田光明，游 蕾

(1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434023；2.長(zhǎng)江大學(xué)城市建設(shè)學(xué)院，湖北荊州 434023)

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聚γ谷氨酸生物合成與DegR關(guān)系及其免疫佐劑效果研究

田光明1，游 蕾2*

(1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434023；2.長(zhǎng)江大學(xué)城市建設(shè)學(xué)院，湖北荊州 434023)

為探討調(diào)節(jié)因子DegR對(duì)聚γ谷氨酸(γ-PGA)生物合成產(chǎn)量的影響，比較聚γ谷氨酸佐劑和傳統(tǒng)鋁佐劑的輔助免疫效果，利用P43啟動(dòng)子構(gòu)建了穿梭表達(dá)載體pHY-degR，通過(guò)電轉(zhuǎn)化地衣芽胞桿菌WX-02獲得重組菌株WX-02/pHYdegR。同時(shí)以福爾馬林滅活的金黃色葡萄球菌蛋白疫苗作為免疫原，分別以不同分子質(zhì)量聚γ谷氨酸佐劑和鋁佐劑制備相關(guān)疫苗并免疫小鼠，7 d后注射金黃色葡萄球菌，根據(jù)小鼠死亡數(shù)，計(jì)算其相對(duì)免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)degR后，聚γ谷氨酸生物合成產(chǎn)量提高至28.5 g/L，相比對(duì)照菌株WX-02/pHY300提高22.6%。分子質(zhì)量2×103ku聚γ谷氨酸作為佐劑的相對(duì)免疫保護(hù)率效果最好(78.9%)，優(yōu)于鋁佐劑免疫保護(hù)率(52.6%)和未添加佐劑免疫保護(hù)率(42.1%)。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)degR基因能提高聚γ谷氨酸生物合成量，且聚γ谷氨酸作為疫苗佐劑能增強(qiáng)疫苗免疫效果，可作為理想的疫苗佐劑。

地衣芽胞桿菌；聚γ谷氨酸；degR；疫苗佐劑；免疫效果

聚γ谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，γ-PGA)是一類天然的陰離子型高分子聚合物，由L-谷氨酸和D-谷氨酸單體通過(guò)γ酰胺鍵聚合而成，其分子質(zhì)量在1×101ku～1×104ku之間[1]。 由于γ-PGA具有良好的水溶性、可吸附性、可被生物降解，且無(wú)毒害等優(yōu)良特性，在動(dòng)物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用研究越來(lái)越深入[2]。Tian M等[3]發(fā)現(xiàn)γ-PGA結(jié)合的造影劑成像效果相比其他造影劑具有更好的弛豫性和安全性。高分子質(zhì)量γ-PGA可顯著調(diào)節(jié)小鼠免疫系統(tǒng)NK細(xì)胞，飼喂小鼠高分子質(zhì)量γ-PGA后，小鼠NK細(xì)胞被激活，抗腫瘤的效果顯著優(yōu)于其他誘導(dǎo)劑[4]。γ-PGA和L-苯丙氨酸復(fù)合物可以激活吞噬細(xì)胞和小細(xì)胞，減輕炎癥反應(yīng)癥狀，與常規(guī)類固醇類藥物可以引起并發(fā)癥相比，γ-PGA和L-苯丙氨酸復(fù)合物具有無(wú)毒副作用等明顯的優(yōu)勢(shì)[5]。在細(xì)菌性和病毒性傳染病研究中，Kim E H等[6]發(fā)現(xiàn)，γ-PGA可以促進(jìn)感染流感病毒小鼠體內(nèi)產(chǎn)生IFN-β和IL-12等細(xì)胞因子，且小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞和抗原CTL活性顯著提高。在藥物載體和疫苗佐劑研究中，Okamoto S等[7]在流感血球凝集素疫苗中添加γ-PGA，增強(qiáng)了小鼠體內(nèi)保護(hù)性免疫能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，γ-PGA作為疫苗佐劑能顯著提高腦炎小鼠血清抗體效價(jià)，且單劑量注射小鼠存活率為100%[8]。Hee S M等[9]在家兔中利用γ-PGA作為胃腸炎病毒疫苗佐劑，發(fā)現(xiàn)其抗體數(shù)量明顯高于未添加γ-PGA佐劑疫苗。眾多研究成果表明，γ-PGA在動(dòng)物醫(yī)學(xué)中有著良好的應(yīng)用前景。

