侯江淇，張 欣，龍 倩，楚世峰，郭 蕾，賀文彬,3，張俊龍，陳乃宏

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030619；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，藥物研究所 & 神經(jīng)科學(xué)中心，北京 100500；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208)

高脂血癥與Aβ的協(xié)同作用促進(jìn)引發(fā)阿爾茨海默癥

侯江淇1,2，張 欣2，龍 倩2，楚世峰3,4，郭 蕾2，賀文彬2,3，張俊龍1,2，陳乃宏3,4

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030619；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，藥物研究所 & 神經(jīng)科學(xué)中心，北京 100500；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208)

目的 探討高脂血癥與β樣淀粉蛋白(amyloid-beta peptides,Aβ)在衰老大鼠發(fā)生阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease， AD)時(shí)的相互作用及病理變化。方法 70只♂ SD大鼠按體重隨機(jī)分為7組，除sham組及Aβ25-35、HLD組外，其余大鼠均給予皮下注射D-半乳糖(D-gal)6周，制備衰老模型；在此基礎(chǔ)上給予高脂飼料，制備高脂血癥模型，以及雙側(cè)海馬CA1區(qū)定位注射凝聚態(tài)Aβ25-35構(gòu)建衰老期高脂血癥伴發(fā)AD的復(fù)合模型。采用Morris水迷宮、尼氏染色、Western blot、免疫組織化學(xué)染色等方法，觀察高脂血癥對老年AD大鼠學(xué)習(xí)記憶、海馬神經(jīng)元凋亡以及tau蛋白過度磷酸化特異性位點(diǎn)改變的影響。結(jié)果 在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，與sham組相比，Aβ25-35組、D-gal+Aβ25-35組以及D-gal+Aβ25-35+HLD組大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯減少(P<0.01)、穿越平臺的次數(shù)也減少(P<0.01)，而D-gal組、HLD組、D-gal+HLD組與sham組相比差異無顯著性。尼氏染色中，與sham組相比，Aβ25-35組、D-gal+Aβ25-35組以及D-gal+Aβ25-35+HLD組海馬神經(jīng)元凋亡率明顯增多(P<0.01)；與Aβ25-35組相比，D-gal+Aβ25-35組神經(jīng)元凋亡率無明顯變化，但D-gal+Aβ25-35+HLD組神經(jīng)元凋亡率明顯增加(P<0.01)；與D-gal+Aβ25-35組相比，D-gal+Aβ25-35+HLD組神經(jīng)元凋亡率明顯增多(P<0.01)。Western blot中，與sham組、Aβ25-35組、D-gal組、HLD組、D-gal+Aβ25-35組以及D-gal+HLD組相比，D-gal+Aβ25-35+HLD組大鼠tau蛋白Thr181位點(diǎn)的磷酸化明顯增加(P<0.01)。結(jié)論 高脂血癥對老年大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力以及抗氧化能力無明顯影響；高脂血癥可與Aβ協(xié)同作用，加重Aβ對神經(jīng)元的損傷，并促進(jìn)tau蛋白Thr181位點(diǎn)的過度磷酸化，是引發(fā)AD的危險(xiǎn)因素。

高脂血癥；Aβ；阿爾茨海默??； tau；過度磷酸化；衰老

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease， AD)俗稱老年癡呆，是一種病因未明的、慢性、進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，起病隱匿，以記憶力減退和進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)[1]，是引起老年人認(rèn)知和行為障礙的主要疾病之一。但是，AD的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。衰老是唯一確定的AD病因，載脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)基因型突變導(dǎo)致的高脂血癥會增加AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2]，但高脂血癥增加AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制尚未闡明。

