徐錦榮，叢 斌，李淑瑾，金玉懷，趙占勝

(河北醫(yī)科大學 1.法醫(yī)系，河北省法醫(yī)學重點實驗室、3.病原學教研室，河北 石家莊 050017；2.第三醫(yī)院免疫風濕科，河北 石家莊 050051)

CCK-8對TNF-α誘導大鼠RSC-364細胞MMPs/TIMP-1的影響

徐錦榮1,2，叢 斌1，李淑瑾1，金玉懷3，趙占勝1

(河北醫(yī)科大學 1.法醫(yī)系，河北省法醫(yī)學重點實驗室、3.病原學教研室，河北 石家莊 050017；2.第三醫(yī)院免疫風濕科，河北 石家莊 050051)

目的 研究八肽膽囊收縮素(CCK-8)對TNF-α誘導的大鼠RSC-364細胞MMPs/TIMP-1的影響。方法 采用ELISA觀察TNF-α作用下CCK-8對RSC-364 細胞MMP-3、-9、-1及TIMP-1分泌的影響，比較MMP-3、-9、-1和TIMP-1比值變化，用RT-PCR觀察CCK-8對TNF-α作用下RSC-364 細胞MMP-3、-9 mRNA表達的影響。結果 靜息和CCK-8單獨孵育細胞后未檢測到MMP-3和MMP-9，產(chǎn)生少量MMP-1和TIMP-1，表達MMP-3和MMP-9 mRNA甚微，CCK-8有抑制TNF-α誘導細胞MMP-3、-9、-1分泌和MMP-3、-9 mRNA表達的作用，并且降低TNF-α所致的MMPs/TIMP-1比值的上升。結論 CCK-8下調MMPs 基因表達，減少MMPs分泌，使MMPs與TIMP-1比值下降，從而降低MMPs活性，表明CCK-8能調節(jié)滑膜細胞分泌功能，提示CCK-8在類風濕關節(jié)炎發(fā)病過程中可能具有調控作用。

八肽膽囊收縮素；TNF-α；關節(jié)炎；成纖維樣滑膜細胞；基質金屬蛋白酶；金屬蛋白酶組織抑制劑

八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)屬于小分子肽類物質，近年研究表明具有抗炎和免疫調節(jié)作用[1-2]。類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)作為一種以關節(jié)病變?yōu)橹鞯穆匀砻庖咝约膊。袌蟮繡CK-8通過調節(jié)神經(jīng)生長因子分泌、炎性細胞因子釋放及Th17反應，有減輕交叉膠和膠原誘導大鼠關節(jié)炎的炎癥作用[3-4]，提示CCK-8對RA這種慢性免疫性炎癥可能具有潛在治療價值。

炎性滑膜炎是RA的主要病理學基礎，且該過程由多種細胞參與，其中滑膜襯里層成纖維樣細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)過度增殖和分泌，產(chǎn)生金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，MMPs 與MMPs組織抑制劑(tissue inhibitor of MMPs，TIMPs)系統(tǒng)失衡在RA關節(jié)骨與軟骨破壞中具有重要作用，TNF-α是參與上述過程關鍵細胞因子之一[5-7]，調節(jié)FLS增殖及分泌對RA意義重大。之前報道CCK-8對II型膠原性關節(jié)炎大鼠滑膜細胞增殖有抑制作用，CCK-8也能抑制TNF-α誘導正常大鼠滑膜細胞株RSC-364增殖[8]，但CCK-8對滑膜細胞分泌MMPs/ TIMPs系統(tǒng)有何影響，后續(xù)未進一步報道，本文繼續(xù)以RSC-364為研究對象，觀察TNF-α作用下CCK-8對MMPs/TIMP-1系統(tǒng)的影響，探討其在RA滑膜細胞中的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 重組大鼠TNF-α、硫酸化CCK-8為Sigma公司；大鼠MMP- 3、-9、-1及TIMP-1 ELISA 試劑盒為美國Market Inc；逆轉錄酶、隨機引物為北京賽百盛基因技術公司，MMP-3和-9引物序列依據(jù)GenBank中大鼠MMP-3和-9序列用引物設計軟件Primer5設計并由北京賽百盛生物公司合成；DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司等。

1.2 RSC-364細胞的培養(yǎng) RSC-364細胞由中國人民解放軍總醫(yī)院骨研所惠贈，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(含有青霉素105kU·L-1和鏈霉素100 mg·L-1)，培養(yǎng)在37℃、5% CO2孵育箱中，每3 d換液1次，大約細胞鋪滿細胞瓶底70%～80%后傳代。