γ-PGA主要由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，生物合成量是限制γ-PGA在動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的制約因素之一。目前關(guān)于提高γ-PGA產(chǎn)量的研究主要集中在以下幾個(gè)方面:利用基因工程技術(shù)進(jìn)行代謝途徑改造[10]，改變?chǔ)?PGA中D/L型谷氨酸的比例[11]，改變?chǔ)?PGA的分子質(zhì)量[12]，提高細(xì)胞對(duì)氧的攝取能力[13]。優(yōu)化培養(yǎng)基，包括添加金屬離子Mn2+和Ca2+，一些前體物質(zhì)包括α-酮戊二酸、檸檬酸、谷氨酰胺等[14]。優(yōu)化發(fā)酵條件、改變通氣量、pH和攪拌轉(zhuǎn)速[15]等系列措施提高γ-PGA產(chǎn)量。但通過(guò)對(duì)γ-PGA合成調(diào)控途徑的改造來(lái)提高γ-PGA產(chǎn)量的報(bào)道較少。

DegU是一個(gè)多態(tài)性調(diào)節(jié)因子，通過(guò)促進(jìn)或抑制受其調(diào)節(jié)的靶基因的轉(zhuǎn)錄[16]。不同磷酸化程度的DegU調(diào)控著不同的細(xì)胞活動(dòng)。本試驗(yàn)通過(guò)表達(dá)DegU磷酸化正調(diào)節(jié)因子degR的表達(dá)水平，研究其對(duì)地衣芽胞桿菌合成γ-PGA的影響，同時(shí)研究不同分子質(zhì)量γ-PGA作為疫苗佐劑對(duì)小鼠相對(duì)免疫保護(hù)率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸埃希菌DH5α(F-Φ80d/lacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,recA1,endA1,hsdR17 (rK-,mK+),phoA,supE44,λ-, thi-1,gyrA96,relA1);地衣芽胞桿菌WX-02(CCTCC M208065,野生菌)、地衣芽胞桿菌WX-02/pHYdegR(WX-02含pHYdegR質(zhì)粒的過(guò)表達(dá)菌株)、地衣芽胞桿菌WX-02/pHY300(WX-02含pHY300PLK空質(zhì)粒菌株)；地衣芽胞桿菌WX-02與金黃色葡萄球菌由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。質(zhì)粒pHY300PLK，E.coli-B.licheniformis穿梭質(zhì)粒,Apr(E.coli),Tetr(E.coliandB.licheniformis)；pHY-degR，pHY300PLK含有B.subtilisP43啟動(dòng)子、B.licheniformisWX-02 degR基因和amyL基因；Staphylococcusaureus為野生菌，表達(dá)質(zhì)粒pHY300PLK用于degR過(guò)表達(dá)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠,40日齡，平均體重20 g±2 g，無(wú)病無(wú)傷，定期投喂飼料。

1.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基 γ-PGA，長(zhǎng)江大學(xué)濕地生態(tài)與利用教育部工程研究中心制備保存；蛋白定量試劑盒、DNA提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶等，天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

大腸埃希菌和地衣芽胞桿菌于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。地衣芽胞桿菌發(fā)酵γ-PGA的培養(yǎng)基參考Tian G等[12]配方。四環(huán)素濃度為20 μg/mL。

大豆肉湯培養(yǎng)基成份為胰蛋白胨 17 g/L，大豆蛋白胨3 g/L，葡萄糖 2.5 g/L，氯化鈉 10 g/L，K2HPO42.5 g/L。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體pHY-degR構(gòu)建 根據(jù)地衣芽胞桿菌WX-02的degR基因序列設(shè)計(jì)引物degR-F，degR-R(表1)擴(kuò)增degR基因基因大小為183 bp；以amyL-F，amyL-R為引物，擴(kuò)增淀粉酶終止序列片段(501 bp)；以枯草芽胞桿菌168的總DNA為模板，以P43-F和P43-R為引物，擴(kuò)增P43啟動(dòng)子序列片段(388 bp)。 以上述3個(gè)片段為模板，以P43-F和amyL-R為引物，通過(guò)重疊延伸PCR(SOE-PCR)， 得到融合片段P43-degR-amyL。PCR產(chǎn)物純化后與pHY300PLK載體同時(shí)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ進(jìn)行酶切，回收后進(jìn)一步用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，提取陽(yáng)性菌落質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證并測(cè)序，構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pHY-degR。

表1 引物

注：下劃線為限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。

Note：Underline means restriction enzyme cleavage site.

