劉曉丹，成紹武，范婧瑩，宋禎彥，李 平，鄧常清*（.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 408）

人參皂苷Rg1對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡及胞內(nèi)Ca2+變化的影響

劉曉丹1，成紹武1，范婧瑩2，宋禎彥1，李 平1，鄧常清3*
（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，3.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410218）

目的 研究人參皂苷Rg1對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡及胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響。方法 以0、6.25、12.5、25、50、100μg/L人參皂苷Rg1預(yù)處理細(xì)胞24 h，采用Ca2+熒光染料探針Fluo-3/AM負(fù)載細(xì)胞1 h后，50 mmol/L H2O2刺激細(xì)胞，多功能酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度，激光共聚焦顯微鏡實(shí)時監(jiān)測[Ca2+]i變化，Hoechst 33258染色檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果 H2O2可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加（P＜0.01),并增加細(xì)胞凋亡率（P＜0.01)。不同濃度人參皂苷Rg1可呈劑量依賴性的抑制H2O2誘導(dǎo)的HT22[Ca2+]i增加（P＜0.01），抑制細(xì)胞凋亡（P＜0.01)，以50μg/L的作用為最強(qiáng)（P＜0.01)。結(jié)論 人參皂苷Rg1可通過降低H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的升高，抑制氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡。

人參皂苷Rg1；HT22細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；Ca2+濃度

本文引用：劉曉丹，成紹武，范婧瑩，宋禎彥，李 平，鄧常清.人參皂苷Rg1對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡及胞內(nèi)Ca2+變化的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（3）：236-239.

腦缺血發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高，嚴(yán)重威脅人類健康，且病理生理機(jī)制復(fù)雜，目前仍未完全清楚。近年來的腦缺血損傷的病理生理機(jī)制研究表明，神經(jīng)細(xì)胞的胞外Ca2+內(nèi)流增加可引發(fā)細(xì)胞變性，最后導(dǎo)致死亡；興奮性氨基酸及多種神經(jīng)毒素引起神經(jīng)細(xì)胞變性死亡，總是伴隨胞漿Ca2+超負(fù)荷現(xiàn)象，故認(rèn)為細(xì)胞Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常是神經(jīng)元變性的 “最后共同通道”[1]。

人參皂苷Rg1是人參、三七的主要有效成分，對心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有較強(qiáng)的保護(hù)作用，有研究發(fā)現(xiàn)[2-6]，人參皂苷Rg1能夠減輕腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抗氧化損傷等有關(guān)。本研究通過采取H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷模型，觀察人參皂苷Rg1預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡的影響，并通過分析細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的變化，探索人參皂苷Rg1抗HT22細(xì)胞凋亡的作用及與[Ca2+]i的關(guān)系，為人參皂苷Rgl在腦缺血的治療應(yīng)用上提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 人參皂苷Rg1（批號：MUST-16022407）,購自成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%；H2O2（美國sigma公司），F(xiàn)luo-3/AM（（美國sigma公司），α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素溶液、PBS緩沖液、改良臺式液均購自GIBCO公司。

1.1.2 細(xì)胞 HT22細(xì)胞，小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系，低分化，購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院。

