梁秀美 ??王祥云 ??薛曉鋒 ??齊沛沛 ??劉真真?ち踔?煒 ??周莉 ??王新全 ??王強

摘要建立了蜂蜜和蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS/MS）檢測方法。在QuEChERS方法基礎(chǔ)上，針對目標物化學(xué)性質(zhì)和樣品雜質(zhì)情況，對提取溶液的pH值、提取次數(shù)、凈化材料等參數(shù)進行了優(yōu)化。最終以5%甲酸乙腈溶液提取兩次，無水MgSO4、NaCl鹽析分層，提取液經(jīng)增強型脂類去除材料（EMR）凈化，以LCMS/MS進行測定，基質(zhì)外標法進行定量分析。結(jié)果表明，蜂蜜和蜂花粉中吡蟲啉、吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸的平均加標回收率為86.0%～111.5%，相對標準偏差在1.7%～9.6%之間，檢出限分別為0.20＼，3.50＼，0.40和14.00μg/kg，定量限分別為0.60＼，11.64＼，1.20和45.00μg/kg。本方法分析速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于蜂蜜和蜂花粉中吡蟲啉及其3種代謝物的快速測定。

關(guān)鍵詞液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；蜂蜜；蜂花粉；吡蟲啉；吡蟲啉烯烴；吡蟲啉脲；6氯煙酸；增強型脂類去除材料

1引言

新煙堿類殺蟲劑為昆蟲乙酰膽堿受體激動劑，是繼有機磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類等殺蟲劑之后的第四大類殺蟲劑[1]。吡蟲啉是其代表性藥劑，主要用于防治水稻、小麥、棉田中的蚜蟲、葉蟬、飛虱等30多種刺吸式口器害蟲、地下害蟲[2]。

吡蟲啉對哺乳動物低毒，但對蜜蜂具有較大的潛在毒副作用[3]，主要包括高濃度下的急性毒性以及亞致死濃度下的學(xué)習能力降低[4]、記憶力下降[4，5]、出現(xiàn)非正常的覓食行為[6]及群勢衰弱[7]等慢性毒性[8]。鑒于吡蟲啉對蜜蜂的毒害作用，環(huán)保署與美國農(nóng)業(yè)部于2013年4月重申“使蜂群遠離新煙堿類農(nóng)藥”是保護蜂群的必要舉措[3]。Severine等[9]的研究結(jié)果表明，吡蟲啉的烯烴代謝物等具有與其母體相似的蜜蜂毒性，因此在評估蜂產(chǎn)品中吡蟲啉殘留對蜜蜂的風險時，應(yīng)涵蓋其代謝物殘留的影響。吡蟲啉及其部分代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見表1。

吡蟲啉殘留的分析檢測方法較多，主要有液相色譜法[10，11]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12，13]，但其代謝物的檢測方法較少[14，15]。Kamel等[14]建立了花蜜和花粉中吡蟲啉、噻蟲嗪、呋蟲胺及其代謝物的LCMS/MS檢測方法，以2%三乙胺乙腈提取、經(jīng)C18小柱凈化、氮吹濃縮后過膜進樣，操作較為繁瑣。Garcia等[15]建立了蜜蜂中吡蟲啉和6氯煙酸的LC檢測方法，該方法需要兩次抽濾、兩次萃取、旋蒸濃縮等步驟，且未涵蓋吡蟲啉烯烴及吡蟲啉脲。本研究基于較為成熟的QuEChERS農(nóng)藥殘留快速檢測方法＼[16]，建立了蜂蜜和蜂花粉樣品中吡蟲啉以及吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲和6氯煙酸等3種代謝物殘留量的LCMS/MS快速檢測方法。經(jīng)優(yōu)化后，本方法以酸化乙腈提取兩次，確保目標物的提取效率，以新型凈化脫脂材料EMR替代傳統(tǒng)的分散固相萃取凈化材料，得到更佳的凈化效果。結(jié)果表明，本方法簡便、快速、準確、靈敏，可滿足蜂蜜和蜂花粉中吡蟲啉及其3種代謝物的快速測定要求。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