1.2.2 degR強(qiáng)化表達(dá)菌株構(gòu)建 將上述得到的重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒pHY300PLK電轉(zhuǎn)化地衣芽胞桿菌WX-02菌株。經(jīng)抗性篩選和菌落PCR驗(yàn)證，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取重組菌中的pHY-degR質(zhì)粒，以質(zhì)粒作為模板，引物pHY300-YF/pHY300-YR進(jìn)一步進(jìn)行PCR驗(yàn)證。過(guò)表達(dá)degR的菌株和轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒菌株分別命名為WX-02/pHYdegR和WX-02/pHY300。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵

1.2.3.1 菌種活化 從超低溫冰箱中取出保藏的菌種劃線LB平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)基12 h。

1.2.3.2 種子培養(yǎng) 以LB為種子培養(yǎng)基，250 mL三角瓶裝液量50 mL，37℃、180 r/min培養(yǎng)9 h。

1.2.3.3 γ-PGA發(fā)酵條件 接種量3%，250 mL三角瓶裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、180 r/min培養(yǎng)36 h。

1.2.4 免疫原制備 無(wú)菌條件下，接種金黃色葡萄球菌至LB培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)16 h后收集菌體，加入終濃度為3.0 mL/L福爾馬林，恒溫滅活后提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整至0.2 mg/mL。

鋁膠鹽佐劑疫苗制備[17]：免疫原與實(shí)驗(yàn)室制備的鋁膠鹽佐劑按5∶1(V/V)充分混勻，置4℃冰箱備用。

γ-PGA佐劑疫苗制備：取γ-PGA溶解于滅菌ddH2O，濃度為1 000 mg/mL，取免疫原與此濃度γ-PGA按體積比5∶1(V/V)混勻，置4℃冰箱備用。

1.2.5 動(dòng)物免疫 取小鼠40只隨機(jī)分成6組，免疫Ⅰ組小鼠分別背部皮下注射鋁膠鹽佐劑疫苗, 免疫Ⅱ組、免疫Ⅲ組、免疫Ⅳ組分別注射分子質(zhì)量為2×102、2×103、6×103ku γ-PGA佐劑疫苗，免疫Ⅴ組注射不添加佐劑疫苗，對(duì)照組注射等量滅菌生理鹽水。

1.2.6 免疫保護(hù)試驗(yàn) 免疫后7 d，6組小鼠分別腹腔注射0.5 mL金黃色葡萄球菌菌液，菌數(shù)為1×108CFU，觀察7 d，記錄小鼠死亡情況，計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率。

1.2.7 分析方法

1.2.7.1 生物量和殘留葡萄糖含量測(cè)定 菌體生物量測(cè)定采用光密度法。取一定體積的發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，調(diào)酸至pH2.5，離心去上清，用蒸餾水洗滌2次，稀釋合適范圍，分光光度計(jì)測(cè)定600 nm的吸光度值。發(fā)酵液中殘留葡萄糖利用生物傳感分析儀SBA-40E進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7.2 高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定乙酸與聚γ谷氨酸濃度 發(fā)酵液預(yù)處理：利用去離子水將發(fā)酵液稀釋30倍，離心除菌體，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC-凝膠滲透色譜檢測(cè)。凝膠滲透色譜檢測(cè)條件為：采用TSK Gel G6000 PWXL凝膠滲透色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相為25 mmol/L的無(wú)水硫酸鈉和乙腈的混合液，體積比8∶1，流速0.5 mL/min。

1.2.7.3 氣相色譜法檢測(cè)乙偶姻與 2, 3-丁二醇濃度 取1 mL發(fā)酵液，12 000 r/min，離心4 min，取上清經(jīng)乙酸乙酯萃取，以正丁醇為內(nèi)標(biāo)，萃取后的2,3-丁二醇的含量由氣相色譜儀完成。氣相色譜參數(shù)如下：伽諾FFAP毛細(xì)管柱 (30 m×0.32 mm ID, 0.33 μm Film)，火焰離子化檢測(cè)器，載氣為N2，流量為1.0 mL/min，氫氣流量30 mL/min，空氣流量300 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣器溫度200℃，檢測(cè)器溫度280℃，柱溫箱升溫程序：40℃保持1 min，以6℃/min升溫至60℃保持1.5 min，以15℃/min升溫至160℃保持2.5 min。采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算乙偶姻和2, 3-丁二醇的含量。

