楊德良+曾凡喜+孫銘+顧文華+李力

摘要 膠原蛋白纖維與同樣具有周期性結(jié)構(gòu)表面的羥磷灰石等礦物質(zhì)晶體能夠通過多種作用在介觀尺度上相互識別，從而有效地進行規(guī)范骨骼、牙齒等器官生長的生物礦化。在本研究中，反相利用生物礦化原理，開發(fā)出一種與熱壁外延生長（Hot wall epitaxy）技術(shù)效果相似的生物大分子納米線陣列的簡單制備技術(shù)，成功地將5～10 μg/mL的天然I型鼠尾膠原蛋白單體溶液在云母晶體的（001）晶面上培育成取向單一且長程有序的膠原蛋白納米線陣列。原子力顯微鏡實驗結(jié)果表明，納米線陣列隨膠原蛋白單體濃度增大而變得致密，但是單條納米線的寬度與高度較為穩(wěn)定，分別約為60.0和1.5 nm。有納米線覆蓋的云母晶面親水性好，晶面接觸角由25.8°降為9.5°。基于電子背面散射衍射和透射電子顯微鏡的分析表征結(jié)果，納米線的取向應(yīng)沿云母＼[1〖TX-10＼]方向， 更詳實地驗證了膠原蛋白納米線的準(zhǔn)外延生長機理。

關(guān)鍵詞 膠原蛋白； 外延生長； 生物礦化； 納米線； 電子衍射

1引言

外延生長（Epitaxial growth）常指一種礦物質(zhì)晶體在另一種礦物質(zhì)晶體表面生長，因而在界面上兩種礦物質(zhì)具有相同晶體結(jié)構(gòu)取向的現(xiàn)象[1～5]。半個多世紀(jì)以來，利用外延生長原理在晶體基質(zhì)表面控制和研究鍍膜分子的膜層結(jié)構(gòu)以及生長動力學(xué)已成為熱門研究領(lǐng)域，并取得了諸多成果[1～13]。二十世紀(jì)中后期多種商品化無機發(fā)光二極管便是利用液相外延生長技術(shù)制備的[6]。近二十年來，結(jié)合有機化學(xué)中的尺寸與功能可調(diào)的分子合成技術(shù)， 以及各種微觀晶體結(jié)構(gòu)的基質(zhì)選擇，在超高真空背景下利用分子束沉積技術(shù)在基質(zhì)表面控制分子膜層晶體的生長，為獲得功能可預(yù)測的新型微納光電材料與器件提供了多種可能性[7～9]。例如，通過熱壁外延生長（Hot wall epitaxy）技術(shù)將對六聯(lián)苯（pSexiphenyl）等高量子效率的藍(lán)光小分子材料在云母、ITO等基質(zhì)表面生成有序的納米線陣列薄膜[10～13]， 由于長程有序，表現(xiàn)出很強的光學(xué)各向異性。該薄膜還能產(chǎn)生光學(xué)增益， 獲得隨機激光，可用于制備有偏振特性的電致發(fā)光器件[12，13]。

外延生長在生物化學(xué)領(lǐng)域并不多見。但在自然界中，有規(guī)則重復(fù)結(jié)構(gòu)的膠原蛋白纖維能夠在介觀尺度上與礦物晶體相互識別，從而給生物礦化提供支架，有效地調(diào)控礦物晶體生長的啟動與阻斷，在尺寸與取向方面規(guī)范骨骼、牙齒等器官的生長[14，15]。另一方面，反相利用礦物晶體與生物大分子的識別作用，在緩沖溶液中控制無機晶體表面的生物大分子自組裝也同樣具有可行性[16～19]。這種生物大分子在基質(zhì)表面的外延生長對深入研究生物大分子功能，合成新型微納材料，以及制備特異高效的生物探針都具有重要意義[20～22]。

本研究以天然I型鼠尾膠原蛋白單體和云母晶體為原料，開發(fā)了一種生物大分子在電荷周期性分布的晶體表面通過液相外延生長來合成納米線陣列的“反相生物礦化”技術(shù)。此技術(shù)應(yīng)用方便，無需定向流動的緩沖液培養(yǎng)[16]或復(fù)雜緩沖液的配制[17～19]?；诟鞣N成像和分析手段的表征結(jié)果，對合成的膠原蛋白納米線陣列的性質(zhì)進行了初步探討。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Bruker Dimension Icon原子力顯微鏡和FESP懸臂探針（德國布魯克公司）， 探針為鍍金和鉻的硅材質(zhì)，懸臂與針尖的力常數(shù)均為2.8 N/m，針尖高15 μm，錐角25°，曲率半徑12 nm； Kruss DSA100液滴形狀分析儀（德國Kruss公司）； Auriga FIB聚焦離子束場發(fā)射掃描雙束電鏡（德國Zeiss公司）； 空間分辨率50 nm。FEI Tecnai G2 20 LaB6高分辨透射電鏡（美國FEI公司）。