AD的特征性病理表現(xiàn)主要有[3]：細(xì)胞外大量β樣淀粉蛋白(amyloid-beta peptides, Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaque，SP)，tau蛋白過度磷酸化導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibril tangles，NFTs)，以及廣泛神經(jīng)元丟失導(dǎo)致的腦萎縮。Bloom[4]認(rèn)為Aβ是tau的上游，Aβ的聚積可使tau變成有毒的聚積態(tài)；同時(shí)，毒性tau通過反饋途徑加重Aβ的毒性。Lee等[5]認(rèn)為Aβ擾亂神經(jīng)元的新陳代謝和離子穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而引起蛋白激酶異常激活或磷酸酶抑制，最終導(dǎo)致tau過度磷酸化，形成NFTs。但因?yàn)镻ick病、核上性麻痹等tau病變并未伴隨Aβ病變，故也有學(xué)者認(rèn)為tau對Aβ病理的發(fā)生、發(fā)展并無調(diào)節(jié)作用[6]。高脂血癥作為AD的危險(xiǎn)因子，可能通過誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥、促使突觸可塑性的損傷或破壞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)等[7]，進(jìn)而促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶能力的損傷，但其在Aβ與tau的病理改變之間發(fā)揮了什么樣的作用，目前尚不清楚。因此，本研究擬在衰老的動物體內(nèi)觀察高脂血癥與Aβ以及tau的病理學(xué)變化特征。

我們選用D-半乳糖(D-gal)構(gòu)建衰老大鼠模型[8]，在此基礎(chǔ)上給予高脂飲食構(gòu)建高脂血癥模型，并通過腦立體定位技術(shù)于大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射凝聚態(tài)的Aβ25-35多肽片段，觀察高脂血癥在Aβ引發(fā)的AD病變中的作用，以期為AD的治療和預(yù)防提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級♂ SD大鼠，體質(zhì)量(320±20) g，9～10周，70只，由斯倍福(北京)生物技術(shù)有限公司提供[合格證號：SCXK(京)2011-0004]。動物飼養(yǎng)于12 h：12 h晝夜周期空調(diào)房內(nèi)(5只/籠)，室溫23 ℃～25 ℃，濕度50%～60%，自由進(jìn)食及飲水，所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本研究所有實(shí)驗(yàn)動物操作均參照中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動物倫理法規(guī)進(jìn)行。

1.2 試劑 Aβ25-35：吉爾生化(上海)有限公司；tau單克隆抗體、tau[pThr181]單克隆抗體、tau[pThr212]單克隆抗體、tau[pThr205]單克隆抗體：Invitrogen公司；β-actin單克隆抗體：Sigma-Aldrich公司；兔抗鼠IgG二抗、羊抗兔IgG二抗：Sigma生物技術(shù)公司；Western blot化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒：北京普利萊基因技術(shù)有限公司；大鼠CAT、T-AOC檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。D-半乳糖：Sigma-Aldrich公司；高脂飼料：特洛菲飼料科技有限公司(配方：酪蛋白20%，DL-蛋氨酸0.3%，蔗糖51.45%，奶油15%，玉米油1%，膽固醇1.25%，纖維素1%，礦物質(zhì)3.5%，維生素1%，膽堿1%，膽酸鈉0.5%)；注射用青霉素鈉：華北制藥集團(tuán)動物保健品有限責(zé)任公司[批準(zhǔn)文號：獸藥字(2011)030201248]；尼氏染色液：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 SR-6R腦立體定位儀：日本，Narishige；2-16P型離心機(jī)：德國，Sigma；酶標(biāo)儀：德國，Thermo；LAS4000型生物分子成像儀：美國，GE；Morris水迷宮：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所研制；生物顯微鏡：日本，Nikon Eclipse e60i。

1.4 藥物制備 凝聚態(tài)Aβ25-35的制備[9]：將2 mg Aβ25-35溶于400 μL滅菌生理鹽水中，制成5 g·L-1的溶液，置于37℃孵箱中孵育7 d，形成凝聚態(tài)。

D-gal溶液的制備[10]：0.9%生理鹽水溶解D-gal，濃度為25 g·L-1，給藥量為50 mg·kg-1·d-1。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 動物分組及模型制備 實(shí)驗(yàn)大鼠按體重隨機(jī)分為7組(n=10)，分組及處理情況見Tab 1，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期持續(xù)48 d，見Fig 1。從d 1至d 47，各組大鼠分別給予頸背部皮下注射D-gal或生理鹽水，投喂高脂飼料；d 35、36各組大鼠雙側(cè)海馬腦定位注射Aβ25-35或滅菌生理鹽水。注射1周后用Morris水迷宮檢測各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，d 48取材。