LC30A液相色譜儀（日本島津公司）；4500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（美國ABSCIEX公司）；68905975氣相色譜質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；HeraeusBiofugePrimoR離心機（美國ThermoScientific公司）；MTN2800D氮吹儀（北京華博科技制造有限公司）；QT2旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；BSA2202S電子天平（北京塞多利斯科學(xué)儀器有限公司）；0.22μm濾膜（天津博納艾杰爾公司）。

蜂產(chǎn)品（蜂蜜和蜂花粉，本地超市，本方法測定無吡蟲啉及其代謝物殘留）；吡蟲啉標準品（1000mg/L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（天津））；吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸標準品（純度均為99.0%，德國Dr.EhrenstorferGmbH公司）；乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲酸銨（色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；三乙胺（TEA，色譜純，美國ROEScientific有限公司）；QuEChERSKits提取粉（6g無水MgSO4、1.5gNaCl）、十八烷基硅烷（C18）、乙二胺N丙基硅烷（PSA）、石墨化炭黑（GCB），均購自天津博納艾杰爾公司；ZSep（55299U，美國Supelco公司）；EMR凈化管（59821010，美國Agilent公司）；無水MgSO4（分析純，永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司）；實驗用水為超純水（MilliQ，美國Millipore公司）。

單標儲備液：以乙腈定容，配制成質(zhì)量濃度分別為40，388，420和879mg/L的吡蟲啉、吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸單標儲備液，于4℃保存。

混標工作液：分別準確移取適量上述單標儲備液，以乙腈定容，配成吡蟲啉質(zhì)量濃度為1mg/L的吡蟲啉混標（吡蟲啉〖KG-3∶〖KG-5吡蟲啉烯烴〖KG-3∶〖KG-5吡蟲啉脲〖KG-3∶〖KG-56氯煙酸=1.0〖KG-3∶〖KG-519.4〖KG-3∶〖KG-52.0〖KG-3∶〖KG-575.0，m/m）儲備液。于4℃保存，用時稀釋成所需濃度。

2.2樣品前處理

準確稱取（5.00±0.05）g蜂產(chǎn)品于50mL離心管中，加入10mL水，渦旋混勻；隨后加入10mL5%甲酸乙腈溶液，渦旋混勻3min，再加入QuEChERSKits提取粉，立即手動劇烈振搖30s，7000r/min離心3min。取上清液于另一個50mL離心管；下層樣品再加5mL5%甲酸乙腈溶液重復(fù)提取一次，合并提取液，待凈化。

EMR凈化管預(yù)先加2mL水渦旋混勻30s進行活化；加入5mL上述提取液，渦旋混勻30s后，7000r/min離心3min；隨后取全部上清液加1.4g無水MgSO4，以除去水分，渦旋混勻30s后，7000r/min離心3min。取0.5mL上清液于2mL離心管中，加入0.5mL水混勻，過0.22μm濾膜，待LCMS/MS測定。

2.3LCMS/MS測定條件

采用文獻＼[14＼]中的儀器條件：UPLCHSST3色譜柱（10cm×2.1mm×1.8μm，美國Waters公司）；流動相A為水，流動相B為5mmol/L甲酸銨甲醇溶液；梯度洗脫程序：0～15min，95%A；15～16min，60%A；16～17min，5%A；17～19min，95%A。流速0.35mL/min，柱溫40℃，進樣量5μL。

質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），正負離子切換掃描方式，選擇多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，噴霧電壓4000V，毛細管溫度350℃；氣簾氣（400Pa）、碰撞氣（7Pa）、噴霧氣（30Pa）和輔助噴霧氣（30Pa）均為氮氣。各化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

3結(jié)果與討論

3.1溶液pH值對提取效率的影響

6氯煙酸為酸性化合物，因此本研究首先考察了2%三乙胺乙腈、乙腈、0.1%～5%甲酸乙腈等不同pH值溶劑對提取效率的影響。取一定濃度的吡蟲啉混標溶液于離心管中，加H2O、NaCl和不同pH值的乙腈，渦旋混勻、離心后，取等體積的上層有機相和水，混勻過膜，待LCMS/MS測定。由圖1可知，在2%三乙胺乙腈、乙腈的提取環(huán)境下，6氯煙酸的提取效率較低，這可能是因為在堿性和中性環(huán)境下〖CM（446氯煙酸以離子形式溶解于水中，降低了溶劑的提取效率；而在酸性條件下，6氯煙酸的提取效率顯著〖CM）

