朱駿生，章功良，杜 雷，姬寧寧，黃思婷，張詠梅，花 嶸，3

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，江蘇 徐州 221002；2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230032；3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急救中心，江蘇 徐州 221002)

激活脊髓小電導(dǎo)鈣離子激活鉀通道可抑制小鼠嗎啡痛覺過敏

朱駿生1，章功良2，杜 雷1，姬寧寧1，黃思婷1，張詠梅1，花 嶸1，3

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，江蘇 徐州 221002；2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230032；3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急救中心，江蘇 徐州 221002)

SK通道；1-EBIO；嗎啡；痛覺過敏；脊髓；小鼠

嗎啡作為臨床上有效治療劇烈疼痛的阿片類藥物，由于長期使用帶來的副作用如耐受現(xiàn)象、痛覺過敏等降低了其鎮(zhèn)痛效應(yīng)，限制了其臨床使用，因此，研究嗎啡所致痛覺過敏的機制具有重要的臨床意義。嗎啡所致痛覺過敏不同于它的耐受作用，更與它的鎮(zhèn)痛作用相矛盾，表現(xiàn)為傷害性感受的閾值低于正常[1]。目前認為嗎啡痛覺過敏的可能機制主要包括初級傳入神經(jīng)元的敏化、NMDA受體活化引起的脊髓水平突觸可塑性的改變以及脊髓上水平對脊髓背角的下行易化作用的加強[2]。

鈣離子激活鉀通道是一種依賴細胞內(nèi)鈣離子濃度升高而激活的鉀通道?？筛鶕?jù)其電導(dǎo)率的大小分為大電導(dǎo)鈣離子激活鉀通道(large conductance Ca2+-activated K+channels，BK通道)、中電導(dǎo)鈣離子激活鉀通道(intermediate conductance Ca2+-activated K+channels，IK通道)、小電導(dǎo)鈣離子激活鉀通道(small conductance Ca2+-activated K+channels，SK通道)3種[3]。SK通道廣泛分布于哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)中， SK通道又可以根據(jù)其基因編碼(KCNN1、KCNN2和KCNN3)產(chǎn)物分成SK1、SK2、SK3三個亞型。每個有功能的SK通道都是1個四聚體，每個亞基都包含6個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個P環(huán)。胞內(nèi)區(qū)有C末端和N末端，C末端有著鈣調(diào)素(CaM)結(jié)合位點，胞內(nèi)Ca2+結(jié)合CaM，引起SK通道構(gòu)象發(fā)生改變，通道開放，鉀離子外流[4]。胞內(nèi)區(qū)N末端的蛋白激酶CK2和C末端的蛋白磷酸化酶PP2A均可以調(diào)節(jié)通道對Ca2+的敏感性[5]。以往研究表明，SK通道參與癲癇樣活動、學(xué)習記憶過程、情緒障礙以及精神分裂癥，并在疼痛中發(fā)揮著重要作用[6]，然而，SK通道是否參與嗎啡痛敏的形成尚未見相關(guān)報道。

本實驗針對嗎啡痛覺過敏，通過鞘內(nèi)給藥，觀察SK通道在脊髓水平被激動劑1-EBIO激活后的嗎啡痛敏小鼠痛閾的改變，為深入研究SK通道在疼痛中的作用以及嗎啡痛覺過敏的具體機制提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 ♂ C57BL6/N小鼠48只，體質(zhì)量20 g～25 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供[許可證號：SYXK(蘇)2015-0030]。小鼠置于晝夜(12/12 h)節(jié)律光照條件下，自由進食飲水，室溫(23±1)℃，所有小鼠實驗前靜養(yǎng)1周。