1.5.2 雙側(cè)海馬定位注射 10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg·kg-1)[11]后，備皮，暴露顱骨，于腦立體定位儀固定，參照George等[12]的《The Rat Brain》，確定坐標(biāo)為前囟后3.0 mm、中線旁1.8 mm、顱骨表面下2.6 mm。經(jīng)牙科骨鉆在顱骨鉆孔后，用5 μL微量進(jìn)樣器注射Aβ25-352.5 μL/側(cè)或0.9%滅菌生理鹽水2.5 μL/側(cè)，注射持續(xù)5 min，留針5 min，緩慢起針后注射另一側(cè)。雙側(cè)注射完畢縫合傷口后，給予青霉素鈉8萬單位肌注，每日1次，連續(xù)3 d。

Fig 1 Design of experiments

1.6 行為學(xué)檢測——Morris水迷宮 Morris水迷宮(morris water maze，MWM)主要用于評估大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力[13]，此迷宮由直徑120 cm，高80 cm的圓形水池及高40 cm，直徑10 cm的可移動圓形平臺組成。實(shí)驗(yàn)時(shí)水迷宮中水的深度需沒過平臺1～2 cm，并保證在后續(xù)檢測時(shí)平臺的位置一致。實(shí)驗(yàn)時(shí)水溫(24±1)℃，全程保持安靜。

MWM測試包括定位航行和空間探索兩部分，其中前4 d的定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練大鼠尋找隱藏在水下的平臺。實(shí)驗(yàn)時(shí)，平臺放置于第一象限，大鼠面向池壁從第三象限中點(diǎn)入水，記錄大鼠在60 s內(nèi)尋找平臺并在平臺停留2 s的軌跡。若尋找平臺時(shí)間小于60 s,則記錄該時(shí)間為其逃避潛伏期，若尋找時(shí)間大于60 s，按60 s計(jì)。于d 5進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺，記錄60 s內(nèi)大鼠穿越目標(biāo)象限的次數(shù)及在目標(biāo)象限停留的時(shí)間。

Tab 1 Groups and treatment conditions

saline, abbreviated as S;Hyperlipemia diet,abbreviated as HLD

1.7 尼氏染色 水迷宮檢測結(jié)束后，各組大鼠隨機(jī)選5只，用10%水合氯醛(300 mg·kg-1，ip)麻醉后行心臟灌流，之后取全腦，并置于4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟，包埋成蠟塊，行冠狀切片，片厚4 μm。

組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后，用尼氏染色液染色5 min，雙蒸水洗2次，1 min/次，脫水、透明、中性樹脂封片。

1.8 tau蛋白病理變化的檢測

1.8.1 免疫蛋白印跡法 各組大鼠隨機(jī)選取5只剝離海馬和皮層，其中海馬組織稱重后按1 ∶10加入組織裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.5，150 mmol·L-1NaCl，蛋白酶抑制劑混合物)制成組織勻漿，12 000 r·min-1，離心30 min，取上清，取部分用于BCA蛋白定量，剩余上清液加入1/4體積的5×loading buffer，煮沸10 min變性，以10% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用3%牛血清室溫封閉2 h，之后孵育一抗：抗tau抗體(1 ∶500)、抗tau[pThr181]抗體(1 ∶500)、抗tau[pThr212]抗體(1 ∶500)、抗tau[pThr205]抗體(1 ∶500)、抗β-actin抗體(1 ∶1 000)，4℃過夜。TBS-T洗3次，10 min/次；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯示蛋白條帶，分析條帶的變化趨勢。