5 mg/mL膠原蛋白單體溶液（Rat tail tendon collagen type I，北京索萊寶科技有限公司），溶于6 mmol/L乙酸； Na2HPO4、NaH2PO4、K2HPO4、KH2PO4（CP，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。2M1 muscovite云母基片（北京中鏡科儀技術(shù)有限公司）。單面與雙面膠帶（美國3M公司）。實驗用水為自制去離子水，室溫電阻率約18 MΩ·cm。

2.2實驗方法

使用磷酸鹽緩沖溶液配制特定濃度的膠原蛋白單體溶液。將云母片切割成約1 cm×1 cm的方片，用雙面膠帶粘在載玻片中央，用單面膠帶撕開云母片表層， 使其露出新鮮晶面（001），滴上膠原蛋白單體溶液覆蓋晶面約15 min后， 除去晶面上的蛋白溶液，并用緩沖溶液清洗晶面1～2次，以除去吸附不牢的蛋白質(zhì)，接著用緩沖溶液覆蓋云母晶面，進行約12 h的培育。完成培育后立即除去晶面上的緩沖溶液，用電熱吹風(fēng)烘干后對晶面上的膜層進行表征。

原子力顯微鏡設(shè)置為輕敲模式（Tapping mode），振幅約75 nm，驅(qū)動頻率約192 kHz，接近探針懸臂在空氣中的共振頻率。液滴形狀分析儀進行靜態(tài)接觸角測試前將樣品置于真空干燥箱內(nèi)脫氣30 min。透射電鏡/選區(qū)衍射（TEM/SAED）實驗前將樣品撕?。?lt;100 nm）后打孔成直徑3 mm的樣品；在TEM模式下檢測到納米線結(jié)構(gòu)后，切換到NBD（Nanobeam electron Diffraction）模式對定點獲取電子衍射花樣，然后進行標(biāo)定分析。電子背面散射衍射（EBSD）實驗前，對樣品表面進行鍍金處理（厚度約5 nm）。EBSD設(shè)置：加速電壓20 kV，工作距離13 mm。

3結(jié)果與討論

3.1膠原蛋白單體在云母基質(zhì)上的自組裝

膠原蛋白是構(gòu)成所有多細(xì)胞生物結(jié)締組織的主要組成成分的蛋白質(zhì)的總稱。作為最重要的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，膠原蛋白單體能自組裝成膠原纖維來構(gòu)架并支撐所有無脊椎與脊椎動物的組織器官[14]。I型膠原蛋白最常見，其單體原膠原（Tropocollagen）為繩狀的超螺旋分子，長約300 nm，直徑約1.5 nm。盡管原膠原單股螺旋的周期為85.5 ，但超螺旋結(jié)構(gòu)沿軸向的殘基與電荷分布周期約為8.6 。在末端端肽（Telopeptide）的引導(dǎo)下，原膠原單體會互相錯開平行排列自組裝成細(xì)長的原纖維（Protofibril）。在生物礦化過程中，羥基磷灰石會首先在原纖維的特定位點結(jié)晶，并逐漸生長成帶狀小塊，最后形成高度有序的交錯結(jié)構(gòu)。

本實驗分別使用不同pH值的Na2HPO4/NaH2PO4和K2HPO4/KH2PO4緩沖溶液配制I型鼠尾膠原蛋白單體溶液，并用同種緩沖溶液來培育膠蛋白自組裝。在pH 6.8～8.0的范圍內(nèi)，鈉鹽溶液中的膠原蛋白單體均能在云母晶體表面自組裝成取向單一的蛋白纖維納米線陣列。圖1顯示的是用不同濃度的膠原蛋白單體在云母晶體（001）晶面上自組裝形成的納米線陣列的AFM圖。緩沖溶液均為Na2HPO4/NaH2PO4 （pH =7.5），其中圖1A的膠原蛋白單體濃度為5 μg/mL，圖1B的膠原蛋白單體濃度為10 μg/mL。 很顯然，陣列中的納米線隨膠原蛋白單體濃度增大而變得更加致密，單條納米線更長，且納米線之間的交聯(lián)逐漸顯著。但是測量結(jié)果表明，由不同濃度的膠原蛋白單體溶液培育出的單條納米線的寬度與高度較為穩(wěn)定，寬度約為60 nm，高度約為1.5 nm。當(dāng)使用鉀鹽緩沖溶液時，未在云母晶體表面上觀測到任何自組裝現(xiàn)象發(fā)生。