1.2 實驗分組 嗎啡痛敏模型建立小鼠隨機分為4組，每組8只。生理鹽水對照(Control)組：0.9% NS(5 mL·kg-1)皮下注射；嗎啡(Morphine)組：嗎啡(5 mg·kg-1)皮下注射；溶劑(Vehicle)組：1% DMSO(5 μL每只)鞘內(nèi)注射；和給藥(1-EBIO)組：25 μg 1-EBIO(5 μL每只)鞘內(nèi)注射。鞘內(nèi)注射方法：左手掌心壓住鼠身，拇指中指按壓骶骨兩側(cè)固定，食指按在兩側(cè)骶骨前緣連線正中點皮膚上(可觸知棘突)指示進針位點，右手持10 μL微量注射器與水平成30度角于棘突間隙進針，針尖進入棘突與橫突間組織后將針壓低后緩慢推進，以鼠尾出現(xiàn)突然側(cè)向運動為成功標志，注射5 μL，時間約5 s，然后緩慢拔出。進針深度約4 mm，針頭斜面向下。d 1對小鼠進行內(nèi)臟痛閾值、甩尾閾值和機械性縮足閾值基礎(chǔ)值的測定，此后連續(xù)給藥6 d，每天均需測定甩尾閾值和機械性縮足閾值，在d 7，還需進行內(nèi)臟痛閾值的測定，且對d 7的內(nèi)臟痛閾進行AWR評分。以上各組動物平均體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 儀器及藥品 恒溫水浴箱購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司。鹽酸嗎啡注射液購自東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司。1-EBIO購自Tocris公司(Cat.No.1041)。DMSO購自Sigma公司。Anti-KCa2.2(SK2)購自Alomone labs公司(Cat #: APC-028)。

1.4 動物模型 嗎啡痛覺過敏模型的制備。20 g～25 g ♂ C57小鼠皮下注射嗎啡，5 mg·kg-1(5 mL·kg-1)，每天兩次，上午8 ∶00，下午6 ∶00，連續(xù)注射6 d[7]。

1.5 小鼠疼痛行為學(xué)測定

1.5.1 機械性縮足閾值(MWT)測定 將一有機玻璃箱(5 cm×5 cm×10 cm)置于金屬篩網(wǎng)上，小鼠放置于玻璃箱中，待小鼠在有機玻璃箱中適應(yīng)30 min后，用Von-Frey纖維絲垂直刺激小鼠后肢足底中部，持續(xù)時間≤5 s，小鼠出現(xiàn)抬足或跑開行為視為陽性反應(yīng)(以“×”記錄)，否則為陰性反應(yīng)(以“O”記錄)。測定首先從1.0 g開始，當該力度的刺激不能引起陽性反應(yīng)，則給予相鄰大一級力度的刺激；如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則記錄為給予相鄰小一級力度的刺激，如此連續(xù)進行，直至出現(xiàn)第1次陽性和陰性反應(yīng)的交叉，再連續(xù)測定4次。每次刺激間隔30 s以上，以此向下推算小鼠50%縮足閾值[8]。

50% g threshold=[10(Xf+κδ)]/10 000

Xf=最后一次用的Von-Frey 細絲的數(shù)值(以log單位記)，κ值查表可得[8]，δ=0.224。

1.5.2 熱甩尾潛伏期(TWL)測定 設(shè)定恒溫水浴箱溫度，48℃(可根據(jù)實際情況調(diào)節(jié)，使正常小鼠平均甩尾時間控制在10～15 s)。將鼠尾后2/3浸入水中，同時開始計時。當小鼠開始甩尾時立即停止計時，記錄用時即為甩尾潛伏期(tail withdrawal latency, TWL)。設(shè)置切斷時間為25 s，以免燙傷鼠尾。每只小鼠重復(fù)測定3次，計算平均值。

1.5.3 內(nèi)臟痛閾(AWR評分)測定 自制結(jié)直腸擴張球囊(簡稱球囊)：一次性保鮮袋用塑封機制成長2 cm，直徑0.8 cm，一端封閉的圓柱形球囊，輸液導(dǎo)管插入球囊中，導(dǎo)管與開口端用絲線結(jié)扎，確保密封不漏氣。測量時將球囊插入小鼠肛門，深度為球囊結(jié)扎線距肛門括約肌大約0.5 cm處，用膠帶輕輕將外端導(dǎo)管固定在小鼠尾巴上，以防球囊在實驗過程中滑出。導(dǎo)管通過三通管一端與血壓計相連，一端連接注射器。小鼠在實驗前12 h禁食不禁水。將小鼠放置在20 cm×6 cm×8 cm的有機玻璃箱內(nèi)觀察，約30 min小鼠完全適應(yīng)后開始實驗。CRD分別采用10 mmHg～70 mmHg，間隔10 mmHg共7個壓力，每次擴張持續(xù)20 s，刺激間隔4 min，取3次評分的均值。

