陳秋紅，陳志泉，黃佳妮，黃河清,2

(1.中山大學(xué)藥學(xué)院，2.廣東省疾病模式動(dòng)物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006)

MRTF-A通過NF-κB參與AGEs誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中FN、ICAM-1的表達(dá)

陳秋紅1，陳志泉1，黃佳妮1，黃河清1,2

(1.中山大學(xué)藥學(xué)院，2.廣東省疾病模式動(dòng)物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006)

目的 該研究觀察在糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)中，心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MRTF-A的變化及其對(duì)細(xì)胞黏附分子(ICAM-1)及纖維連接蛋白(FN)的影響，探討MRTF-A是否通過影響NF-κB信號(hào)通路參與糖尿病腎病。方法 AGEs條件下，抑制劑CCG-1423抑制MRTF-A，或?qū)RTF-A進(jìn)行過表達(dá)，干擾處理，通過Western blot檢測MRTF-A、 ICAM-1和FN的蛋白水平變化及p65在細(xì)胞核內(nèi)的水平。結(jié)果 在AGEs誘導(dǎo)的GMCs中，MRTF-A的蛋白表達(dá)增加；干擾或抑制MRTF-A能夠下調(diào)AGEs誘導(dǎo)的FN 和 ICAM-1的蛋白表達(dá)及p65入核水平；而過表達(dá) MRTF-A 則進(jìn)一步上調(diào)FN 和 ICAM-1的蛋白表達(dá)及p65入核水平。結(jié)論 AGEs能夠上調(diào)GMCs中MRTF-A的表達(dá)，且MRTF-A通過影響NF-κB信號(hào)通路參與介導(dǎo)了AGEs誘導(dǎo)的FN 和 ICAM-1的蛋白表達(dá)。

糖尿病腎病；腎小球系膜細(xì)胞；AGEs；MRTF-A；p65；FN；ICAM-1

腎臟纖維化是糖尿病腎病(diabetes nephropathy，DN)的主要病理特征之一，腎小球系膜細(xì)胞過度增殖及纖維化在 DN 病程中起著關(guān)鍵作用[1-2]。DN 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括多元醇通路激活、氧化應(yīng)激、炎癥等，其中慢性炎癥反應(yīng)是DN公認(rèn)的主要發(fā)病機(jī)制之一[3-5]。糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)在DN病程中發(fā)揮著重要作用。研究表明AGEs能夠激活NF-κB信號(hào)通路，使腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cells, GMCs)中細(xì)胞黏附分子(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)等炎癥纖維化因子表達(dá)增加，從而參與糖尿病腎臟纖維化的病理進(jìn)程[6]。

心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-A(myocardin related transcription factor-A，MRTF-A)是轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活輔助因子，MRTF-A能與含有MADS序列元件的轉(zhuǎn)錄因子如血清應(yīng)答因子(serum response factor，SRF)結(jié)合，調(diào)控平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化[7]。MRTF-A的激活受到RhoA/ROCK信號(hào)調(diào)控，后者在糖尿病及糖尿病腎病的調(diào)控作用均有大量報(bào)道[8-9]。研究表明，MRTF-A-/-小鼠在給予高糖高脂飲食或注射STZ后，相對(duì)于野生型小鼠，其糖耐量、胰島素抵抗和微量白蛋白尿均有所改善[10]。然而AGEs誘導(dǎo)的糖尿病腎病的病理進(jìn)程中，MRTF-A是否能夠影響NF-κB信號(hào)通路，參與介導(dǎo)AGEs誘導(dǎo)的FN和ICAM-1的蛋白表達(dá)引起我們極大的興趣。