1.8.2 免疫組織化學(xué)染色 組織切片常規(guī)脫蠟、酒精梯度水化(100%、100%、95%、85%、75%，雙蒸水)后，用PBS沖洗3次，3 min/次；枸櫞酸鹽緩沖液高溫抗原修復(fù)10 min，PBS沖洗3次；用免疫組化筆將切片中的組織圈起，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶15 min，PBS洗3次，3 min/次；3%山羊血清室溫封閉30 min，倒去血清，加一抗：抗tau[pThr181](1 ∶100)、抗tau[pThr212](1 ∶100)、抗tau[pThr205](1 ∶100)，4℃孵育過夜；PBS-T沖洗3次，3 min/次；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h；PBS-T沖洗3次，3 min/次。DAB顯色，脫水、透明、中性樹脂封片。

Fig 2 Level of blood TC,TG,LDL and HDL(±s)

**P<0.01vssham;##P<0.01vsD-gal;△△P<0.01vsD-gal+Aβ25-35

1.9 抗氧化能力檢測 皮層、海馬稱重后按1 ∶9加入生理鹽水制成組織勻漿，2 000 r·min-1，離心10 min，取上清，取部分用于蛋白定量，剩余上清液于-80℃保存?zhèn)溆谩?yán)格按照試劑盒說明書操作，檢測組織中總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、過氧化氫酶活力(activity of catalase，CAT)。

計(jì)算公式：組織CAT活力(kU·g-1Pro)=(對照OD-測定OD)×271/60×取樣量/待測樣本蛋白濃度；

組織T-AOC(kU·g-1Pro)=(測定OD-對照OD)/0.01/30×反應(yīng)液總體積/取樣量/待測樣本蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 高脂血癥本身不能引發(fā)老年動物發(fā)生學(xué)習(xí)記憶障礙 如Fig 2所示，經(jīng)多因素方差分析HLD、Aβ25-35、D-gal對大鼠血脂水平的影響，結(jié)果顯示：① 與sham組相比，D-gal 組、Aβ25-35組、D-gal+Aβ25-35組大鼠血脂水平未見明顯變化；而HLD組、D-gal+HLD組及D-gal+HLD+Aβ25-35組大鼠血液總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)及低密度脂蛋白(low densith lipoprotein，LDL)的水平明顯升高(P<0.01)；高密度脂蛋白(high densith lipoprotein，HDL)無明顯變化；② 與D-gal 組比，D-gal+HLD組血漿TC、TG、LDL水平明顯增加(P<0.01)；③ 與D-gal+ Aβ25-35組比，D-gal+HLD+Aβ25-35組大鼠血漿TC、TG、LDL水平明顯增加(P<0.01)。說明單純Aβ25-35或D-gal對大鼠血脂無明顯影響，而HLD可明顯增加血漿TC、TG、LDL的水平。

采用Morris水迷宮進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的檢測，如Fig 3所示，在定位航行實(shí)驗(yàn)中(Fig 3A)，隨著訓(xùn)練時(shí)間的增加，sham組大鼠逃避潛伏期明顯縮短；而Aβ25-35組、D-gal+Aβ25-35組以及D-gal+Aβ25-35+HLD組大鼠的逃避潛伏期并未明顯縮短；D-gal組、HLD組、D-gal+HLD組與sham組相比差異無顯著性，說明Aβ25-35對大鼠的學(xué)習(xí)能力造成了損傷。從Fig 3B、C可知，在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與Sham組相比，Aβ25-35組、D-gal+Aβ25-35組、D-gal+Aβ25-35+HLD組大鼠穿越平臺次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間均明顯減少(P<0.01)，而D-gal組、HLD組、D-gal+HLD組無變化；與D-gal組相比，D-gal+Aβ25-35組在目標(biāo)象限停留的時(shí)間明顯減少(P<0.01)、穿越平臺的次數(shù)也減少(P<0.01)；與D-gal+HLD組相比，D-gal+Aβ25-35+HLD組大鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間明顯減少(P<0.01)、穿越平臺的次數(shù)也減少(P<0.01)，與定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。說明Aβ25-35對大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力造成了損傷，而D-gal及高脂飲食不能引發(fā)老年大鼠發(fā)生學(xué)習(xí)記憶障礙。結(jié)合血脂檢查結(jié)果可知，高脂飲食可提高大鼠的血脂水平，但其本身并不能引發(fā)老年動物發(fā)生學(xué)習(xí)記憶障礙。