AWR的評分標準為：無明顯行為變化，0分；僅有簡單的頭部運動，1分；腹部肌肉開始收縮，但腹肌未抬離桌面，2分；腹肌明顯收縮變平或下腹壁抬離桌面，3分；腹壁拱起或伴身體、骨盆躬起，4分。

AWR方法測定痛閾值：球囊放置等過程同前，通過注射器持續(xù)、緩慢加壓，每10 mmHg為一壓力梯度，每個壓力持續(xù)20 s，間隔4 min，以肉眼觀察出現(xiàn)明顯的下腹壁抬離箱底或明顯收縮變平(即AWR 3分)時的最小壓力值為痛反應(yīng)閾。擴張壓力范圍在10 mmHg～80 mmHg之間；每只小鼠重復(fù)3次，取平均值。

1.6 Western blot 行為學(xué)測試結(jié)束后，10%水合氯醛3 mL·kg-1腹腔注射對小鼠進行麻醉后，斷頭，取脊髓腰膨大(L4～L5)。將取出的脊髓放入預(yù)冷的裂解液中，在冰上使用電動勻漿機進行勻漿，每個樣本勻漿4次，每次10 s，間隔10 s冷卻，充分裂解后離心。BCA法對裂解后的蛋白濃度進行定量，隨后加入5×上樣緩沖液(總體積1/4)，放入沸水中煮沸5 min促進蛋白變性。配置10%或者12%的膠進行恒壓電泳，電壓設(shè)置為：濃縮膠70 V 35 min，分離膠110 V 90～120 min。電泳結(jié)束后，采用PVDF膜冰上進行恒壓轉(zhuǎn)膜，100 V 75 min。3% BSA封閉2 h后，4°冰箱孵育一抗過夜：Anti-SK2(1 ∶1 000，Alomone公司，以色列)，GAPDH(1 ∶2 000，Bioworld公司，中國)。Washing-buffer清洗3次后孵育堿性磷酸酶二抗羊抗兔或鼠(1 ∶2 000，Abcam公司，英國)2 h，Washing buffer清洗3次，顯色，采用Image J軟件進行灰度值分析。

Fig 1 Effects of intrathecal administration of morphine on threshold of mechanical, thermal and visceral pain in mice

(A)(B)(C)(D)the changes of mechanical withdrawal threshold(MWT), tail withdrawal latency(TWL), threshold of visceral pain and AWR score, respectively,1 mmHg=0.133 kPa.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group

2 結(jié)果

2.1 長期注射嗎啡對小鼠痛閾的影響 與NS組相比，小鼠給予嗎啡后，出現(xiàn)機械縮足閾值，熱甩尾潛伏期，內(nèi)臟痛閾的降低(Fig 1，P<0.05,P<0.01)。以上結(jié)果表明長期使用嗎啡，不但可以引起機械和熱痛覺過敏，而且能引起內(nèi)臟痛覺過敏。

2.2 鞘內(nèi)注射1-EBIO對嗎啡痛敏小鼠痛閾的影響 鞘內(nèi)注射SK通道激活劑1-EBIO每只25 μg(溶于5 μL 1% DMSO)，20 min后，小鼠活動被明顯抑制，與溶劑組和自身給藥前相比，小鼠痛閾明顯提高(Fig 2，P<0.05)。以上結(jié)果表明1-EBIO可以有效地減輕嗎啡引起的痛覺過敏。

