梁勁康，方炳虎，黎乃添，吳志玲，吳廣輝，張桂君

(廣東溫氏大華農生物科技有限公司，廣東云浮 527400)

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高效液相色譜法同時測定枸櫞酸蘋果酸粉消毒劑中枸櫞酸和蘋果酸的含量

梁勁康，方炳虎，黎乃添，吳志玲，吳廣輝，張桂君*

(廣東溫氏大華農生物科技有限公司，廣東云浮 527400)

建立同時測定獸用消毒劑枸櫞酸蘋果酸粉中枸櫞酸和蘋果酸含量的高效液相色譜方法。采用Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-10 mL/L磷酸溶液(2.5∶97.5，V/V)為流動相進行洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為35℃，進樣量為20 μL。枸櫞酸和蘋果酸色譜峰分離度良好。枸櫞酸和蘋果酸分別在100 μg/mL～1 000 μg/mL和50 μg/mL～500 μg/mL范圍內線性關系良好。精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性等考察結果的相對標準偏差(RSD)均小于1.0%；而平均回收率均在98%～101%之間，RSD均小于0.5%，符合方法學要求。6份供試品中枸櫞酸和蘋果酸的含量也均符合要求。建立的高效液相色譜法能夠同時定量測定枸櫞酸和蘋果酸的含量，可用于枸櫞酸蘋果酸粉的質量控制。

枸櫞酸；蘋果酸；速可凈；高效液相色譜法；含量測定

枸櫞酸蘋果酸粉是一種新型生態(tài)環(huán)保的復合有機酸消毒劑，其殺菌作用快速、持久，已經在畜牧業(yè)中廣泛使用。研究表明，枸櫞酸蘋果酸粉稀釋至一定濃度時能夠完全殺滅大腸埃希菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌等細菌以及H5N1亞型禽流感病毒、口蹄疫病毒等病毒[1-2]。枸櫞酸蘋果酸粉中的主要有效成分是枸櫞酸(citric acid，含量約為40%)和蘋果酸(malic acid，含量約為10%)，這兩種有機酸在水中均能夠解離出大量的H+滲入細菌細胞內，改變細胞滲透壓，使細胞質酸化和蛋白變性，從而殺滅細菌[1]。因此，枸櫞酸和蘋果酸的含量控制是枸櫞酸蘋果酸粉質量標準的關鍵。本文在參考相關文獻[3-4]的基礎上，建立了可同時測定枸櫞酸和蘋果酸含量的高效液相色譜法。該方法快速簡便，結果準確可靠，可為枸櫞酸蘋果酸粉的質量標準評價方法提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設備 Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)配置2489 UV/Vis檢測器，美國Waters公司產品；CPA225D型電子天平，德國Sartorius公司產品；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司產品；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司產品；KQ-100E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品。

1.1.2 藥品和試劑 枸櫞酸和蘋果酸對照品(批號分別為111679-200401和190013-201001)，中國藥品生物制品檢定所產品；枸櫞酸蘋果酸粉(商品名：速可凈)，北京中農牧公司產品；乙腈(色譜純)，德國Merck公司產品；磷酸(分析純)，江蘇強盛功能化學股份有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-10 mL/L磷酸溶液(2.5∶97.5，V/V)為流動相；流速為1.0 mL/min；檢測波長為210 nm；柱溫為35℃；進樣量為20 μL。以蘋果酸和枸櫞酸色譜峰計算，理論塔板數不得低于3 000。

1.2.2 對照品母液和供試品溶液的配制 精密稱取25.20 mg枸櫞酸對照品和12.49 mg蘋果酸對照品，置于25 mL容量瓶中，加入適量超純水使枸櫞酸和蘋果酸溶解后，補加超純水至刻度，搖勻，制得枸櫞酸和蘋果酸混合對照品母液。另外，分別精密稱取適量枸櫞酸和蘋果酸對照品，同法操作，分別配制枸櫞酸對照品溶液和蘋果酸對照品溶液。上述對照品溶液均經0.22 μm濾膜濾過，濾液用于液相檢測。

精密稱取0.1 g枸櫞酸蘋果酸粉樣品于100 mL容量瓶中，加入適量超純水后超聲使樣品全溶，補加超純水至刻度，搖勻，制得供試品溶液。供試品溶液經0.22 μm濾膜濾過，濾液用于液相檢測。

1.2.3 專屬性試驗 分別取空白溶液(水)、枸櫞酸對照品溶液、蘋果酸對照品溶液、枸櫞酸和蘋果酸混合對照品溶液以及供試品溶液，按1.2.1項下的色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。

1.2.4 最低檢測限(LOD)和定量限(LOQ) 分別精密移取一定體積的枸櫞酸和蘋果酸混合對照品溶液于10 mL的容量瓶中，超純水定容，進行逐級稀釋。稀釋液按1.2.1項下的色譜條件進樣分析，以信噪比(S/N)≥3的檢測量為LOD，以信噪比(S/N)≥10的檢測量為LOQ。

