盧 琴 ，羅青平，張騰飛，汪宏才，羅 玲，王紅琳，溫國元，張蓉蓉，邵華斌

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點實驗室/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064)

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耐氟喹諾酮類藥物禽源大腸埃希菌gyrA基因的檢測分析

盧 琴 ，羅青平，張騰飛，汪宏才，羅 玲，王紅琳，溫國元，張蓉蓉，邵華斌*

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點實驗室/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064)

探討不同禽源大腸埃希菌中喹諾酮類藥物的耐藥情況及耐藥基因gyrA的分布和突變特征。采用K-B藥敏紙片法、gyrA基因的PCR擴增，對9株大腸埃希菌進(jìn)行喹諾酮類藥物試驗，并將gyrA基因的PCR產(chǎn)物測序，對測序結(jié)果采用DNA MAN、DNA Star、MEGA6等軟件分析。藥敏試驗結(jié)果表明，C1、C2、C3菌株對左氧沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星敏感，D1、D2、D3、B1、B2和B3菌株對左氧沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星均表現(xiàn)為耐藥和中介；gyrA基因的測序結(jié)果表明，除B1菌株有1處核苷酸突變位點和B2菌株有14處核苷酸突變位點；B2菌株gyrA基因的氨基酸突變發(fā)生在87位Ile→Val替代、101位Leu→Met替代、102位Ala→Ser替代、129位Lys→Gln替代。9株禽源大腸埃希菌的同源性和進(jìn)化樹分析表明，不同禽源耐氟喹諾酮類藥物的大腸埃希菌菌株中B2菌株gyrA基因與其他9株菌株相比，同源性在90%左右，進(jìn)化樹不在一個分支上，研究中的B2菌株將為大腸埃希菌的氟喹諾酮類耐藥機制的研究提供候選菌株。

禽源大腸埃希菌；氟喹諾酮；耐藥菌株；gyrA基因

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)為人工合成化學(xué)抗菌藥，在人和動物治療細(xì)菌感染中使用最為廣泛。氟喹諾酮類藥物與DNA結(jié)合和拓?fù)洚悩?gòu)酶形成喹諾酮DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶絡(luò)合物，阻斷DNA的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，而對喹諾酮類藥物耐藥的主要機制是DNA旋轉(zhuǎn)酶和Ⅳ型拓?fù)洚悩?gòu)酶2種酶的突變[1-2]，細(xì)菌膜通透性的降低以及膜的主動外排泵激活；編碼靶酶DNA促旋酶的gyrA基因突變范圍主要集中于第67-106位氨基酸的區(qū)域，稱為喹諾酮耐藥性決定區(qū)(QRDR)，抑制菌體DNA的合成而起到殺菌作用[3]。質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因有3種，即通過導(dǎo)致質(zhì)粒介導(dǎo)的水平轉(zhuǎn)移基因qnr產(chǎn)生喹諾酮的耐藥，其他2種質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因為AAC(6′)-Ib-cr基因和外排泵qepA基因[4-6]。經(jīng)過20多年的臨床應(yīng)用，使細(xì)菌對該類藥物普遍具有耐藥性，耐藥譜也日益增大，嚴(yán)重影響藥物治療的效果及藥物的合理使用。本試驗選擇雞、鴨、野鳥分離到的致病性和非致病性大腸埃希菌作為研究對象，了解禽類不同種屬間大腸埃希菌FQs的耐藥情況及靶位基因gyrA突變，從而正確地使用藥物進(jìn)行治療，為闡述耐藥機制的研究提供實驗數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 9株大腸埃希菌分離自湖北大冶、天門、漢口等地區(qū)雞、鴨、野鳥的肝、脾、腦等組織及糞便，劃線接種于培養(yǎng)基上，其編號和來源如下：菌株C1～C3(雞脾臟、腦、肝等組織),菌株D1～D3(鴨心、肝、脾臟等組織),菌株B1～B3(野鳥糞便)。ATCC25922為藥物敏感性試驗質(zhì)控菌，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品。

1.1.2 檢測藥物與試劑 左氧沙星(5 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、環(huán)丙沙星(5 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、MIX，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法1.2.1 藥敏試驗 藥敏試驗按照CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)推薦的K-B法進(jìn)行。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank(登錄號：KC493121)中大腸埃希菌的引物序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計gyrA基因引物gyrA(F:5′-CGATGTCGGTCATTGTTG-3′，R:5′-ACTTCCGTCAGGTTGTGC-3′)，擴增產(chǎn)物大小為496 bp。

1.2.3 模板DNA提取和PCR擴增 采用水煮沸法，將過夜培養(yǎng)的大腸埃希菌菌液于沸水中煮10 min后置于冰上20 min～30 min，12 000 r/min離心5 min取上清，即為模板DNA。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min;95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。反應(yīng)體系為25 μL體系，即模板DNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，MIX12.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR擴增完成后將PCR產(chǎn)物點樣于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，恒壓為120 V，電流18 mA，15 min，于凝膠成像系統(tǒng)將凝膠結(jié)果進(jìn)行拍照保存。