2.3 嗎啡痛覺過敏模型小鼠脊髓SK2通道表達水平的變化 造模d 7篩選出造模成功的小鼠，取脊髓腰膨大(L4～5節(jié)段)，發(fā)現(xiàn)嗎啡模型組小鼠的脊髓SK2膜蛋白表達量較對照組明顯降低(Fig 3,P<0.05)。1-EBIO給藥后1 h內(nèi)，脊髓SK2膜蛋白表達量明顯升高(Fig 3,P<0.05)。

3 討論

本實驗結(jié)果表明：持續(xù)低劑量的給予小鼠皮下注射嗎啡，可以誘發(fā)小鼠機械痛、熱痛和內(nèi)臟痛等痛覺過敏現(xiàn)象，且脊髓SK2通道蛋白表達降低；鞘內(nèi)注射SK通道激動劑1-EBIO后，可阻斷機械痛、熱痛和內(nèi)臟痛敏，且脊髓SK2通道蛋白表達也較嗎啡組增高，表明脊髓SK通道參與嗎啡痛敏的形成，SK2通道活化可阻斷痛敏形成。

嗎啡等作用于阿片受體的麻醉性鎮(zhèn)痛藥所具有的強效鎮(zhèn)痛作用，仍是其他鎮(zhèn)痛藥物所無法比擬和取代的，用于治療晚期癌癥所誘發(fā)的慢性重度疼痛和大型手術(shù)(如截肢、開胸、器官移植等)所致的劇烈疼痛。然而，長期或不正確地使用嗎啡等阿片類藥物，會引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生適應(yīng)性改變，從而誘發(fā)患者對嗎啡的耐受性、痛覺過敏等不良反應(yīng)。這些不良反應(yīng)會進一步加重患者的痛苦，嚴重降低患者的生活質(zhì)量[9]。然而，關(guān)于嗎啡所致痛敏的機制并不清楚。

Fig 2 Effects of SK channel agonist 1-EBIO intrathecally on morphine-induced hyperalgesia in mice

(A)(B)(C)The changes of mechanical withdrawal threshold(MWT), tail withdrawal latency(TWL),and the threshold of visceral pain, respectively, 1 mmHg=0.133 kPa.#P<0.05vsbefore drug

SK通道是K+選擇性、電壓非依賴性、通過細胞內(nèi)Ca2+濃度升高而激活的一種鉀通道，其介導(dǎo)的K+電流是形成神經(jīng)元動作電位中間后超極化(medium-after hyperpolarization, mAHP)的重要機制。SK通道在動作電位后超極化的作用決定了它是細胞興奮性的重要調(diào)節(jié)因子，因此有可能通過改變神經(jīng)元的興奮性而參與嗎啡痛覺敏化的形成。在體和離體實驗研究表明，SK通道在傷害性刺激感覺通路中發(fā)揮重要功能，如在外周水平，背根神經(jīng)節(jié)中的SK通道在疼痛中發(fā)揮重要作用，并受到NMDA受體的調(diào)節(jié)[10]，而在中樞脊髓水平，給予SK通道激動劑1-EBIO可以減少NMDA受體拮抗劑用于鎮(zhèn)痛的劑量[11-12]。

Fig 3 Expressions of spinal membrane SK2 in mice

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsvehicle group

SK通道在脊髓表達比較豐富，其中SK1和SK3廣泛分布在脊髓灰質(zhì)，包括運動神經(jīng)元的Ⅷ和Ⅸ板層，而SK2則主要集中在脊髓背角，尤其是Ⅰ、Ⅱ板層[13]。我們選擇跟痛覺傳遞關(guān)系密切的脊髓背角作為研究對象，探究脊髓背角在嗎啡痛覺過敏形成后SK2蛋白含量表達有所下降，給予1-EBIO后，其表達量升高，同時阻斷了機械痛、熱痛和內(nèi)臟痛等痛敏的形成，表現(xiàn)為痛閾升高。以上結(jié)果表明，脊髓SK通道激活后，通過改變膜電位的產(chǎn)生，降低脊髓神經(jīng)元興奮性，從而影響痛覺的形成。