1.2.5 蘋果酸和枸櫞酸線性關系 分別精密移取一定體積的1.2.2項下的混合對照品母液于10 mL的容量瓶中，超純水稀釋定容，搖勻，配得一系列質量濃度的混合對照品溶液，按1.2.1項下的色譜條件進樣，測定枸櫞酸和蘋果酸的峰面積。

1.2.6 精密度試驗 分別精密移取一定體積的1.2.2項下的混合對照品母液，用超純水稀釋至低、中、高3種濃度：枸櫞酸的濃度分別為500、800、1 000 μg/mL，蘋果酸的終濃度分別為250、400、500 μg/mL。3種濃度的混合對照品溶液按1.2.1項下的色譜條件，連續(xù)重復進樣5針，記錄峰面積。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗 取1.2.6項下的低、中、高3

種混合對照品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、16、18、24 h按1.2.1項下的色譜條件進樣，記錄峰面積。

1.2.8 回收率和加樣回收率試驗 按1.2.6項下方法配制低、中、高3種混合對照品溶液，每個濃度平行配制5份，按1.2.1項下的色譜條件進樣，記錄峰面積，依據標準曲線計算回收率。

精密移取5 mL已知濃度的供試品溶液于10 mL容量瓶中，平行制備5份，分別精密加入1 mL不同濃度的混合對照品母液，超純水定容，搖勻后，按1.2.1項下的色譜條件進樣，記錄峰面積，依據標準曲線計算加樣回收率。

1.2.9 重現(xiàn)性試驗 同一批供試品稱取5份，按1.2.2項下的供試品溶液的配制方法同法操作，所得樣品溶液按1.2.1項下的色譜條件進行進樣分析，記錄峰面積，依據標準曲線計算枸櫞酸和蘋果酸的含量。1.2.10 樣品含量測定 平行稱取6份供試品，按1.2.2項下的供試品溶液的配制方法同法操作，所得供試品溶液按1.2.1項下的色譜條件進行進樣分析，記錄峰面積，依據標準曲線計算枸櫞酸和蘋果酸的含量。

2 結果

2.1 專屬性試驗

專屬性試驗結果可見圖1～圖5。從圖中可以看出，空白溶液在該色譜條件下并不會干擾枸櫞酸和蘋果酸的吸收，而且枸櫞酸和蘋果酸的出峰時間分別約為3.54 min和2.73 min，分離度良好。

圖1 空白溶液高效液相色譜圖

圖2 蘋果酸對照品溶液高效液相色譜圖

圖3 枸櫞酸對照品溶液高效液相色譜圖

圖4 枸櫞酸對照品和蘋果酸對照品混合溶液高效液相色譜圖

圖5 供試品溶液高效液相色譜圖

2.2 最低檢測限和定量限

試驗結果表明，枸櫞酸的最低檢測限(LOD)可達0.3 μg/mL，定量限(LOQ)則為0.5 μg/mL；而蘋果酸的LOD可達0.4 μg/mL，LOQ則為0.5 μg/mL。

2.3 蘋果酸和枸櫞酸線性考察

利用1.2.1項下的高效液相色譜方法測得枸櫞酸和蘋果酸的峰面積后，分別以質量濃度C為縱坐標，峰面積A為橫坐標，進行線性回歸。結果表明，枸櫞酸在100 μg/mL～1 000 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為C=0.000 77A-8.552 9(R2=0.999 8);蘋果酸在50 μg/mL～500 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為C=0.001 04A-12.788(R2=0.999 7)。

2.4 精密度試驗

試驗結果表明，枸櫞酸和蘋果酸在低濃度時峰面積RSD分別為0.62%和0.12%；在中濃度時峰面積RSD分別為0.36%和0.42%；在高濃度時峰面積RSD分別為0.12%和0.13%，表明本方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

試驗結果表明，枸櫞酸和蘋果酸在低濃度時峰面積RSD分別為0.76%和0.64%；在中濃度時峰面積RSD分別為0.24%和0.43%；在高濃度時峰面積RSD分別為0.23%和0.46%，表明枸櫞酸和蘋果酸在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率和加樣回收率試驗

試驗結果表明，枸櫞酸低、中、高3種濃度的回收率分別是100.48%±0.14%、101.46%±0.14%和100.29%±0.32%，RSD分別為0.11%、0.11%和0.26%；蘋果酸低、中、高3種濃度的回收率分別是99.52%±0.12%、100.94%±0.19%和99.52%±0.12%，RSD分別為0.10%、0.15%和0.10%，均符合方法學要求。