3.2膠原蛋白納米纖維陣列的特性

分別對新撕開的和已有膠原蛋白納米線膜層覆蓋的云母（001）晶面樣品進行了靜態(tài)水滴接觸角的基線圓法測試。為減小測量誤差，對同一樣品取3個點進行測量后取平均值。測量結(jié)果表明（見電子版文后支持信息： 圖S1），云母晶面接觸角為25.8°，而有蛋白納米線覆蓋（10 μg/mL）的晶面接觸角僅為9.5°。上述結(jié)果表明，膠原蛋白納米線膜層顯著增強了云母晶面的親水性，有利于使用該材料生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)器皿。

采用“反相生物礦化”技術(shù)制備出的膠原蛋白納米線陣列與通過熱壁外延生長技術(shù)生成的對六聯(lián)苯（pSexiphenyl）納米線陣列[10，11]極為相似：（1）納米線受云母基質(zhì)表面電荷分布影響，取向單一，且納米線陣列結(jié)構(gòu)長程有序；（2）納米線密度由云母晶體表面吸附（沉積）的單體分子的數(shù)量決定。

3.3膠原蛋白納米線陣列的取向機理

云母基片上的膠原蛋白納米線陣列的形成可能受培養(yǎng)溶液的流動方向規(guī)導(dǎo)[16]或受溶液水分揮發(fā)過程中的致干效應(yīng)的影響[17]， 但是更傾向于接受“反相生物礦化”原理下的準(zhǔn)外延生長現(xiàn)象[18，19]。根據(jù)外延生長理論，有兩個因素決定外延晶體的結(jié)構(gòu)：（1）界面上的結(jié)合力（包括化學(xué)鍵、靜電力與范德華力）；（2）界面上的晶格匹配[7]。在真空環(huán)境下，有機分子在無機晶體表面的外延生長受控于較弱的靜電力與范德華力，在對基質(zhì)加熱時， 有機分子可在基質(zhì)表面漂移；盡管有機分子與無機基質(zhì)的晶格可能不匹配，但基質(zhì)表面的電荷分布仍能對有機分子的取向起規(guī)范作用。因而，在熱壁外延生長實驗中，取向較為規(guī)范的有機分子單體在基質(zhì)晶面上漂移時，碰撞結(jié)合形成晶種，并生長成更大的二維晶體，甚至形成有特定取向的納米線陣列。由于納米線的形成是單體分子在二維晶面上側(cè)向結(jié)合所致，因此單體濃度在一定范圍內(nèi)，納米線有恒定高度和寬度。盡管本實驗中培養(yǎng)膠原蛋白的液相環(huán)境可能更為復(fù)雜，〖JP2但是，在界面上水分子與吸附在云母晶面上的單層膠原蛋白單體之間最重要的作用力，即熵力（Entropy force），也傾向于推動蛋白單體在云母晶面上漂移，從而有助于自組裝生成納米線陣列。同時，緩沖溶液中的離子成分對納米線陣列的形成至關(guān)重要，使用鉀鹽緩沖溶液的樣品則觀測不到膠原蛋白納米線。這可能是特定的離子會影響基質(zhì)與蛋白〖JP單體在界面的結(jié)合，或?qū)δz原蛋白的成纖有較強的抑制所致[18]。

目前， 尚未有詳實和精準(zhǔn)的晶體結(jié)構(gòu)表征實驗來確證膠原蛋白納米線陣列的外延生長機理， 本研究首先對覆蓋納米纖維的云母基片進行了TEM的選區(qū)衍射（SAED）實驗。通過對衍射光斑的標(biāo)定與坐標(biāo)分析，納米線的取向大致與云母＼[001＼]晶軸成60°夾角（見電子版文后支持信息：圖S2），這與文獻＼[18＼]報道Laue衍射實驗結(jié)果一致。此外，在云母晶面熱壁外延生長的對六聯(lián)苯納米線陣列也和云母＼[001＼]晶軸大致成60°夾角（通過＼[1 2〖TX- 1〖TX-＼]psp//＼[ 3〖TX- 4 0＼]mica推導(dǎo)出PSP納米線//＼[1〖TX- 1 0＼]mica）[10，11]，表明這兩種截然不同的生長環(huán)境下納米線生長機理的相似性。