增強。而文獻＼[14＼]表明，以2%三乙胺乙腈提取后，經(jīng)C18柱凈化，LCMS/MS測定，6氯煙酸的回收率在64.1%～93.0%之間，即2%三乙胺乙腈對6氯煙酸具有良好的提取效果，這與本實驗的結(jié)果存在一定的差異。為保障6氯煙酸的提取效率，同時兼顧其它待測物的回收率情況，本實驗最終選擇5%甲酸乙腈為提取溶液。

3.2凈化過程

蜂花粉雖然源于植物花粉，但在其生產(chǎn)過程中，蜜蜂通過混入蠟腺分泌物而形成，從而含有較多蠟質(zhì)。Wiesta等[17]采用正己烷萃取和冷凍等方法去除了蜂花粉中的油脂。本研究也進行了相應(yīng)的嘗試，但效果并不理想。此外，文獻＼[18，19＼]報道ZSep和EMR等凈化材料對于油脂類干擾具有較好的去除效果。因此，本實驗在QuEChERS方法常用凈化材料C18、PSA、GCB之外，對ZSep、EMR等新型凈化材料進行了考察。取樣品提取液，分別采用C18，PSA，GCB或ZSep等材料進行凈化；或取樣品提取液于EMR凈化管中凈化（方法同2.2節(jié)），凈化后經(jīng)脫水過膜，以GCMS測定，其總離子流圖（TIC，圖2和圖3）表明，蜂蜜提取液本身較為純凈，5種凈化材料均可滿足實驗要求；蜂花粉提取液則有較多的干擾物質(zhì)，5種凈化材料均有一定的凈化效果，其中EMR的凈化效果明顯優(yōu)于其它4種凈化材料。其原因可能是EMR通過疏水作用選擇性吸附長鏈脂類，形成脂類EMR聯(lián)合體，并通過離心沉淀或溶于水相的形式實現(xiàn)對提取液的有效凈化[19]。

3.3凈化材料對回收率的影響

文獻＼[14＼]表明，在2%三乙胺乙腈的提取條件下，PSA對6氯煙酸具有強烈的吸附作用，導(dǎo)致添加樣品中6氯煙酸回收率為0。因此，本研究在5%甲酸乙腈的提取條件下，考察了C18、PSA、GCB、ZSep、EMR等備選凈化材料對待測物回收率的影響。除在空白基質(zhì)提取液（見2.2節(jié)）加入一定濃度的標準溶液以及采用LCMS/MS測定外，其余步驟同3.2節(jié)。結(jié)果見圖4，在5%甲酸乙腈提取條件下，除GCB對6氯煙酸有吸附外，其它凈化材料對回收率均無明顯影響。GCB對6氯煙酸的吸附則源于6氯煙酸本身的平面結(jié)構(gòu)[16，20]。

3.4基質(zhì)效應(yīng)

采用LCMS/MS進行殘留測定時應(yīng)盡量避免基質(zhì)效應(yīng)[21]，同時基質(zhì)效應(yīng)也可反映凈化效果。為比較C18、PSA、ZSep和EMR的凈化效果，分別以4種材料對蜂蜜、蜂花粉提取液（見2.2節(jié)）進行凈化，并配制吡蟲啉及其代謝物的系列濃度基質(zhì)標準溶液，同時配制相應(yīng)的溶劑標準溶液。經(jīng)LCMS/MS測定后，以化合物的峰面積和濃度作圖，繪制標準曲線。以不同基質(zhì)標準線性回歸方程的斜率與溶劑標準液的斜率比值評判基質(zhì)效應(yīng)的程度：比值>1，表明存在基質(zhì)增強效應(yīng)；比值<1，存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；比值越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小，凈化效果越好；當比值遠離1，表明存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，必要時需進一步凈化。本實驗結(jié)果表明，經(jīng)C18、PSA、ZSep、EMR分別凈化后，蜂蜜中吡蟲啉及其3種代謝物的比值在0.96～1.06之間，基質(zhì)效應(yīng)輕微。蜂花粉提取液中的基質(zhì)效應(yīng)較強，具體結(jié)果如圖5所示：除6氯煙酸存在一定的基質(zhì)增強效應(yīng)，其余待測物均呈現(xiàn)出明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)；其中C18、PSA、ZSep和EMR抑制效應(yīng)總體呈依次減弱，這也說明其凈化效果依次增強。雖然ZSep和EMR的基質(zhì)效應(yīng)較為接近，考慮到其在3.2節(jié)實驗中表現(xiàn)出了最佳的凈化效果，本實驗最終選擇EMR作為凈化材料。