1.3 ELISA法測定MMP-3、-9、-1及TIMP-1含量 實驗時將處于對數(shù)生長期的細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板(8×107cell·L-1，每孔1.0 mL)，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜，細胞基本長成單層，然后分為以下4組：① 對照組；② TNF-α(50 μg·L-1)組；③ CCK-8(1 μmol·L-1)組；④ CCK-8+TNF-α組。上述各組細胞于培養(yǎng)箱孵育24 h，收集培養(yǎng)液并離心取上清，按照ELISA試劑盒說明書操作，最后用全自動酶標儀于450 nm波長處測定各孔的吸光度值代表其含量。

1.4 RT-PCR檢測MMP-3、-9mRNA表達 實驗時將處于對數(shù)生長期的細胞接種于培養(yǎng)瓶(5×109cells·L-1，10 mL/瓶)， 37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜，細胞基本長成單層，然后分為以下4組：① 對照組；② TNF-α(50 μg·L-1)組；③ CCK-8(1 μmol·L-1)組；④ CCK-8+TNF-α組。上述各組細胞置培養(yǎng)箱孵育12 h，采用TRIzol法提取細胞總RNA(按說明書操作)。用紫外分光光度計測A260及A280，確定提取RNA的純度及濃度，A260/A280>1.8者用于PCR擴增。取總RNA 2 μg，用隨機引物進行逆轉錄，將逆轉錄產(chǎn)物進行PCR，GAPDH為內(nèi)參對照。各引物序列見Tab 1。PCR條件： 94℃ 3 min；94℃ 45 s；54.3℃ 45 s(MMP-9)，49.5℃ 45 s(MMP-3)，52℃ 45 s(GAPDH)；72℃ 45 s，28次循環(huán)，最后72℃延伸5 min。取10 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 mg·L-1溴化乙錠)上電泳分離，用Gel-Pro凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，用任意單位(AU)表示譜帶面積×熒光強度值，MMP-3/GAPDH、MMP-9/GAPDH的AU比值代表mRNA相對表達水平。

2 結果

2.1 CCK-8對TNF-α誘導RSC-364細胞MMPs分泌的影響 對照組和單獨CCK-8孵育細胞24 h用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中MMP-3和-9含量均低于其檢測下限，可檢測到低濃度的MMP-1，但二者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TNF-α刺激細胞24 h后，RSC-364 細胞分泌MMP-1水平上升，MMP-3和MMP-9分泌水平明顯上升，以MMP-3為著，與靜息RSC-364組相比差異均具有顯著性(P<0.01)，CCK-8預孵育細胞則不同程度的抑制了TNF-α的上述效應。見Tab 2。

Tab 1 The primer sequence of RT-PCR

Tab 2 Effect of CCK-8 on secretion of MMP-1,-3,-9 and TIMP-1 in RSC-364(±s，n=6,μg·L-1)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsTNF-α

2.2 在TNF-α作用下CCK-8對RSC-364細胞TIMP-1分泌及MMPs/TIMP-1比值的影響 對照組和單獨CCK-8孵育細胞24 h可檢測到低濃度TIMP-1，二者相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TNF-α刺激細胞24 h，RSC-364細胞TIMP-1分泌增加，與靜息RSC-364組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且TNF-α增加MMP-3、-1、-9與TIMP-1的比值。CCK-8預孵育細胞，對TNF-α作用下RSC-364細胞TIMP-1分泌量有所增加，但與TNF-α組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，卻對TNF-α所致的MMPs/TIMP-1的比值上升有降低作用。見Tab 2、3。

Tab 3 Effect of CCK-8 on the ratios of MMP-1, -3 and -9 to TIMP-1 in RSC-364(±s，n=6)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsTNF-α

2.3 CCK-8對TNF-α誘導RSC-364 MMP-3、-9 mRNA表達的影響 靜息和CCK-8處理RSC-364細胞表達MMP-3和-9 mRNA 甚微，TNF-α孵育RSC-364細胞12 h，MMP-3和-9 mRNA表達明顯增加，與靜息RSC-364細胞組比較差異有顯著性(P<0.01)。TNF-α和CCK-8聯(lián)合孵育細胞，CCK-8有降低MMP-3和-9 mRNA表達的作用(P<0.01，P<0.05)。見Tab 4，F(xiàn)ig 1、2。