加樣回收率的試驗結果見表1。結果顯示，枸櫞酸和蘋果酸在3種水平濃度下的加樣回收率均在98%～101%之間，RSD均小于0.5%，說明該方法準確度良好。

表1 加樣回收率結果

2.7 重現(xiàn)性試驗

試驗結果表明，枸櫞酸和蘋果酸含量RSD分別為0.77%和0.14%，均符合方法學要求。

2.8 樣品含量測定結果

枸櫞酸蘋果酸粉樣品的含量測定結果見表2。結果表明，6份樣品中枸櫞酸和蘋果酸的含量均在標示量的90.0%～110.0%范圍內，因此，6份樣品中枸櫞酸和蘋果酸的含量均符合要求。

表2 速可凈樣品測定結果

3 討論

枸櫞酸和蘋果酸是消毒劑枸櫞酸蘋果酸粉(商品名：速可凈)中的主要有效成分，也是枸櫞酸蘋果酸粉質量標準控制的關鍵。枸櫞酸蘋果酸粉的原質量標準也是采用高效液相色譜法對枸櫞酸和蘋果酸的含量進行檢測。與本文方法不同，原質量標準中選用了聚苯乙烯二乙烯苯樹脂為填充劑的色譜柱。考慮到該色譜柱的成本價格較高以及其使用普遍性，本課題組設想利用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱代替聚苯乙烯二乙烯苯樹脂為填充劑的色譜柱，是否也能達到理想的分離效果？本研究結果表明，C18色譜柱不僅能夠有效將枸櫞酸和蘋果酸分離，也能夠使枸櫞酸和蘋果酸的主峰和其他雜質峰分離。

目前，已有文獻報道利用梯度淋洗離子色譜法同時測定煙草中的枸櫞酸和蘋果酸，但該方法需要梯度淋洗的過程，操作步驟相對繁瑣[5]。而在利用高效液相色譜法同時檢測多種有機酸的文獻報道中，也多采用梯度洗脫的方式來將各種有機酸分離開來，但梯度洗脫的過程容易導致基線不穩(wěn)，可能影響色譜峰的峰面積[6]。本文在參考相關文獻[3-4]的基礎上，建立了可同時測定枸櫞酸和蘋果酸的含量的等度洗脫的高效液相色譜方法。但是，由于檢測波長(λ=210 nm)接近于紫外末端吸收，因此2.25 min和4.25 min處出現(xiàn)了兩個溶劑峰。為了使枸櫞酸和蘋果酸的色譜峰能夠與溶劑峰充分分離，本文選擇了乙腈-10 mL/L磷酸溶液(2.5∶97.5，V/V)為流動相。一定比例的乙腈能夠降低有機酸色譜峰的拖尾現(xiàn)象，而且也能夠有效提高分離效果[7]。由于枸櫞酸屬于戊三酸，而蘋果酸屬于丁二酸，枸櫞酸與C18色譜柱的親和能力稍優(yōu)于蘋果酸，因此蘋果酸更易于被洗脫出來。

本文建立的高效液相色譜法能夠使枸櫞酸和蘋果酸充分分離，而且該方法簡便有效，線性關系良好、重現(xiàn)性好，精確度和靈敏度高，可作為消毒劑枸櫞酸蘋果酸粉中枸櫞酸和蘋果酸的定量分析方法。

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Simultaneous Determination of Contents of Citric Acid and Malic Acid in Citric Acid and Malic Acid Powder by HPLC

LIANG Jin-kang,FANG Bing-hu,LI Nai-tian,WU Zhi-ling,WU Guang-hui,ZHANG Gui-jun

(GuangdongWenshiDahuanongBiotechnologicalCo.,Ltd.,Yunfu,Guangdong,527400,China)

To establish a HPLC method for simultaneous determination of citric acid and malic acid in citric acid and malic acid powder,the assay was conducted on an agilent eclipse XDB-C18 column(250 mm×4. 6 mm，5 μm) with acetonitrile-10 mL/L H3PO4solution (2.5∶97.5，V/V).The flow rate was 1.0 mL/min, the detection wavelength was 210 nm,the column temperature was 35℃ and the injection volume was 20 μL.The results showed good resolution for the chromatographic peaks of citric acid and malic acid.The correlation coefficient between concentration and chromatographic peak area was over 0.999 in the range of 100-1 000 μg/mL for citric acid and 50-500 μg/mL for malic acid,indicating the good linearity of the calibration curves.In the precision,stability and repeated experiments,the relative standard deviations of citric acid and malic acid were less than 1.0%,showing a satisfactory precision and stability of this method.In the spiked experiment of three levels,the average recovery of citric acid and malic acid was about 98%-101% and all the relative standard deviations were less than 0.5%,demonstrating that this method was considerably accurate.This HPLC method can be used for the quantitative determination of citric acid and malic acid simultaneously and the quality control in citric acid and malic acid powder.

citric acid;malic acid;Snucop;HPLC;content determination

2016-09-07

梁勁康(1990-)，男，廣東開平人，碩士，主要從事獸藥新劑型與新技術研究。

S859.799.1

A

1007-5038(2017)04-0075-05

*通訊作者