Fig 3 Morris Water Maze test

2.2 高脂血癥可加重Aβ25-35引發(fā)的老年AD動物的神經(jīng)元損傷 大鼠海馬神經(jīng)元的損傷采用尼氏染色方法進(jìn)行觀察，如Fig 4A所示，200倍鏡下見，sham組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目較多，分布均勻，形態(tài)完整，核仁清晰。與sham組相比，Aβ25-35組、D-gal+Aβ25-35組以及D-gal+Aβ25-35+HLD組神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞皺縮，并可見濃染的細(xì)胞，其中以D-gal+Aβ25-35+HLD組濃染細(xì)胞最多見。而與sham組相比，D-gal組、HLD組、D-gal+HLD組海馬神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)目沒有差異。統(tǒng)計(jì)這兩個(gè)區(qū)域的細(xì)胞凋亡率(Fig 4D)：① 與sham組相比，Aβ25-35組、D-gal+Aβ25-35組以及D-gal+Aβ25-35+HLD組大鼠神經(jīng)元凋亡率明顯增高(P<0.01)，而D-gal組、HLD組、D-gal+HLD組無明顯變化，說明D-gal及HLD對神經(jīng)元的損傷不明顯;② 與Aβ25-35組相比，D-gal+Aβ25-35組神經(jīng)元凋亡率無明顯變化；但D-gal+Aβ25-35+HLD組神經(jīng)元凋亡率明顯增加(P<0.01);③ 與D-gal+Aβ25-35組相比，D-gal+Aβ25-35+HLD組神經(jīng)元凋亡率明顯增多(P<0.01)，說明Aβ25-35對海馬神經(jīng)元造成了損傷，而高脂飲食加重了Aβ25-35對海馬神經(jīng)元的損傷。

2.3 高脂血癥加重了Aβ25-35引發(fā)老年大鼠腦組織的抗氧化能力損傷 如Fig 5所示，經(jīng)多因素方差分析顯示，D-gal對大鼠皮層組織的CAT、T-AOC有明顯影響。與sham組相比，D-gal組、D-gal+Aβ25-35組、D-gal+HLD組、D-gal+Aβ25-35+HLD組大鼠皮層組織T-AOC降低(P<0.05)，CAT活力降低(P<0.01)，表明各組大鼠組織抗氧化能力降低，機(jī)體呈衰老態(tài)。海馬組織T-AOC呈下降趨勢，以D-gal+Aβ25-35+HLD組下降最為明顯(P<0.01)；CAT活力降低，與sham組相比，D-gal+Aβ25-35+HLD組下降明顯(P<0.01)。與D-gal+Aβ25-35組比，D-gal+Aβ25-35+HLD組海馬組織T-AOC及CAT活力均降低(P<0.05，P<0.01)，說明高脂血癥加重了Aβ25-35引發(fā)的老年大鼠腦組織的抗氧化能力損傷。

2.4 tau蛋白病理變化的檢測結(jié)果

2.4.1 高脂血癥加重了Aβ25-35引發(fā)的老年動物tau蛋白異常磷酸化 通過Western blot檢測HLD對衰老的AD大鼠tau蛋白多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的影響，由Fig 6A可見，與sham組、Aβ25-35組、D-gal組、HLD組、D-gal+HLD組及D-gal+Aβ25-35組相比，D-gal+Aβ25-35+HLD組大鼠tau蛋白Thr181位點(diǎn)的磷酸化明顯增加(P<0.01)，而Thr212、Thr205位點(diǎn)的磷酸化變化并不明顯，故推測HLD促進(jìn)了Aβ25-35所致AD樣病變中tau蛋白Thr181位點(diǎn)的過度磷酸化。