1.1.3 主要儀器 激光共聚焦顯微鏡 （日本尼康，型號：A1+)，多功能酶標(biāo)儀 （德國BIOTEC，型號：CYTATION3)，超凈工作臺(蘇州，型號：8WJ-2F0)，倒置顯微鏡(重慶，型號：XDS-1B)，二氧化碳培養(yǎng)箱(德國賀利氏，型號：Heracel1）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HT22細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清，1%青鏈霉素溶液的α-MEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2濃度及飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液，待單層細(xì)胞生長至80%～90%融合后傳代培養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2 人參皂苷Rg1最適濃度摸索 細(xì)胞共分為7組，正常組（α-MEM無血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)）、H2O2損傷組（加入50 mmol/L H2O2刺激細(xì)胞）、不同濃度人參皂苷Rg1（6.25、12.5、25、50、100 μg/L）組。細(xì)胞加入不同濃度人參皂苷Rg1處理24 h后，棄去培養(yǎng)基，用臺式液洗滌2次，加入Fluo-3/AM工作液（熒光探針Fluo-3/AM在負(fù)載細(xì)胞時用臺式液配制成終濃度為 5 μmol/L的工作液），37℃避光培養(yǎng)1 h，棄去熒光探針，用臺式液洗滌2次，加入含終濃度為50 mmol/L H2O2的臺式液繼續(xù)孵育1 h。在多功能酶標(biāo)儀下，選擇激發(fā)波長488 nm進(jìn)行掃描，讀取熒光強(qiáng)度值。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度 細(xì)胞分為3組，正常組（ɑ-MEM無血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)）、H2O2損傷組及人參皂苷Rg1組（加入上述實(shí)驗(yàn)摸索的人參皂苷Rg1最適濃度）培養(yǎng)24 h。Fluo-3/ AM負(fù)載1 h后，棄去熒光探針，用臺式液洗滌2次，H2O2損傷組和人參皂苷Rg1組加入含終濃度為50 mmol/L H2O2的臺式液，在激光共聚焦顯微鏡下觀察選擇貼壁良好、形態(tài)伸展、熒光強(qiáng)度較亮的細(xì)胞，設(shè)置掃描條件為488 nm波長激發(fā)、20%激光強(qiáng)度，同時采集DIC圖像，每3分鐘采集1張，連續(xù)掃描1 h，動態(tài)觀察熒光強(qiáng)度變化情況。選取第1張圖片，15、30 min和1 h4張圖片利用Image J統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度分析。

1.2.4 Hoechst 33258染色檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞分組及處理同上，處理完成后，用PBS漂洗細(xì)胞2次，加入新鮮配置的4%多聚甲醛，4℃固定15 min；PBS洗2次后，加入終濃度為5 mg/L的Hoechst 33258室溫下作用5 min。在倒置熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個200×鏡下視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度人參皂苷Rg1對細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

H2O2刺激后，熒光強(qiáng)度顯著增高（P＜0.01），提示細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度水平顯著增加。人參皂苷Rg1不同濃度組均能夠顯著抑制H2O2損傷后細(xì)胞熒光強(qiáng)度的增高（P＜0.05-P＜0.01），其中以50 μg/L濃度最為明顯（見表1）。故在下面的實(shí)驗(yàn)中選擇50 μg/L濃度的人參皂苷Rg1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度人參皂苷Rg1對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度值影響 （n=5，±s)

表1 不同濃度人參皂苷Rg1對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度值影響 （n=5，±s)

注：與正常組比較**P＜0.05,與H2O2損傷組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常組H2O2損傷組6.25 μg/L濃度組12.5 μg/L濃度組25 μg/L濃度組50 μg/L濃度組100 μg/L濃度組F P熒光強(qiáng)度值7 814.6±430.62 45 496±156 5.1** 37 584±154 5.7△29 211±281 3.6△26 341±457.17△△16 015±108 8.3△△17 318±351.45△△23.268 0.019

2.2 激光共聚焦顯微鏡實(shí)時監(jiān)測人參皂苷Rg1對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度動態(tài)變化

正常細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度較低，在488 nm激發(fā)光激發(fā)下發(fā)出較弱的綠色熒光，且隨著時間的延長，熒光強(qiáng)度無變化（0、15、30 min和1 h）4個時間點(diǎn)熒光強(qiáng)度分別為 70.61、71.12、71.13、71.21）；H2O2刺激后，細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度迅速增高，熒光強(qiáng)度顯著增高，在30 min達(dá)到峰值（0、15、30 min和1 h 4個時間點(diǎn)熒光強(qiáng)度分別為 90.12、126.45、150.22、136.8）（P＜0．05-P＜0．01），50 μg/L濃度的人參皂苷Rg1能夠有效抑制H2O2損傷后細(xì)胞熒光強(qiáng)度的增高 （0、15、30 min和1 h 4個時間點(diǎn)熒光強(qiáng)度分別為94、125.6、102、98.3）（P＜0．05），見圖1。

2.3 人參皂苷Rg1對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞呈現(xiàn)彌漫均勻的低熒光強(qiáng)度，未見凋亡細(xì)胞。經(jīng)H2O2刺激后，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡特征，表現(xiàn)為細(xì)胞核濃縮、破裂，與正常組比較，細(xì)胞凋亡率顯著升高，達(dá)（50.12±1.4）%（P＜0．01），人參皂苷Rg1能夠有效地抑制細(xì)胞凋亡，使凋亡細(xì)胞顯著減少，細(xì)胞凋亡率為（22.04±2.8）%（P＜0．01），見圖2。

