溫冰箱Forma 900 series，美國Thermo公司；5417R型小型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；SonoScape-S2N型彩色多普勒超聲診斷儀，深圳開立科技有限公司；移液槍K39270B，200 μL，德國Eppendorf公司；智能無創(chuàng)血壓計BP-2010A，北京Softron公司；大鼠NT-proBNP ELISA試劑盒48T，SINOBESTBIO公司，產(chǎn)品批號：G19031685。

1.3 造模方法

將18只Dahl鹽敏感性大鼠分為正常組與模型組，每組9只，每3只老鼠一籠。正常組大鼠喂養(yǎng)0.3%NaCl低鹽飼料，模型組大鼠喂養(yǎng)8%NaCl高鹽飼料，每籠每天喂養(yǎng)飼料60 g，水450 mL，每2天換洗籠子1次。共喂養(yǎng)20周。

1.4 檢測方法與指標(biāo)

1.4.1 行為及體征觀察 每天早、中、晚觀察大鼠的體征、精神狀態(tài)、飲食情況、活動狀況。

1.4.2 血壓監(jiān)測 采用大鼠智能無創(chuàng)血壓計檢測大鼠的血壓變化，每15天檢測1次。同時，記錄血壓變化對大鼠的行為體征產(chǎn)生的影響。

1.4.3 超聲心動圖檢測 用SonoScape-S2N型彩色多普勒超聲診斷儀，在二維超聲引導(dǎo)下用M型超聲經(jīng)胸骨左心室長軸切面測量左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD），左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD），求3個心動周期的平均值，并按照Teichholtz公式計算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及左室短軸縮短率（LVFS）。

1.4.4 心肌細(xì)胞和腎臟HE染色 取出大鼠心臟和腎臟后經(jīng)固定、脫水、包埋以及切片后，將心臟切片和腎臟切片用蘇木精—伊紅染色法染色，在光鏡下以200倍或400倍觀察心肌細(xì)胞及腎單位的形態(tài)學(xué)變化。

1.4.5 血清NT-proBNP樣本制備及檢測方法 目前，NT-proBNP是診斷心力衰竭較好的指標(biāo)[5]。大鼠經(jīng)10%水合氯醛按4 mL/kg計量腹腔注射麻醉后，使用采血針和采血管給大鼠腹主動脈取血，采血完畢常溫靜置 20 min后，以 3 500 r/min離心10 min，立即提取上清液分裝在離心管里放在零下80℃冰箱里保存。待測時，先將血清室溫放置2 h后，1 000 r/min離心15 min，使用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）對血清進(jìn)行NT-proBNP含量檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠成活情況

造模周期內(nèi)，9只正常組大鼠均存活；9只模型組大鼠死亡2只。

2.2 模型動物一般狀況觀察

正常組大鼠動靜如常，行為正常，毛發(fā)光澤呈白色，抓取時稍有反抗，性情較溫順；模型組大鼠精神亢奮，咬籠打架，時常有大鼠腿部或尾部出血，毛發(fā)枯槁，無光澤，腹部毛發(fā)稀疏，抓取時反抗劇烈，時常跳躍反弓軀體試圖咬人。

2.3 大鼠血壓監(jiān)測值比較

從圖中得知，模型組自從喂食高鹽飼料后，一直處于高血壓狀態(tài)，血壓甚至達(dá)到220 mmHg以上；而喂食低鹽飼料的正常組血壓基本維持在140 mmHg以下，尚未達(dá)到高血壓診斷指標(biāo)（140 mmHg），難以構(gòu)成心臟器質(zhì)性病變，見圖1。

2.4 各組大鼠心功能參數(shù)比較

造模結(jié)束后，模型組LVEF、LVFS明顯低于正常組，與正常組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。結(jié)合圖1，說明由于受血壓影響對各組大鼠LVEF和LVFS產(chǎn)生了差異。

圖1 大鼠血壓觀測圖

表1 各組大鼠心功能參數(shù)比較 （%,±s）

表1 各組大鼠心功能參數(shù)比較 （%,±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01。

2.5 心肌HE染色比較

正常組:心肌結(jié)構(gòu)清晰，心肌閏盤、橫紋清晰，橫切面可見心肌纖維排列均勻、整齊，心肌細(xì)胞核位于邊緣，核大小、形態(tài)正常，心肌纖維未見斷裂缺損及空白區(qū)，見圖2。模型組：心肌結(jié)構(gòu)模糊，心肌閏盤不清，橫紋消失，肌纖維呈波浪形排列，細(xì)胞間縫隙增大，心肌細(xì)胞水腫增大或溶解，出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞。從心肌HE染色圖片可以得知，不同組別心肌病理學(xué)形態(tài)存在較大的差異，模型組大鼠心肌細(xì)胞水腫、脫落，肌纖維溶解恰好解釋了模型組大鼠EF以及FS明顯降低的原因。