Fig 4 Nissl's stain of Hippocampus

A:Representative Nissl′s staining pictures;B:Cell apoptosis rate in CA1;C:Cell apoptosis rate in CA3;D:Cell apoptosis rate in both CA1 and CA3.1:Sham;2:Aβ25-35;3:D-gal;4:HLD;5:D-gal+HLD;6:D-gal+Aβ25-35;7:D-gal+Aβ25-35+HLD.**P<0.01vssham;##P<0.01vsAβ25-35;△△P<0.01vsD-gal+Aβ25-35

Fig 5 Antioxidant capacity of cerebral cortex and hippocampus(±s)

A,B: Change of T-AOC and CAT in cerebral cortex; C,D: Change of T-AOC and CAT in hippocampus.*P<0.05,**P<0.01vssham;△P<0.05,△△P<0.01vsD-gal+Aβ25-35

2.4.2 高脂血癥加重了Aβ25-35引發(fā)的老年動物tau蛋白Thr181位點(diǎn)異常磷酸化 如Fig 7所示，與sham組相比，D-gal+Aβ25-35+HLD組大鼠tau蛋白Thr181位點(diǎn)磷酸化陽性染色明顯，呈棕黃色粗顆粒，與Western blot結(jié)果一致。

3 討論

本研究采用行為學(xué)、生化分析以及分子生物學(xué)等方法證明高脂血癥本身并不引起老年動物發(fā)生學(xué)習(xí)記憶障礙，但卻可加重Aβ25-35引發(fā)的AD病理進(jìn)程，表現(xiàn)為加重Aβ引發(fā)的神經(jīng)元凋亡、氧化損傷、以及tau病理學(xué)變化。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們，高脂血癥可能與Aβ發(fā)揮了協(xié)同作用，促進(jìn)了AD的病理進(jìn)程。

從Morris水迷宮結(jié)果看，Aβ25-35海馬CA1區(qū)定位注射會明顯降低大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，而單獨(dú)給予D-gal或高脂飼料，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力未見明顯下降，可知二者均無致AD作用。從抗氧化能力相關(guān)酶活力的檢測結(jié)果看，D-gal長期皮下注射可明顯降低大鼠的抗氧化能力，進(jìn)而更好的模擬衰老狀態(tài)；從血脂檢測結(jié)果可知，長期高脂飲食可造成血漿TC、TG、LDL的異常升高，可模擬高脂血癥。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，尼氏染片中Aβ25-35定位注射于大鼠海馬，會造成海馬神經(jīng)元的損傷，而高脂飲食加重了Aβ25-35對神經(jīng)元的損傷。Western blot結(jié)果顯示，高脂飲食聯(lián)合Aβ25-35促進(jìn)了衰老大鼠海馬中tau蛋白某些位點(diǎn)的磷酸化，其中與D-gal組相比，HLD引起了Thr181位點(diǎn)的異常磷酸化，而Thr205、Thr212位點(diǎn)的磷酸化則無明顯改變；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了Western blot結(jié)果，并定位該磷酸化蛋白主要位于海馬CA3區(qū)。因此，我們認(rèn)為高脂飲食聯(lián)合Aβ25-35可加重老年大鼠腦中Aβ的神經(jīng)毒性，并進(jìn)一步促進(jìn)tau蛋白的過度磷酸化，且此磷酸化主要表現(xiàn)在Thr181位點(diǎn)。

膽固醇是神經(jīng)元細(xì)胞膜的基本成分之一，與Aβ的正常代謝及異常聚積密切相關(guān)[14]，若腦中膽固醇水平過高，會使神經(jīng)元細(xì)胞膜脂質(zhì)的循環(huán)減慢，造成Aβ的生成和聚積增多，而清除減少，成為AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素。近年來，隨著生活水平的提高，糖尿病、高脂血癥等代謝類疾病的患病人數(shù)也不斷增多，目前已有研究表明糖尿病與AD的關(guān)系極為密切[15-16]，但對高脂血癥與AD關(guān)系的研究則較少，相關(guān)認(rèn)識也不統(tǒng)一[17]，而伴有高脂血癥的AD患者中Aβ與tau的關(guān)系更不明確。有學(xué)者主張用他汀類藥物控制血脂以降低AD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)[18]；也有研究認(rèn)為高膽固醇水平并不會增加AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，只有年齡是AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素[19]；而Mielke等[20]則認(rèn)為老年期的高膽固醇水平可降低癡呆風(fēng)險(xiǎn)。Thr181位點(diǎn)位于tau蛋白的脯氨酸富集區(qū)，該位點(diǎn)在腦脊液中的磷酸化水平常做為診斷AD的特異性標(biāo)志物之一[21]。