3 討論

MMPs在RA骨和軟骨破壞過程中起重要作用，其中MMP-3、-1、-9及-2起主導地位。MMP-2和MMP-9為當前研究最深入的明膠酶，正常情況下MMP-1表達很低，MMP-3能激活MMP-1。在RA滑膜組織中發(fā)現(xiàn)MMP-9、MMP-3、MMP-1呈高表達，且主要定位于FLS中。RA FLS在體外可被傳代數(shù)月，初始倍增速度快，可能是滑膜微環(huán)境的延續(xù)效應所致，而被傳代十幾次后，細胞活力明顯下降，細胞可能處于靜止狀態(tài)，但在細胞因子作用下細胞又能活化。此外，正常FL3基本上也不能合成或產(chǎn)生很少的MMP-3和MMP-9，以及TNF-α、IL-1等促炎性細胞因子刺激下則可持續(xù)表達[2,9-10]。本文觀察到：靜息狀態(tài)下正常來源大鼠成纖維樣滑膜細胞株RSC-364 未檢測到MMP-3和MMP-9的分泌，且MMP-1分泌量也低，在TNF-α作用下RSC-364分泌MMP-9、MMP-3、MMP-1明顯增加，提示TNF-α可以刺激RSC-364 分泌行為。金玉懷等[11]用明膠酶譜法觀察RSC-364 本身就表達MMP-2，而MMP-9卻需要經(jīng)過TNF-α剌激后表達，從上述MMPs分泌特性來看，刺激后的RSC-364可能具有與RA FLS類似的生物學特性。

Tab 4 Effect of CCK-8 on expression of MMP-3,-9 mRNA in RSC-364(±s，n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsTNF-α

Fig 1 Effect of CCK-8 on MMP-3 mRNA expression in RSC-364

1:Control;2:TNF-α;3:TNF-α+CCK-8;4:CCK-8; 5:marker

Fig 2 Effect of CCK-8 on MMP-9 mRNA expression in RSC-364

1:marker;2:Control;3:TNF-α;4:TNF-α+CCK-8;5:CCK-8

近年來CCK-8在慢性免疫性疾病方面的作用研究倍受關注，前期體外實驗觀察到CCK-8抑制大鼠滑膜細胞增殖，明膠酶譜法初步發(fā)現(xiàn)CCK-8能抑制RSC-364 細胞分泌MMP-2和-9并降低酶活性[11]，本實驗中單獨CCK-8孵育RSC-364細胞對MMP-1、MMP-3、MMP-9分泌并無作用，CCK-8預孵育細胞，卻一定程度的逆轉了TNF-α誘導細胞分泌MMP-3、-9、-1，提示CCK-8可調節(jié)滑膜細胞分泌行為。

不同種類的MMPs雖然可被不同的細胞因子所調節(jié)，卻都受其特異性抑制劑TIMPs的調節(jié)，其中TIMP-1主要抑制MMP-3和MMP-9，TNF-α對TIMPs表達呈上調作用[3]。本實驗觀察靜息狀態(tài)下RSC-364產(chǎn)生TIMP-1少，TNF-α刺激后TIMP-1產(chǎn)生增多，升高的TIMP-1可能會影響其分泌的MMPs活性。比較MMP-3、MMP-9、MMP-1與TIMP-1比值時發(fā)現(xiàn)TNF-α使得MMPs與TIMP-1的比值均升高，原因是TNF-α雖然促進細胞產(chǎn)生TIMP-1，但更明顯的是刺激RSC-364分泌MMPs，使得MMPs與TIMP-1的比值最終均呈升高狀態(tài)。在RA滑膜組織中MMPs含量就遠大于TIMPs，TIMPs不能發(fā)揮其有效抑制MMPs的行為，是MMPs /TIMPs的比例決定了MMPs活性。另外，RA患者關節(jié)液中MMPs與TIMPs比值比骨關節(jié)炎患者高的多(約為后者的5.2倍)[12]，可見MMPs /TIMPs系統(tǒng)平衡紊亂在RA骨與軟骨破壞過程中有重要意義。本實驗中CCK-8對TNF-α作用下的細胞產(chǎn)生TIMP-1影響不大，這可能與CCK-8濃度也有關，但卻對TNF-α所致的MMPs與TIMP-1的比值上升有降低作用，說明CCK-8除了直接調節(jié)MMPs分泌還可以通過改變MMPs/TIMP-1的比值來影響MMPs活性。

另外，MMPs活性的調節(jié)也發(fā)生在基因水平。RA滑膜細胞中MMP-1 mRNA表達3 h時開始升高，12 h時便達峰值，24 h時仍處于較高的水平；MMP-3、-9mRNA表達6 h時開始升高，并能持續(xù)到36 h[13-15]。本實驗在觀察RSC-364細胞MMP-3、-9mRNA表達時發(fā)現(xiàn)靜息狀態(tài)下細胞中MMP-3、-9 mRNA表達甚微，TNF-α刺激細胞12 h表達明顯增加，CCK-8一定程度上有抑制TNF-α上述效應的作用，這與ELISA中MMP-3、MMP-9分泌結果也相符，提示CCK-8也從基因水平調節(jié)了MMPs活性。