3.5確定提取次數(shù)

為確保蜂蜜，尤其是蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物的提取效率，進一步考察了提取次數(shù)的影響。結(jié)果表明，蜂蜜中的待測物在第2次提取時仍有1%～5%的殘留，而第3次提取時則僅有<0.5%的殘留；蜂花粉中的待測物提取效率相對較低，第2次提取時尚有6%～16%的殘留，第3次提取時仍有約3%的殘留。因此，兩次提取即可將蜂蜜和蜂花粉中97%以上的待測物充分提取。本實驗最終對蜂蜜和蜂花粉樣品進行兩次提取，以確保提取效率。

3.6線性范圍、檢出限和定量限

在2.3節(jié)的色譜條件下，配制吡蟲啉及其代謝物的系列基質(zhì)標準溶液，經(jīng)LCMS/MS測定后，以化合物的峰面積和濃度做圖，繪制標準曲線。以添加回收樣品峰響應(yīng)值為3倍噪音的添加濃度為方法檢出限（LOD），以10倍噪音的添加濃度為方法定量限（LOQ）。具體結(jié)果見表2，在蜂蜜和蜂花粉中，2吡蟲啉、吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸的LOD分別為0.20＼，3.50＼，0.40和14.00μg/kg，LOQ分別為0.60＼，11.64＼，1.20和45.00μg/kg，相關(guān)系數(shù)在0.9992～1.0000之間，能夠滿足定量分析的基本要求。

3.7準確度和精密度

在蜂蜜和蜂花粉中添加適當體積的吡蟲啉混合標準溶液，使添加水平均分別為LOQ，5LOQ和10LOQ。由表3可知，在蜂蜜和蜂花粉中，4種化合物的平均加標回收率在86.0%～111.5%之間，相對標準偏差（RSD）在1.7%～9.6%之間，方法具有較好的回收率和重現(xiàn)性。

[LM][HT5”SS][HJ*4]表3蜂蜜和蜂花粉中的加樣回收率和相對標準偏差（n=5）

Table3RecoveryandRSDofspikedhoneyandpollen（n=5）

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AbstractAmethodwasdevelopedforthedeterminationofimidaclopridanditsmetabolitesimidaclopridolefin，imidaclopridureaand6chloronicotinicacidinhoneyandbeepollenbyliquidchromatographytandemmassspectrometry（LCMS/MS）.OnthebasisoftypicalQuEChERSmethod，thepHandtimesofextractionsolvent，sorbentswereoptimizedtoensuretheextractionefficiencyandthepurificationofextraction.Finally，themethodwasdevelopedasfollows：matrixwasextractedwith5%formicacidacetonitriletwice，andtheextractionwascleanedwithenhancedmatrixremovallipid（EMR），detectedwithLCMS/MSandquantifiedwithexternalmatrixstandards.Theresultsindicatedthattheaveragespikedrecoveriesofimidacloprid，imidaclopridolefin，imidaclopridureaand6chloronicotinicacidinhoneyandpollensampleswere86.0%-111.5%withrelativestandarddeviations（RSDs）of1.7%-9.6%，theLODswere0.20，3.50，0.40and14.00μg/kg，andtheLOQswere0.60，11.64，1.20and45.00μg/kg.Themethodwasrapidandsimplewithhighsensitivityandgoodreproducibility，andsuitableforthedeterminationofimidaclopridanditsthreemetabolitesresiduesinhoneyandbeepollen.

KeywordsLiquidchromatographytandemmassspectrometry；Honey；Hollen；Imidacloprid；Imidaclopridolefin；Imidaclopridurea；6Chloronicotinicacid；EnhancedmatrixremovalLipid

（Received15November2016；accepted6February2017）