圖2 心肌細(xì)胞顯微光鏡觀察圖（HE×400）

2.6 腎單位HE染色

正常組：腎小球內(nèi)毛細(xì)血管清晰，基底膜無增厚或皺縮，近端小管及遠(yuǎn)端小官官腔形態(tài)大小正常，且內(nèi)部均無異常管型，見圖3。模型組：腎小球內(nèi)纖維化嚴(yán)重，只可見少量的毛細(xì)血管，基底膜皺縮，近端小官及遠(yuǎn)端小官上皮細(xì)胞空泡變性及脫落，其內(nèi)部可見大量蛋白管型。

圖3 腎單位光學(xué)顯微鏡圖(HE)

2.7 大鼠血清NT-proBNP指標(biāo)檢測

與正常組比較，模型組NT-proBNP增多明顯增高，兩總體均數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明制作高血壓心力衰竭模型較為成功，見表2。

表2 各組大鼠血清NT-proBNP比較 （±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清NT-proBNP比較 （±s，pg/mL）

注：與正常組比較，#P＜0.01。

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3 討論

Dahl種是一種遺傳性鹽敏感性高血壓動物模型，Dahl將大鼠的子代進(jìn)行重復(fù)交配，培養(yǎng)出通過遺傳性鹽負(fù)荷使血壓升高的S種(Dahl鹽敏感性大鼠：DSR)和正常血壓的R種(Dahl鹽非敏感性大鼠：DRR)。將DSR的腎移植給DRR時，DRR便產(chǎn)生鹽敏感性高血壓，反之，將DSR的腎與DRR的腎置換時，DSR的血壓轉(zhuǎn)為正常，表明攝鹽的確與高血壓發(fā)病相關(guān)。Dahl鹽敏感性高血壓大鼠是遺傳性高血壓大鼠的品系之一，該模型無需進(jìn)行手術(shù)和專門給藥，只需在其生長過程中給予鹽即可成為高血壓模型[6]。因此，依據(jù)該種大鼠生理特性，即進(jìn)食高鹽飼料血壓即升高，而進(jìn)食低鹽飼料對血壓無影響，本實驗無需設(shè)置空白對照組，進(jìn)食低鹽飼料的即為正常組，而進(jìn)食高鹽飼料的即為模型組。另外，與進(jìn)食低鹽飼料的Dahl種大鼠相比，進(jìn)食高鹽飼料的Dahl種大鼠隨著血壓升高會伴有嚴(yán)重的腎小球硬化，血液中血管緊張素II（Angiotensin II,Ang II）含量也較少[7]。因此，由于該種類大鼠對鹽敏感程度較高，如不加以控制飲食，長期大量攝入鈉鹽極易引起腎小球濾過功能降低、近端小管及遠(yuǎn)端小管重吸收能力減弱導(dǎo)致大量蛋白丟失、血容量下降、腸道蠕動減弱[8]，以至于大鼠生命后期體格瘦小，腹部卻膨隆。因此，我們在喂養(yǎng)的時候應(yīng)控制大鼠每日飲食鈉鹽的含量，模型組按照平均每只大鼠每日進(jìn)食1.6 g NaCl的量喂養(yǎng)，雖然可見模型組大鼠血壓穩(wěn)步上升，但是在喂養(yǎng)至120 d時，有2只大鼠死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)膨隆的腹部里是腸管內(nèi)淤積的糞便，這也和臨床上腎衰竭合并腸梗阻的病例相符[9]。鑒于此結(jié)果，我們后期還可以繼續(xù)探究既可以保證高血壓心衰大鼠模型成功又可以降低死亡率的每日進(jìn)食鈉鹽含量臨界值范圍。也正是由于死去的2只大鼠導(dǎo)致在第120天測量大鼠血壓時平均值降低。

實驗結(jié)果顯示即使模型組大鼠的左室射血分?jǐn)?shù)也并沒有低于40%，即該模型不是收縮期心衰；反而其射血分?jǐn)?shù)一直保持在50%以上，理應(yīng)是射血分?jǐn)?shù)保留的心衰，符合高血壓導(dǎo)致心力衰竭的病理變化[10]。但是從HE染色結(jié)果得知，心肌細(xì)胞部分水腫和溶解，必然會導(dǎo)致心肌收縮能力減弱，因此模型組的射血分?jǐn)?shù)比正常組低。NT-proBNP是B型腦鈉肽（BNP）分裂后的N端片段，目前已知它血清中濃度高，半衰期較BNP長，且為一直鏈結(jié)構(gòu)，體外生物活性穩(wěn)定，易檢測，可用于評價心功能[5]。同時，有研究證實，NT-proBNP水平隨美國紐約心臟病學(xué)會（NYHA）首先提出的心功能分級增加而升高，隨治療后病情緩解而呈明顯下降[11]。因此，NT-proBNP是判斷心力衰竭程度的一個重要指標(biāo)。