1.2.7.4 相對(duì)免疫保護(hù)率 相對(duì)免疫保護(hù)率依據(jù)下列公式進(jìn)行計(jì)算：

相對(duì)免疫保護(hù)率=(1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)×100%。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 每組試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，計(jì)算出數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差；采用Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析；并采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在One way ANOVA下進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，比較兩兩樣品之間的差別，(P<0.05)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體pHY-degR的構(gòu)建

將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒包含的1 062 bp融合片段P43-degR-TamyL進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切電泳結(jié)果如圖1所示，片段大小與預(yù)期相符，將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果顯示，插入片段區(qū)域未發(fā)生突變，表明degR表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pHY-degR。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1、2.重組質(zhì)粒pHY-degR經(jīng)EcoRⅠ 和 Xba Ⅰ雙酶切產(chǎn)物

2.2 重組地衣芽胞桿菌菌株構(gòu)建

提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子粒DNA為模板，進(jìn)行PCR鑒定，如圖2所示，PCR結(jié)果大小與預(yù)期相符，成功獲得了degR強(qiáng)化表達(dá)菌株和轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒菌株，分別命名為WX-02/pHYdegR和WX-02/pHY300。

2.3 溢代謝產(chǎn)物乙偶姻，2, 3-丁二醇和乙酸檢測(cè)

發(fā)酵終點(diǎn)重組菌株和對(duì)照菌株主要溢流代謝物乙偶姻，2, 3-丁二醇和乙酸的含量如表2所示，過(guò)表達(dá)degR后，重組菌中溢流代謝物乙偶姻，2, 3-丁二醇和乙酸含量分別為8.3、11.55、3.35 g/L。分別比對(duì)照菌株降低了20.9%、10%和20%。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1.degR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒;2.空質(zhì)粒

表2 degR強(qiáng)化表達(dá)對(duì)乙偶姻和2,3-丁二醇，乙酸濃度的影響

2.4 發(fā)酵過(guò)程生物量及γ-PGA產(chǎn)量檢測(cè)

對(duì)重組菌株WX-02/pHYdegR和對(duì)照菌株WX-02/pHY300進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中殘留葡萄糖、生物量以及γ-PGA產(chǎn)量。結(jié)果如圖3所示，在發(fā)酵前20 h，重組菌株WX-02/pHYdegR生物量與對(duì)照菌株相當(dāng)，20 h之后到發(fā)酵終點(diǎn)，重組菌株生物量略低于對(duì)照菌株；重組菌株葡萄糖消耗與生物量的趨勢(shì)一致。重組菌株WX-02/pHYdegR發(fā)酵前20 h，γ-PGA產(chǎn)量與對(duì)照菌株差別不大，發(fā)酵后期，其γ-PGA產(chǎn)量比對(duì)照菌株要高，發(fā)酵結(jié)束后，γ-PGA產(chǎn)量顯著高于對(duì)照菌株。過(guò)表達(dá)degR基因重組菌株γ-PGA的產(chǎn)量達(dá)到28.5 g/L，相比對(duì)照菌株WX-02/pHY300提高了22.6%。

2.5 相對(duì)免疫保護(hù)率

攻毒7 d后，免疫Ⅰ、Ⅱ組和免疫對(duì)照組均表現(xiàn)出明顯的相對(duì)保護(hù)率，免疫I組相對(duì)保護(hù)率為52.6%，免疫Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組相對(duì)保護(hù)率分別為68.4%、78.9%和63.1%，免疫Ⅴ組相對(duì)保護(hù)率為42.1%(表3)。對(duì)攻毒感染試驗(yàn)死亡小鼠進(jìn)行剖檢，分離培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，確定試驗(yàn)死亡原因?yàn)楦腥窘瘘S色葡萄球菌致死。

圖3 重組菌株WX-02/pHYdegR和對(duì)照菌株WX-02/pHY300發(fā)酵過(guò)程曲線

表3 活菌攻毒后小鼠死亡率和相對(duì)免疫保護(hù)率

3 討論

疫苗佐劑是動(dòng)物疫苗中重要的組成部分，可作為輔助物質(zhì)增強(qiáng)疫苗免疫作用，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的特異性應(yīng)答，被廣泛應(yīng)用于疫苗制備。合適的疫苗佐劑對(duì)于提高疫苗效果有著重要的意義[18-19]。