綜上所述，SK2通道在嗎啡所致痛敏的形成中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，其作用可能與改變脊髓痛覺傳導(dǎo)神經(jīng)元的興奮性，進而影響中樞敏化的形成有關(guān)，但具體機制還有待進一步研究，本研究將為臨床嗎啡鎮(zhèn)痛及預(yù)防嗎啡副作用等提供新的思路和理論依據(jù)。

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Activation of small conductance Ca2+activated K+channel in spinal cord could inhibit morphine-induced hyperalgesia in mice

ZHU Jun-sheng1, ZHANG Gong-liang2, DU Lei1, JI Ning-ning1,HUANG Si-ting1,ZHANG Yong-mei1, HUA Rong1，3

(1.JiangsuProvinceKeyLaboratoryofAnesthesiology,CollegeofAnesthesiology,XuzhouMedicalCollege,XuzhouJiangsu221002,China; 2.SchoolofBasicMedicalSciences,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China; 3.EmergencyCenteroftheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity,XuzhouJiangsu221002,China)

Aim To explore the effect of activated SK channels(small conductance Ca2+-activated K+channels) on morphine-induced hyperalgesia in the spinal cord in mice.Methods Adult C57BL6/N male mice were chosen to establish the model of morphine-hyperalgesia. The changes of tail withdrawal latency(TWL), mechanical withdrawal threshold(MWT) and the threshold of visceral pain were observed after intrathecal 1-EBIO, the agonist of SK channels.Results Compared with the control group, TWL, MWT and the threshold of visceral pain were decreased after morphine injection. After intrathecal 1-EBIO, the TWL, MWT and visceral pain threshold were increased. The level of spinal membrane SK2 expression in morphine-treated mice was decreased compared with that of control group. After intrathecal 1-EBIO, the level of spinal membrane SK2 expression was increased.Conclusion SK channels in the spinal cord are involved in morphine-induced hyperalgesia in mice.

SK channels;1-EBIO; morphine;hyperalgesia; spinal; mice

時間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.038.html

2016-12-10,

2017-01-20

國家自然科學(xué)基金資助(No 81171041，81271217)；江蘇省高校自然科學(xué)基金重點項目資助(No 13KJA320001)；江蘇省自然科學(xué)基金資助(No BK20161171);江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目資助(No KYLX16_1139)

朱駿生(1990-)，男，碩士生，研究方向：疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)控，E-mail: zhujs1990@163.com; 張詠梅(1970 -)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)控，通訊作者，E-mail：zhangym700@163.com 花 嶸(1969-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：創(chuàng)傷并發(fā)癥的免疫調(diào)節(jié)治療，疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)控，通訊作者，E-mail: ilovezq@yeah.net

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.019

A

1001-1978(2017)04-0547-05

R-322；R322.81；R348.1；R441.1；R741.041；R971.2摘要：目的 探究脊髓小電導(dǎo)鈣離子激活鉀通道(small conductance Ca2+-activated K+channels，SK通道)激活后對小鼠嗎啡所致痛覺過敏的影響。方法 選用♂ C57BL6/N小鼠，建立嗎啡痛覺過敏模型，鞘內(nèi)注射SK通道激活劑1-EBIO后，測量小鼠熱甩尾潛伏期(tail withdrawal latency，TWL)，機械縮足閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和內(nèi)臟痛閾的變化。結(jié)果 嗎啡痛覺過敏模型小鼠與生理鹽水對照組小鼠相比，熱甩尾潛伏期、機械縮足閾值和內(nèi)臟痛閾均降低；而鞘內(nèi)注射SK通道激活劑1-EBIO后，與給藥前相比，小鼠的痛閾熱甩尾潛伏期，機械縮足閾值和內(nèi)臟痛閾均升高；嗎啡模型組小鼠的脊髓SK2膜蛋白表達量較對照組明顯降低，而給予1-EBIO后，脊髓SK2膜蛋白表達量較模型組明顯升高。結(jié)論 脊髓SK通道參與小鼠嗎啡引起的痛覺過敏。