通過了解NT-proBNP對診斷心衰疾病的意義，以及Dahl鹽敏感性大鼠的生理特性，結(jié)合本實驗左室射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率和心肌HE染色結(jié)果可得知，通過高鹽飼料喂養(yǎng)Dahl鹽敏感性高血壓大鼠可以很好地模擬高血壓病發(fā)展為高血壓心衰疾病的動態(tài)模型，可為研究高血壓心力衰竭提供一個可靠的動物模型。

[1]Bui AL,Horwich TB,Fonarow GC.Epidemiology and risk profile of heart failure[J].Nat Rev Cardiol,2011,8(1):30-41.

[2]李立明,饒克勤,孔靈芝,等.中國居民2002年營養(yǎng)與健康狀況調(diào)查[J].中華流行病學(xué)雜志，2005(7):478-484.

[3]Fischer M,Baessler A,Hense HW,et al.Prevalence of left ventricular diastolic dysfunction in the community.Results from a Doppler echocardiographic-based survey of a population sample[J].Eur Heart J.2003,24(4):320-328.

[4]DiNicolantonio JJ,Chatterjee S,O'Keefe JH.Dietary salt restriction in heart failure:where Is the evidence?[J].Prog Cardiovasc Dis,2016,58(4):401-406.

[5]Ibrahim I,Kuan WS,Frampton C,et al.Superior performance of N-terminal pro brain natriuretic peptide for diagnosis of acute decompensated heart failure in an asian compared with a western setting[J].Eur J Heart Fail,2017,19(2):209-217.

[6]Pavlov TS,Levchenko V,Ilatovskaya DV,et al.Renal sodium transport in renin-deficient Dahl salt-sensitive rats[J].J Renin Angiotensin Aldosterone Syst,2016,17(3):1-7.

[7]Wu Y,Takahashi H,Suzuki E,et al.Impaired response of regulator of Gαq signaling-2 mRNA to angiotensin II and hypertensive renal injury in Dahl salt-sensitive rats[J].Hypertens Res，2016，39(4):210-216.

[8]Nerbass FB,Pecoits-Filho R,McIntyre NJ,et al.High sodium intake is associated with important risk factors in a large cohort of chronic kidney disease patients[J].Eur J ClinNutr，2015,69 (7):786-790.

[9]洪漢利,陳統(tǒng)清,許玉燕,等.腎病綜合征并發(fā)低位小腸梗阻1例報告[J].吉林醫(yī)學(xué)，2014(2):444-445.

[10]Richards AM,Nicholls MG,Espiner EA,et al.B-type natriure tic peptides and ejection fraction for prognosis after myocardial infarction[J].Circulation，2003,107(22):2786-2792.

[11]Richards AM.The relationship of plasma NT-proBNP to age and outcomes in heart failure[J].JACC Heart Fail，2016,4(9): 746-748.

（本文編輯 楊 瑛）

Building of Hypertensive Heart Failure Rat Models

LI Xinchun,LIANG Hao,HU Zhixi*,HU Siyuan,WEN Yang,ZHONG Senjie,LI Lin (Diagnostic Institute of Traditional Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To build the rat model of hypertension heart failure.Methods Eighteen Dahl salt sensitive rats were divided into normal group and model group feed by 0.3%NaCl low-salt and 8%NaCl high-salt for 20 weeks,respectively.After 20 weeks,the daily behavior and physical signs of the rats were observed.The blood pressure,serum N-terminal-pro-brain-natriuretic-peptide (NT-proBNP)content of the rats were observed.The left ventricular ejection fraction(LVEF) and left ventricular fractional shortening(LVFS)were measured by color doppler ultrasound instrument.The HE dyed myocardial cellsand kidneytissuewereobserved byelectron microscopeoftherats.ResultsBlood pressure ofnormalgroup rats maintained at about 140 mmHg,and blood pressure of the model group rats kept rising up to 250 mmHg after eating high-salt feed.Compared with normal group,there are significant differences in the NT-proBNP,LVEF and LVFS(P＜0.01). Conclusion The rats model can well simulate the disease process that normal secondary hypertension rats develop hypertensive heart failure rats.The rat model can be used for the research of hypertensive heart failure disease.

hypertension;heart failure;Dahl salt sensitive rats;rat models

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.03.004

2016-09-13

國家自然科學(xué)基金項目(81373550)。

李欣春，男，在讀碩士研究生，研究方向：心血管疾病證本質(zhì)與診治規(guī)律。

*胡志希，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:5471313@sohu.com。

本文引用：李欣春，梁 昊，胡志希，胡思遠(yuǎn)，文 陽，鐘森杰，李 琳.高血壓心力衰竭大鼠動物模型的研制[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（3）：245-248.