圖1 激光共聚焦顯微鏡實(shí)時監(jiān)測不同時間點(diǎn)人參皂苷Rg1對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞[Ca2+]i變化的影響（×200）

圖2 Hoechst 33258染色檢測人參皂苷Rg1對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡(倒置熒光顯微鏡×200)

3 討論

腦缺血損傷機(jī)制復(fù)雜未明，腦缺血時神經(jīng)元損傷因素包括興奮性氨基酸釋放過多、自由基產(chǎn)生增加以及能量代謝障礙等，大多都伴有胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[7]，Ca2+超載可觸發(fā)一系列下游反應(yīng)，包括胱天蛋白酶的激活、ATP合成障礙、鈣依賴性蛋白酶和核酸酸內(nèi)切酶的激活等，而這些事件最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和死亡，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載是缺血性神經(jīng)元損傷的共同徑路。本研究發(fā)現(xiàn)，HT22細(xì)胞損傷后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯增高，且隨著鈣離子濃度的增高，細(xì)胞凋亡率越高，表明鈣超載可能是引起神經(jīng)元死亡和損傷的重要途徑。這與以往的研究相符[8-9]。

人參皂苷Rg1是存在于人參、三七的主要活性成分，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1具有較強(qiáng)的抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤、提高免疫力等藥理作用。近年來，人參皂苷Rg1對心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用，越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。大量動物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明[10-13]，人參皂苷Rg1能通過抑制神經(jīng)元凋亡，減少谷氨酸釋放，抗炎癥反應(yīng)、清除自由基、促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)和再生等機(jī)制改善腦缺血再灌注損傷。本研究通過H2O2建立HT22細(xì)胞氧化損傷模型，研究人參皂苷Rg1能否抑制鈣超載，抑制氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而減輕腦缺血損傷。研究表明，人參皂苷Rg1可成劑量依賴性的減輕氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與抑制鈣超載有關(guān)。

Fluo3-AM為一種脂溶性染料，自身不與Ca2+結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)脂解脫去脂基后生成游離Fluo3，后者是一敏感性鈣指示劑，與游離的Ca2+特異性結(jié)合，并在一定波長激發(fā)后產(chǎn)生熒光，其熒光強(qiáng)度與Ca2+濃度成正比，因而熒光值可反應(yīng)Ca2+濃度的變化情況。

H2O2是一類ROS，它不僅能直接氧化細(xì)胞膜上的脂質(zhì)及蛋白，而且能自由穿過細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)鐵離子反應(yīng)生成·OH等活性更強(qiáng)的自由基，導(dǎo)致系列反應(yīng)。H2O2具有獲得容易、性質(zhì)穩(wěn)定和操作簡單等特點(diǎn)，因此目前H2O2是各類細(xì)胞氧化損傷模型中應(yīng)用最為廣泛的應(yīng)激源之一[14]，因此本項(xiàng)目用H2O2損傷細(xì)胞來建立HT22細(xì)胞氧化損傷模型是可行的。

[1]Matsude T，Arakawa N，Takuma K,et al．SEA0400，a novel and selective inhibitor of the Na+-Ca2+exchanger attenuates rep effusion injury in the vitro and in vivo cerebral ischemic models [J]．J Pharmacol Exp Ther，2001，298(1)：249-256.

[2]吳 露,黃小平,鄧常清,等.人參皂苷Rg1對小鼠腦缺血再灌注后腦組織損傷及Nrf2/HO-1途徑的影響[J].中國病理生理雜志,2013,29 (11):2066-2071.

[3]劉曉丹，鄧常青.黃芪甲昔和三七總皂昔中有效成分抗PC12細(xì)胞氧化損傷的配任研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(1):8-12.

[4]于 利,劉 霞,包翠芬,等.人參皂苷Rg1對腦缺血再灌注大鼠大腦細(xì)胞死亡方式的影響[J].中國臨床解剖學(xué)雜志,2013,31(5):555-559.