本實驗中所用的基質(zhì)云母（Mica， 2M1 muscovite）組成大致為{KAl2（AlSi3O10）（OH）2}，屬于單斜晶系（a=5.2906 ， b=9.0080 ， c=20.0470 ， β=95.757°）， 晶胞是互成120°的雙層結(jié)構(gòu)[23]。云母片可以層層撕開而露出與前一層原子排列成120°的嶄新晶面。如圖2A所示，在每個單層里，中心的Al與O以八面體結(jié)構(gòu)組合并被表面的Si/O層包夾。（001）晶面的Si/O以四面體結(jié)構(gòu)連接形成六邊形的O2

Symbolm@@ 空洞，容納層間的K+。在溶液中，晶體表面的K+可被其它離子或帶電基團取代。由于Si/O四面體結(jié)構(gòu)的變形導(dǎo)致一部分氧離子凹陷下去0.22 ，使得氧離子空洞呈不規(guī)則六邊形，并在整個晶面上形成如圖2B所示沿＼[1〖TX-10＼]方向，與＼[001＼]晶軸成60°的帶負(fù)電狹長凹槽，這也是（001）晶面上電荷分布的二次對稱軸。此對稱軸使得唯有沿＼[1〖TX-10＼]方向或垂直于＼[1〖TX-10＼]方向的電荷分布是唯一的。根據(jù)此對稱性以及觀測到膠原蛋白納米線陣列取向的單一性，可以推斷納米線的取向或者平行于該狹長氧負(fù)離子凹槽，或者垂直于該方向。

對鍍金處理的樣品表面（鍍金厚度約5 nm）進行的EBSD實驗也許可以進一步確定納米線的取向。圖3為某特定樣品選區(qū)SEM圖像及該區(qū)背散射電子衍射花紋圖?；趯υ搮^(qū)多點衍射花紋進行標(biāo)定和坐標(biāo)分析，納米線的取向卻大致與云母＼[001＼]晶軸成0°。這與納米線取向沿云母＼[1〖TX-10＼]方向并不矛盾：可能是制樣過程中對云母晶面造成破壞，使下層扭轉(zhuǎn)120°的晶面露出所致（圖3C）。如果垂直于＼[1〖TX-10＼]方向，納米纖維則不可能與云母＼[001＼]晶軸平行。基于理論推導(dǎo)和實驗結(jié)果，以及在云母晶面上通過熱壁外延生長的對六聯(lián)苯納米線的取向（PSP納米線//＼[1〖TX-10＼]mica）[10，11]， 之前研究報道膠原蛋白在云母晶面沿＼[110＼]方向生長的結(jié)果需進一步驗證[18]。

4結(jié) 論

利用“反相生物礦化”原理，開發(fā)出一種可與熱壁外延生長技術(shù)效果媲美，但實驗操作更簡便的生物大分子納米線陣列的制備方法， 無需超凈室或真空環(huán)境，所有操作均在室溫下進行，不需對基質(zhì)晶體進行加熱。 此方法生成的蛋白納米纖維陣列結(jié)構(gòu)可控，為生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)器皿、制備高特異性的生物探針，以及合成新型有機微納光電材料與器件提供了一種可行技術(shù)。

References

1Ward M D. ACS Nano， 2016， 10（7）： 6424-6428

2YU WeiHua， SHENG JuanJuan. Chinese J. Anal. Chem.， 1986， 14（3）： 239-239

俞薇華， 盛娟娟. 分析化學(xué)， 1986， 14（3）： 239-239

3SUN Peng， WANG Chao， YUAN Guang， LI JunJie， GU ChangZhi. Chinese J. Lumin.， 2016， 37（7）： 793-797

孫 鵬， 王 超， 元 光， 李俊杰， 顧長志. 發(fā)光學(xué)報， 2016， 37（7）： 793-797

4ZHANG QuanLin， SU LongXing， WU TianZhun， WANG YuChao， ZHU Yuan， CHEN MingMing， GUI XuChun， TANG ZiKang. Chinese J. Lumin.， 2015， 36（10）： 1171-1177