據(jù)此，本研究觀察了在AGEs誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中，MRTF-A的變化及其對(duì) ICAM-1、FN等炎癥纖維化因子的表達(dá)影響；探討了MRTF-A對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響調(diào)節(jié)。結(jié)果證實(shí)：MRTF-A通過協(xié)同p65入核，參與介導(dǎo)了AGEs 誘導(dǎo)GMCs的ICAM-1、FN等炎癥纖維化因子的表達(dá)調(diào)節(jié)，在糖尿病腎臟纖維化發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞的傳代和培養(yǎng) 大鼠腎小球系膜細(xì)胞根據(jù)已報(bào)道的方法進(jìn)行原代培養(yǎng)并保存[11]，復(fù)蘇后培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中，置于37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代，按目的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；PBS粉末(武漢博士德公司)；BSA(無脂肪酸，MP)；D-葡萄糖(Amresco)；蛋白酶抑制劑(Pierce)；CCG-1423(Santa Cruz)；識(shí)別ICAM-1、FN、MRTF-A、p65抗體(Santa Cruz)；識(shí)別α-tubulin抗體(Sigma)；識(shí)別Lamin-B抗體(Abcam)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Promega)；核蛋白提取試劑盒(active motif)；雙人單面超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；電子分析天平(Mettler-Toledo)。

1.3 AGEs制備 以D-葡萄糖和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，無脂肪酸)為原料制備AGEs。將0.8 g BSA與1.8 g葡萄糖溶于20 mL PBS(0.2 mol·L-1，pH 7.4)，充分混勻后用0.22 μm微孔濾膜除菌，密封，置于37 ℃避光孵育90 d。制備結(jié)束后，用10 mmol·L-1無菌PBS(pH 7.4)透析96 h除去未結(jié)合的葡萄糖。對(duì)照組中不含葡萄糖，其他條件一致[12]。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 MRTF-A過表達(dá)質(zhì)粒及空載購于Addgene。腎小球系膜細(xì)胞于孵箱培養(yǎng)24 h后開始轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine? LTX & Plus Reagent說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h后，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12～16 h，然后再改換含AGEs(100 mg·L-1)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h或1 h。

1.5 siRNA干擾實(shí)驗(yàn) MRTF-A siRNA構(gòu)建于吉瑪基因公司，序列如下：sense:5′-UGGAGCUGG UGGAGAAGAATT-3′；antisense: 5′-UUCUUCUCCACCAGCUCCATT-3′。細(xì)胞融合至40%～50%匯合度時(shí)開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按Lipofectamine? RNAiMAX Reagent說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h后，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12～16 h，然后再改換含AGEs(100 mg·L-1)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 或1 h。

1.6 Western blot 免疫印跡 細(xì)胞處理結(jié)束，根據(jù)核蛋白提取試劑盒說明書提取核蛋白或者用預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制劑)，收集細(xì)胞裂解液于EP管中，冰上孵育，離心，取上清。進(jìn)行BCA法蛋白定量，按上樣量15 μg進(jìn)行分裝，沸水加熱變性。然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，將條帶于對(duì)應(yīng)的一抗溶液中4 ℃孵育過夜。次日，用對(duì)應(yīng)的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后于Image Quant LAS4000mini設(shè)備中進(jìn)行顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析比較。多組間比較用單因素方差分析，兩組組間比較、組內(nèi)比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MRTF-A在AGEs誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中表達(dá)增加 我們首先觀察AGEs 對(duì)MRTF-A的表達(dá)影響。從Fig 1可以看出，在AGEs處理腎小球系膜細(xì)胞后，MRTF-A的蛋白水平呈時(shí)間和劑量依賴性增加。而等量的BSA對(duì)照對(duì) MRTF-A的蛋白無明顯影響。為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

Fig 1 Expression of MRTF-A in AGEs-induced GMCs

*P<0.05，**P<0.01vscontrol

2.2 MRTF-A抑制劑CCG-1423對(duì)FN及ICAM-1表達(dá)影響 CCG-1423是RhoA/MRTF-A/SRF通路抑制劑，同時(shí)也能直接結(jié)合MRTF-A并抑制其入核[13]。CCG-1423(工作濃度為1μmol·L-1)預(yù)處理2 h后，更換AGEs處理24 h，如Fig 2結(jié)果顯示，CCG-1423能明顯抑制MRTF-A本身的蛋白表達(dá)，同時(shí)，與AGEs對(duì)照組相比，F(xiàn)N、ICAM-1的表達(dá)明顯下調(diào)。