[5]陳 彥,吳鴻浩,何 斌,等.人參皂苷Rg1對大鼠海馬神經(jīng)元缺糖氧/復(fù)糖氧后鈣內(nèi)流的影響[J].中國急救醫(yī)學(xué),2012,32(11):1001-1004.

[6]屈惠瑩,袁 靜,包翠芬,等.人參皂苷Rg1對腦缺血再灌注大鼠nNOS、iNOS表達(dá)的影響[J].天津醫(yī)藥,2014,12(9):889-892,893.

[7]Szydlowska K，F(xiàn)ymianski M．Calcimn，ischemia and excitotoxicity[J]．Cell，2010，47(2)：122-129．

[8]李燕華，李瑤宣.腦缺血大鼠水通道蛋白-9 mRNA表達(dá)與鈣離子濃度的改變及其關(guān)系[J].《臨床神經(jīng)病學(xué)雜志》，2008，21(2)：129-132.

[9]石詠梅.腦缺血/再灌注神經(jīng)元鈣離子通道的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2014,20(14):2507-2509.

[10]于 利，劉 霞，包翠芬，等．人參皂苷Rg1對腦缺血再灌注大鼠大腦細(xì)胞死亡方式的影響［J］．中國臨床解剖雜志，2013,31（5）: 555-559.

[11]Xie CL,Li JH,Wang WW，et al．Neuroprotective effect of gin senoside-Rg1 on cerebral ischemia/reperfusion injury in rats by downregulating protease-activated receptor-1 expression[J]．Life Sci.2014,121(2015):145-151.

[12]鄒曉莉，杜繼衛(wèi).人參皂苷Rg1對局灶性腦缺血大鼠iNOS和eNOS表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥,2012,52(13):44-45.

[13]黃小平，盧金冬，丁 煌,等.黃芪和三七的主要有效成分配伍對腦缺血/再灌注小鼠NF-κB信號通路及炎性因子表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2015(1):141-146.

[14]張 斌，夏作理，趙曉民，等．氧化應(yīng)激模型的建立及其評價[J]．中國臨床康復(fù)，2006，10(44)：112-114．

（本文編輯 楊 瑛）

Effect of Ginsenoside Rg1on H2O2Induced Apoptosis and Intracellular Ca2+Concentration in HT22 Cells

LIU Xiaodan1,CHENG Shaowu1，F(xiàn)AN Jingying2，SONG Zhenyan1，LI Ping1，DENG Changqing3*

(1.Key Laboratory of Hunan Province of Rebrovascular Disease Prevention and Treatment of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.College of Integrated of Traditional Chinese and Western Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China; 3.Medical School,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To investigate the effect of ginsenoside Rg1on H2O2induced apoptosis and intracellular Ca2+concentration in HT22 cells.Methods Ginsenoside Rg1with 0,6.25,12.5,25,50 and 100μg/L were used to pre-processing HT22 cells for 24 h,separately.Ca2+fluorescent probe Fluo-3/AM was used to load cells for 1h.Then using 50 mmol/L H2O2stimulate cells.The fluorescence intensity was measured for microplate reader, [Ca2+]i changes were monitored by scanning confocal microscopy.Apoptosis were tested by Hoechst 33258 staining.Results The Ca2+concentration (P＜0.01)and apoptosis (P＜0.01)induced by H2O2increased significantly.Different concentrations of ginsenoside Rg1showed dose dependent inhibition in increasing the HT22[Ca2+]i (P＜0.01)and apoptosis(P＜0.01)induced by H2O2,and the concentation of 50μg/L shows strongest effect(P＜0.01).Conclusion The ginsenoside Rg1could inhibit apoptosis of oxidative apoptosis by reducing the cellular Ca2+level induced by H2O2.

ginsenoside Rg1;HT22 cell;apoptosis;Ca2+concentration

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.03.002

2016-08-30

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81473581），湖南省教育廳項(xiàng)目（14C0859），中西醫(yī)結(jié)合防治心腦疾病的相關(guān)基礎(chǔ)研究湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2015CXTD），中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)湖南省重點(diǎn)學(xué)科開放基金項(xiàng)目。

劉曉丹，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：心腦疾病中西醫(yī)結(jié)合防治研究。

*鄧常清，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：dchangq@@sohu.com。