綜上所述，CCK-8通過3種途徑調節(jié)MMPs活性：下調MMPs 基因表達，減少MMPs分泌，下降MMPs與TIMP-1的比值，提示CCK-8不僅能抑制滑膜細胞增殖，還能調節(jié)滑膜細胞分泌，對RA滑膜炎過程有潛在調控作用。但是參與滑膜細胞增殖及分泌的上游信號轉導機制極其復雜，初步研究CCK-8能抑制p38MAPK通路活化對RSC-364增殖起到一定下調作用[8]，也有報道轉錄因子NF-κB、活化蛋白-1參與滑膜細胞MMPs基因表達、增殖及炎癥反應，環(huán)腺苷酸水平下降伴隨著膠原性和佐劑性關節(jié)炎大鼠滑膜細胞過度增殖和MMPs表達增加等，那么CCK-8具體通過哪些信號轉導機制來調控滑膜細胞的上述功能,則有待于進一步深入研究。

需指出：本實驗依然采用的是正常來源大鼠滑膜細胞株，并且用一種細胞因子來激活細胞，而RA或關節(jié)炎動物模型中的滑膜細胞是在多種病理因素作用下的活化細胞，CCK-8對該種情況下的滑膜細胞分泌作用也有可能相反，因此CCK-8在RA中的調控地位及其對RA可能的治療作用尚需再深入研究。

(致謝：本實驗是本人在讀博士期間在導師叢斌教授指導下在河北醫(yī)科大學法醫(yī)實驗室完成，李淑瑾、金玉懷、趙占勝老師幫助指導、分析、完善實驗，實驗過程中有幸得到了韓冬艷、白潔兩位碩士生無私幫助，RT-PCR方面得到姚玉霞老師無私指導，在此一并致以最誠摯的謝意！)

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Effect of CCK-8 on expression of MMPs/TIMP-1 in TNF-α-induced RSC-364

XU Jin-rong1,2,CONG Bin1,LI Shu-jin1,JIN Yu-huai3,ZHAO Zhan-sheng1

(1.DeptofForensicMedicine,HebeiKeyLabofForensicMenicine,3.DeptofMicrobiology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China;2.DeptofRheumatologyandImmunology,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China)

Aim To observe the influence of CCK-8 on expression of MMPs/TIMP-1 in TNF-α-induced rat fibroblast-like synovial cell line RSC-364.Methods The secretion levels of MMP-1, MMP-3, MMP-9 and TIMP -1 were determined using ELISA; MMP-3 and MMP-9 mRNA expressions were detected by RT-PCR.Results MMP-3 and MMP-9 could not be examined in RSC-364 incubated with CCK-8 and unstimulated RSC-364, which was able to product a little MMP-1, TIMP-1 and express even less MMP-3, -9 mRNA. CCK-8 inhibited the increase in MMP-1, MMP-3, MMP-9 secretion and MMP-3, -9 mRNA expression in TNF-α-induced RSC-364. TIMP-1 production was also increased in TNF-α-induced RSC-364. CCK-8 had no effect on TIMP-1 production in TNF-α-induced RSC-364, but was able to reduce the ratios of MMP-1, MMP-3, MMP-9 to TIMP-1.Conclusion The inhibitory effect of CCK-8 on MMPs activity may be related to the decrease of MMPs mRNA expression, MMPs secretion and the ratios of MMPs to TIMP-1 in TNF-α-induced RSC-364, which indicates that CCK-8 might be a possible regulator in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.

cholecystokinin-octapeptide; TNF-α; arthritis; fibroblast-like synoviocytes; matrix metalloproteinases; tissue inhibitors of metalloproteinases

時間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.046.html

2016-9-13，

2016-10-31

國家自然科學基金資助項目(No 30470679)；河北省自然科學基金資助項目(No C2005000705)

徐錦榮(1976-)，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：結締組織病，E-mail:xujinrong77762011@163.com； 叢 斌(1956-)，男，博士，教授，中國工程院院士，博士生導師，研究方向：結締組織病、CCK-8抗炎及免疫調節(jié)，通訊作者，E-mail:bincong@263.net

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.023

A

1001-1978(2017)04-0567-05

R-322；R345.9；R593.22；R971.9；R975；R977.1