張權(quán)林， 蘇龍興， 吳天準(zhǔn)， 王玉超， 祝 淵， 陳明明， 桂許春， 湯子康. 發(fā)光學(xué)報， 2015， 36（10）： 1171-1177

5Lim S H， Ko Y H， Rodriguez C， Gong S H， Cho Y H. Light： Sci. Appl.， 2016， 5（2）： e16030

6Nelson H. J. Cryst. Growth， 1974， 27： 1-5

7Tersoff J， Tromp R M. Phys. Rev. Lett.， 1993， 70（18）： 2782-2785

8Shekhah O， Wang H， Paradinas M， Ocal C， Schüpbach B， Terfort A， Zacher D， Fischer R A， Woll C. Nat. Mater.， 2009， 8（6）： 481-484

9Jesse S， Borisevich A Y， Fowlkes J D， Lupini A R， Rack P D， Unocic R R， Sumpter B G， Kalinin S V， Belianinov A， Ovchinnikova O S. ACS Nano， 2016， 10（6）： 5600-5618

10Plank H， Resel R， Purger S， Keckes J， Thierry A， Lotz B， Andreev A， Sariciftci N S， Sitter H. Phys. Rev. B， 2001， 64（23）： 235423

11Plank H， Resel R， Andreev A， Sariciftci N S， Sitter H. J. Cryst. Growth， 2002， 237239（3）： 2076-2081

12Zenc C， Cerullo G， Lanzani G， Graupner W， Meghdadi F. Phys. Rev. B， 1999， 59（22）： 14336-14341

13Andreev A， Quochi F， Cordella F， Mura A， Bongiovanni G， Sitter H， Hlawacek G， Teichert C， Sariciftci N S. J. Appl. Phys.， 2006， 99（3）： 034305

14Puleo D A， Bizios R. Biological Interactions on Materials Surfaces： Understanding and Controlling Protein， Cell， and Tissue Responses， Springer Science， Springer， 2009， pp. 200-218

15Ihli J， Clark J N， Ct A S， Kim Y Y， Schenk A S， Kulak A N， Comyn T P， Chammas O， Harder R J， Duffy D M， Robinson I K， Meldrum F C. Nat. Commun.， 2016， 7： 13141

16Jiang F， Horber H， Howard J， Muller D J. J. Struct. Biol.， 2004， 148： 268-278

17Bozec L， Horton M. Biophys. J.， 2005， 88（6）： 4223-4231

18Sun M， Stetco A， Merschrod E F. Langmuir， 2008， 24（10）： 5418-5421

19Leow W W， Hwang W. Langmuir， 2011， 27（17）： 10907-10913

20Xiao G， Zhou J F， Huang X， Liao X P， Shi B. RSC Adv.， 2014， 4（8）： 4010-4019

21Ghosal K， Thomas S， Kalarikkal N， Gnanamani A. J. Polym. Res.， 2014， 21（5）： 410

22Li P P， Chen X， Yang W S. Langmuir， 2013， 29（27）： 8629-8635

23Guven N Z. Zeitschrift für KristallographieGrystalline Mater.， 1971， 134： 196-212

AbstractCollagen fibrils and hydroxyapatite might recognize each other at the mesoscale by multiple cooperative interactions due to their intrinsically repetitive structured surfaces， and thus effectively directing the biomineralization， a biological process involving regulating the growth of bones， teeth and other organs. In this work， we developed a simple technique to prepare nanowire arrays of biological macromolecules by reversely using the biomineralization mechanism， with results similar to the hot wall epitaxy， a molecular beam deposition technique under vacuum. With this technique， we successfully cultured 5-10 μg/mL rat tail type I collagen monomer solutions into collagen nanowire arrays on the mica （001） lattice plane along one unique direction across the whole cleavage surface. The atomic force microscope experiments indicated that the nanowires in the arrays became more crowded with higher monomer concentration， but their width and height remained unchanged， about 60.0 nm and 1.5 nm， respectively. The collagen nanowire coating enhanced the hydrophilicity of the mica surface， reducing the contact angle from 25.8° to 9.5°. Based on the characterization results of electron back scattering diffraction and transmission electron microscope， the collagen nanowires were most likely to be oriented along the mica ＼[1〖TX-10＼] direction， which validated the quasiepitaxial growth mechanism in more details.

KeywordsCollagen； Epitaxial growth； Biomineralization； Nanowire； Electron diffraction

（Received 3 November 2016； accepted 1 December 2016）

The work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 51303082）