Fig 2 Effect of MRTF-A inhibitor CCG-1423 on FN and ICAM-1 expressions in AGEs-induced GMCs

*P<0.05vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsAGEs+DMSO

2.3 過表達(dá)MRTF-A對(duì)FN及ICAM-1表達(dá)影響 如Fig 3結(jié)果所示，與正常對(duì)照組相比，AGEs組中的FN、ICAM-1和MRTF-A的表達(dá)增加。在此基礎(chǔ)上過表達(dá)MRTF-A質(zhì)粒，與空載對(duì)照相比，F(xiàn)N、ICAM-1和MRTF-A的表達(dá)得到進(jìn)一步增加。因此，過表達(dá)MRTF-A能夠進(jìn)一步上調(diào)AGEs誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中FN和ICAM-1的表達(dá)。

Fig 3 Effects of MRTF-A overexpression on FN and ICAM-1 expressions in AGEs-induced GMCs

*P<0.05，**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsAGEs+Vector

2.4 干擾MRTF-A對(duì)FN及ICAM-1表達(dá)影響 為了更加明確MRTF-A對(duì)FN、ICAM-1的作用，我們采用siRNA干擾MRTF-A。在明確干擾序列可用后，我們在AGEs條件下轉(zhuǎn)染了干擾序列。Fig 4結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，干擾MRTF-A下調(diào)了AGEs誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中FN、ICAM-1的蛋白水平。綜合Fig 3和Fig 4的結(jié)果，我們確定了MRTF-A參與介導(dǎo)AGEs誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中的FN、ICAM-1表達(dá)。

Fig 4 Effects of MRTF-A knockdown on FN and ICAM-1 expressions in AGEs-induced GMCs.

*P<0.05，**P<0.01vscontrol，#P<0.05，##P<0.01vsAGEs+N.C

2.5 MRTF-A對(duì)NF-κB(p65)的影響 許多研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB作為與炎癥密切相關(guān)的，普遍存在于真核細(xì)胞質(zhì)中的快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，參與了DN的發(fā)生、發(fā)展過程[14]。接下來我們通過過表達(dá)或干擾MRTF-A發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MRTF-A質(zhì)粒進(jìn)一步增加p65在細(xì)胞核內(nèi)的水平，而干擾MRTF-A則能夠減少p65在細(xì)胞核內(nèi)的蛋白水平，如Fig 5所示。說明MRTF-A能夠通過影響p65參與AGEs 誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中的ICAM-1、FN表達(dá)。

Fig 5 Effect of MRTF-A on NF-κB(p65) signaling in AGEs-induced GMCs

*P<0.05vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsAGEs+DMSO

3 討論

細(xì)胞外基質(zhì)的過度積累是糖尿病腎病的主要病理改變之一。腎小球系膜細(xì)胞分泌的ECM積聚是促進(jìn)腎小球基底膜增厚、腎小球硬化的主要機(jī)制之一，在DN的發(fā)生發(fā)展起到了重要作用[15]。AGEs是一組蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)通過非酶糖基化作用形成的一類大分子物質(zhì)。AGEs可大量沉積在腎小球系膜、基底膜引起蛋白質(zhì)的共價(jià)交聯(lián)，破壞基質(zhì)-基質(zhì)和基質(zhì)-細(xì)胞之間的相互作用[16]。大量研究表明，AGEs能引起細(xì)胞內(nèi)活性氧增多，進(jìn)而活化NF-κB及COX-2等炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子[17]，誘導(dǎo)GMCs中細(xì)胞黏附分子ICAM-1及纖維化因子FN、TGF-β的表達(dá)從而參與糖尿病腎臟炎癥及纖維化的病理過程，但具體的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)， MRTF-A參與介導(dǎo)了AGEs誘導(dǎo)的GMCs的FN、ICAM-1的形成，并進(jìn)一步揭示MRTF-A是通過影響p65入核水平，參與調(diào)控FN、ICAM-1表達(dá)。