1.2.4 測序及分析 將gyrA基因PCR擴增產(chǎn)物送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果用DNA Man軟件與GenBank中引物的gyrA基因參考序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對分析，采用DNA Star和MEGA6進(jìn)行不同禽源gyrA基因的同源性和進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗

2.1.1 K-B紙片法的質(zhì)控菌 大腸埃希菌(ATCC25922)的藥敏結(jié)果質(zhì)控范圍見表1，符合大腸埃希菌藥敏試驗的藥敏結(jié)果質(zhì)控范圍。

2.1.2 9株大腸埃希菌的藥物敏感性檢測結(jié)果 結(jié)果見表2。

2.2 大腸埃希菌gyrA基因的PCR擴增

瓊脂糖凝膠電泳顯示，9株禽源大腸埃希菌和質(zhì)控菌株ATCC2599均擴增出分子質(zhì)量大小為496 bp的目的條帶，這與gyrA基因的預(yù)期片段大小一致(圖1)。

表1 質(zhì)控菌大腸埃希菌(ATCC25922)的藥敏結(jié)果質(zhì)控范圍

表2 K-B法藥敏試驗結(jié)果

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～3.雞病料；4～6.鴨病料；7～9.鳥病料；10.ATCC25922

2.3 大腸埃希菌gyrA基因突變

9株不同來源大腸埃希菌分離株的gryA基因氟喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)突變引起的不同堿基和氨基酸替代類型及其發(fā)生的菌株數(shù)見表3、表4、圖2和圖3。

2.4 不同禽源大腸埃希菌gyrA基因的同源性和進(jìn)化樹分析

B2菌株與參考菌株及其他8個菌株的同源在90%左右，而另外8株菌株的同源性與參考菌株的同源均在98%左右，說明了B2菌株的差異明顯高于另外8株試驗菌株。進(jìn)化樹分析表明B2菌株與其他8株禽源大腸埃希菌菌株不在一個分支上，分析結(jié)果結(jié)果見圖4和圖5。

表3 大腸埃希菌gyrA基因核苷酸序列比較分析

表4 大腸埃希菌gyrA基因氨基酸序列比較分析

3 討論

目前對于喹諾酮類藥物的敏感性降低導(dǎo)致臨床上使用此類藥物進(jìn)行預(yù)防和治療沒有效果。而國內(nèi)外對大腸埃希菌耐氟喹諾酮類藥物耐藥機制的研究多集中于人源或動物源致病性大腸埃希菌的研究層面。至于用K-B藥敏紙片法檢測，對喹諾酮的耐藥表型差異不顯著，故現(xiàn)多采用PCR結(jié)合測序?qū)ν蛔兾稽c進(jìn)行分析，從而更好地了解細(xì)菌及病毒樣品中g(shù)yrA基因的分布情況。本研究采用PCR擴增均能擴增出gyrA基因，但其藥敏試驗結(jié)果與PCR結(jié)果不完全一致，故用測序方法找出菌株的gyrA QRDR區(qū)的點突變。Farrera G P等[7]表明豬沙門菌gyrA QRDR區(qū)第83位和87位氨基酸突變，導(dǎo)致了發(fā)病率和病死率增加，降低了抗菌藥物的治療效果。Poramathikul K等[8]對2014年—2015年柬埔寨感染患者的腹瀉樣品中檢測出對gyrA、 parC、 β-內(nèi)酰胺酶和mphA等多重耐藥，多重耐藥問題引起了人們對志賀菌屬的關(guān)注。表明gyrA QRDR區(qū)的有義突變常發(fā)生在第81、82、83、84、87位和106位氨基酸的編碼基因，單位點突變以83位ser→leu最常見，雙位點突變有第83、87位氨基酸取代[9-11]。本試驗中B2菌株的突變發(fā)生在87位Ile→Val替代，而B2菌株的突變發(fā)生在87位Ile→Val替代、101位Leu→Met替代、102位Ala→Ser替代、129位Lys→Gln替代。這與曹麗婷等[12]報道的耐藥菌株的突變發(fā)生在83位ser→leu替代和87位Asp→Asn替代，閆東輝等[13]表明屎腸球菌的gyrA亞單位的83位氨基酸由ser→pro，糞腸球菌gyrA亞單位的87位氨基酸由Glu變?yōu)镚ly，糞腸球菌和屎腸球菌gyrA基因的氨基酸突變不同。對加拿大野鳥大腸埃希菌gyrA、gyrB、parC和parE基因的QRDR區(qū)進(jìn)行測序分析，在所有分離株中g(shù)yrA僅在83位ser→leu，而gyrB、 parC、parE在分離株中未見突變位點[14]。Anna J等[15]表明gyrA的氨基酸突變在83位ser→leu和87位asp→asn，檢出率分別為86%、32%, 有31%菌株存在這2種氨基酸突變。因此，說明了各類別大腸埃希菌中g(shù)yrA基因的分布不同，導(dǎo)致對喹諾酮的耐藥譜不一樣。不同位點的氨基酸替代，同一位點的不同氨基酸替代、單個氨基酸替代或氨基酸雙替代都可導(dǎo)致不同氟喹諾酮的藥物敏感度不同。藥敏結(jié)果表明C1、C2、C3菌株對左氧沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星敏感，D1、D2、D3、B1、B2和B3菌株對左氧沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星均表現(xiàn)為耐藥和中介，說明了在臨床用藥時，應(yīng)了解藥物的使用情況及發(fā)病情況，用藥間隔時間及日齡大小，以避免多重用藥導(dǎo)致耐藥，從源頭上控制抗菌藥物的使用。gyrA基因的突變與大腸埃希菌的耐藥性密切相關(guān)，同源性和進(jìn)化樹分析表明，B2菌株的點突變多，B2菌株與參考菌株及其他8個菌株的同源在90%左右，而另外8株菌株的同源性與參考菌株的同源均在98%左右，說明了B2菌株的差異明顯高于另外8株試驗菌株。致腎盂腎炎大腸埃希菌gyrA基因突變能降低細(xì)菌的毒力，可能與幾種毒力因子(fimA、papB、ompA 基因)和蛋白表達(dá)的DNA超螺旋結(jié)構(gòu)作用有關(guān)，由此降低感染膀胱炎和腎盂腎炎的能力[16-17]。劉果等[18]和阮周曦等[19]分別對長春地區(qū)寵物源和進(jìn)境凍畜禽產(chǎn)品中大腸埃希菌對喹諾酮中的環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率均在50%左右，說明臨床生產(chǎn)中對喹諾酮類藥物的濫用，使得不同動物源的大腸埃希菌均能產(chǎn)生較高的耐藥率。進(jìn)化樹分析表明B2菌株與其他8株禽源大腸埃希菌菌株不在一個分支上，B2菌株的點突變結(jié)果可能與毒力基因、進(jìn)化樹、耐藥基因的分布特點有關(guān)[20-23]，這為后續(xù)的耐藥機理研究提供背景材料，另外針對臨床分離病料，了解藥物使用情況，以減少交叉耐藥，并從源頭上合理選用抗菌藥物及其替代品，最終根據(jù)檢測結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥提供參考。