Fig 6 Wsetern blot test

A:Total tau,p-Thr181,p-Thr 212,p-Thr 205 level in hippocampus determined by Western blot;B:Cartogram of p-Thr181,p-Thr212 and p-Thr205 level.**P<0.01vssham

Fig 7 Representative pictures in immunostaining

本研究認(rèn)為，高脂飲食所引起的高脂血癥仍可能是老年人AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素，高脂血癥可與Aβ協(xié)同作用，加重Aβ對神經(jīng)元的損傷，并促進(jìn)tau蛋白Thr181位點(diǎn)的過度磷酸化。

(致謝:實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所陳乃宏教授課題組完成，苑玉和、宋修云、王真真、張釗等老師均給予了本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)性的意見；實(shí)驗(yàn)室夏聰媛、高巖、婁鈺霞、張帥、王莎莎、羅飄、趙佳奇、宋昕樾、陳琴、楊鵬飛、張秋雙、王瑩瑩、郭斌、韓誠、趙雨薇、陳秀艷、陳姣等同學(xué)均在實(shí)驗(yàn)過程中給予了重要的幫助，謹(jǐn)此致以誠摯的謝意！)

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Study of synergistic effect of hyperlipoproteinemia and Aβ in processing of Alzheimer′s disease

HOU Jiang-qi1,2, ZHANG Xin2, LONG Qin2, CHU Shi-feng3,4, GUO Lei2,HE Wen-bin2,3, ZHANG Jun-long1,2,CHEN Nai-hong3,4

(1.ShandongUniversityofChineseMedicine,JiNanShandong250355,China; 2.ShanxiUniversityofChineseMedicine，TaiYuanShanxi030619，China; 3.ChineseAcademyofMedicalScienceandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100500,Chinas; 4.CollegeofPharmacy,HunanUniversityofChineseMedicine,ChangshaHunan410208,China)

Aim To research the synergistic effect of hyperlipoproteinemia and Aβ in the processing of Alzheimer′s disease.Methods Seventy SD rats were randomly divided into seven groups, and dealt with D-gal (hypodermic injection), hyperlipemia diet, microinjection into both side of CA1 section in hippocampus, independently. Morris water maze(MWM) test was used to evaluate the spatial memory impairments. Tau and tau(pThr181) pathology in the hippocampus were detected using Western blot and immunohistochemistry. Nissl′s staining was used to detect cell apoptosis.Results Aβ25-35-treated rats showed significant impairments of spatial memory in MWM test, especially in the group of D-gal+Aβ25-35+HLD(P<0.01). Furthermore, these rats treated with Aβ25-35, D-gal, and hyperlipemia diet, exhibited significantly increased phosphorylation of tau, particularly in the Thr181 site.Conclusion Hyperlipoproteinemia is the risk factor for older person, which could strengthen the toxic effect of Aβ, and promote phosphorylation of tau.

hyperlipoproteinemia; Aβ; Alzheimer′s disease; tau; hyperphosphorylation; aging

時(shí)間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.022.html

2016-10-18,

2016-12-09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81573853，81273629)；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程重大協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目(創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目)(No 2016I2M1004)；山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(No 2013-134)；湖南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(No 2015SK2029-1)

侯江淇(1988-)，女，博士生，研究方向：《內(nèi)經(jīng)》理論及應(yīng)用，E-mail：houjiangqi123@163.com； 陳乃宏(1961-)，男，博士，研究員，通訊作者，E-mail：chennh@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.011

A

1001-1978(2017)04-0498-09

R-332；R322.81；R341；R339.38；R589.2；R745.7