心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MRTF-A由于其廣泛的作用，是目前研究最多的MRTFs家族成員。雖然文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了MRTF-A與DN的關(guān)系，但是MRTF-A與AGEs誘導(dǎo)FN、ICAM-1表達(dá)增加以促進(jìn) DN 之間關(guān)系的還不清楚，同時(shí)，也未在其他模型或器官中有關(guān)于MRTF-A與AGEs兩者間關(guān)系的報(bào)道。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在AGEs處理的腎小球系膜細(xì)胞中，MRTF-A的表達(dá)與正常相比明顯升高。通過干擾或抑制MRTF-A能夠下調(diào)AGEs誘導(dǎo)GMCs中FN、ICAM-1表達(dá)，而過表達(dá)MRTF-A則能進(jìn)一步上調(diào)AGEs誘導(dǎo)GMCs中FN、ICAM-1表達(dá)。提示在AGEs誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞FN、ICAM-1等炎癥纖維化因子的表達(dá)增加效應(yīng)中MRTF-A發(fā)揮了重要的參與介導(dǎo)作用。

NF-κB及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是DN發(fā)生發(fā)展的重要因素。研究表明[18]，在oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中，p65能夠與MRTF-A相互作用并招募其入核，共同參與ICAM-1的轉(zhuǎn)錄，這提示了在腎小球系膜細(xì)胞中，MRTF-A與p65之間有可能存在聯(lián)系。本研究中通過干擾或過表達(dá)MRTF-A觀察了p65在細(xì)胞核內(nèi)的蛋白水平變化，進(jìn)一步探討了MRTF-A參與DN的機(jī)制。為將MRTF-A作為抑制糖尿病腎臟纖維化、抗糖尿病腎病的潛在靶點(diǎn)提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)于中山大學(xué)藥學(xué)院藥理毒理實(shí)驗(yàn)室完成，感謝黃河清教授指導(dǎo)，感謝陳誠的前期實(shí)驗(yàn)工作，感謝陳志泉、黃佳妮的參與。)

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MRTF-A mediates FN and ICAM-1 expressions by NF-κB pathway in AGEs-induced GMCs.

CHEN Qiu-hong1,CHEN Zhi-quan1,Huang Jia-ni1,HUANG He-qing1,2

(1.SchoolofPharmaceuticalScienceSunYat-SenUniversity,2.DiseaseModelAnimalEngineeringTechnologyResearchCenterofGuangdongProvince,Guangzhou510006，China)

Aim To observe the expression of MRTF-A in rat glomerular mesangial cells(GMCs) induced by advanced glycation end products(AGEs) and its effect on ICAM-1 and FN; to explore whether MRTF-A is involved in the process of diabetic nephropathy by affecting NF-κB pathway.Methods Under the condition of AGEs, CCG-1423 and anti-MRTF-A small interfering RNA were used to knock down MRTF-A and MRTF-A plasmid was used to activatt MRTF-A, The expression level of MRTF-A, ICAM-1, FN and p65 in nucleus were detected by Western blot.Results The protein expressions of MRTF-A was increased in AGEs-induced GMCs. The expressions of FN and ICAM-1 and p65 in nucleus were downregulated by knocking down MRTF-A. However, the expressions of FN, ICAM-1 and p65 in nucleus were upregulated by overexpressing MRTF-A.Conclusions AGEs can upregulate the expression of MRTF-A in GMCs, and MRTF-A mediates the protein expressions of FN and ICAM-1 by affecting NF-κB signaling pathway in AGEs-induced GMCs.

diabetic nephropathy；glomerular mesangial cells；AGEs；MRTF-A；p65；FN；ICAM-1

時(shí)間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1248.048.html

2016-12-01,

2017-01-08

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81373457，81573477)；教育部博士點(diǎn)基金(No 20130171110097)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No 2015B090903063)

陳秋紅(1991-)，女，碩士生，研究方向：中藥心血管及糖尿病藥理學(xué)，E-mail：airyfly@126.com； 黃河清(1965-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥心血管及糖尿病藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：huangheq@mail.sysu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.024

A

1001-1978(2017)04-0572-06

R322.61；R341；R394.2；R587.2；R692.39；R977.6