圖2 大腸埃希菌gyrA基因核苷酸序列比較分析

圖3 大腸埃希菌gyrA基因氨基酸序列比較分析

圖4 9株禽源大腸埃希菌的同源性分析

圖5 9株禽源大腸埃希菌的進(jìn)化樹分析

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Detection and Analysis of gyrA Gene in Fluoroquinolone-resistant AvianEscherichiacoli

LU Qin,LUO Qing-ping,ZHANG Teng-fei,WANG Hong-cai,LUO Ling,WANG Hong-lin,WEN Guo-yuan,ZHANG Rong-rong,SHAO Hua-bin

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinary,HubeiAcademyofAgriculturalSciences，KeyLaboratoryofPreventionandControlAgentsforAnimalBacteriosis,HubeiKeyLaboratoryofAnimalEmbryoEngineeringandMolecularBreeding,Wuhan,Hubei,430064,China)

This paper discussed the distribution and mutation characteristics of gyrA gene and drug resistance of quinolones resistant gene in different avianEscherichiacoli.The quinolone resistance test of 9E.coliwere determinded by the K-B method.After PCR amplification of gyrA gene,sequencing,the softwares as DNA MAN，DNA STAR，MEGA6 were used to analyze the results.The result of drug sensitivity test showed that strains of C1，C2 and C3 were sensitive to levofloxacin，ofloxacin，ciprofloxacin and norfloxacin,strains of D1，D2，D3， B1，B2 and B3 were resistant and intermediate to levofloxacin，ofloxacin，ciprofloxacin and norfloxacin.Sequence analysis of gyrA gene showed 1 mutation in the nucleotide in strain B1 and 14 mutations in stain B2;gyrA gene showed 4 mutations in the amino acids in strain B2，which resulted in 87 Ile →Val,101 Leu→Met,102 Ala→Ser and 129 Lys→ Gln.Homology and phylogenetic tree analysis of 9 strains of avianEscherichiacolishowed fluoroquinolone-resistant strains from different avianE.coli，compared with other 9 strains,the homology of gyrA gene of B2 strain was at 90%，phylogenetic tree was not in a same branch.B2 strain in this resarch provided candidate strain to study the fluoroquinolone-resistance mechanism ofE.coli.

avianEscherichiacoli；fluoroquinolone；drug-resistance strain；gyrA gene

2016-08-26

國家重點研發(fā)計劃項目 (2016YFD0501305,2016YFD0500800)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項項目(201303044)； 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金項目(CARS-42-G11)； 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科學(xué)基金項目(2016NKYJJ16)

盧 琴(1989-)，女，湖南常德人，研究實習(xí)員，碩士，主要從事禽病防控研究工作。*通訊作者

S852.612

A

1007-5038(2017)04-0052-06