γ-PGA是一類由微生物產(chǎn)生的天然高分子聚合物，具有無(wú)毒、可降解等特性，逐漸為人們認(rèn)可并重視，應(yīng)用前景廣闊。隨著對(duì)γ-PGA的研究的深入，其生物合成產(chǎn)量成為限制其在疫苗佐劑中應(yīng)用的重要障礙。地衣芽胞桿菌是重要的γ-PGA生產(chǎn)菌株，研究表明，DegR能夠促進(jìn)DegU磷酸化，從而提高磷酸化的DegU濃度，進(jìn)而激發(fā)受高濃度磷酸化DegU調(diào)控的基因的表達(dá)[20]。 高磷酸化程度DegU亦可激活聚γ-PGA合成酶的編碼基因轉(zhuǎn)錄，從而提高γ-PGA產(chǎn)量[21]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在γ-PGA生產(chǎn)菌株地衣芽胞桿菌中加強(qiáng)degR基因轉(zhuǎn)錄水平可降低乙偶姻、2, 3-丁二醇和乙酸等溢流代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，最終導(dǎo)致γ-PGA產(chǎn)量顯著提高，該結(jié)果與Ohsawa T等[21]與Stanley N R等[22]的研究結(jié)果一致。動(dòng)物免疫保護(hù)結(jié)果表明，相比傳統(tǒng)鋁佐劑，γ-PGA作為疫苗佐劑具有進(jìn)一步增強(qiáng)小鼠機(jī)體抵抗金黃色葡萄球菌感染的能力，可產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，其中以分子質(zhì)量為2×103ku γ-PGA佐劑相對(duì)免疫效果最佳。該結(jié)果與Kim E H等[6]和Okamoto S等[7]研究發(fā)現(xiàn)的γ-PGA可增強(qiáng)小鼠體內(nèi)免疫能力結(jié)果一致。本研究以DegU磷酸化正調(diào)節(jié)因子degR基因?yàn)檠芯繉?duì)象，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)degR基因可以降低溢流代謝產(chǎn)物生成，最終提高γ-PGA生物合成量。同傳統(tǒng)鋁佐劑相比，γ-PGA能刺激機(jī)體產(chǎn)生更好的免疫效果，本試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)γ-PGA能增強(qiáng)小鼠機(jī)體免疫力，為γ-PGA在細(xì)菌疫苗佐劑在疫苗研制中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究提供了一種有效的增強(qiáng)γ-PGA生物合成的方法，該方法在γ-PGA生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)為擴(kuò)大具有生物降解等優(yōu)良特性的γ-PGA在動(dòng)物疫苗中應(yīng)用提供了寶貴依據(jù)。

[1] Ogunleye A,Bhat A,Irorere V U,et al.Poly-γ-glutamic acid:production,properties and applications[J].Microbiology,2015,161(1):1-17.

[2] Shih I L,Van Y T.The production of poly-(gamma-glutamic acid) from microorganisms and its various applications[J].Bioresource Technol,2001,79(3):207-225.

[3] Tian M,Wen X,Jackson E F,et al.Pharmacokinetics and magnetic resonance imaging of biodegradable macromolecular blood-pool contrast agent PG-Gd in non-human primates: a pilot study[J].Contrast Media & Molecular Imaging,2011,6(4):289-297.

[4] Kim T W,Lee T Y,Bae H C,et al.Oral administration of high molecular mass poly-γ-glutamate induces NK cell-mediated antitumor immunity[J].J Immunol,2007,179(2):775-780.

[5] Ryu M,Nakazawa T,Akagi T,et al.Suppression of phagocytic cells in retinal disorders using amphiphilic poly(γ-glutamic acid) nanoparticles containing dexamethasone[J].J Controlled Release,2011,151(1):65-73.

[6] Kim E H,Choi Y K,Kim C J,et al.Intranasal administration of poly-gamma glutamate induced antiviral activity and protective immune responses against H1N1 influenza A virus infection[J].Virol J,2015,12(1):1-10.

[7] Okamoto S,Yoshii H,Ishikawa T,et al.Single dose of inactivated Japanese encephalitis vaccine with poly(γ-glutamic acid) nanoparticles provides effective protection from Japanese encephalitis virus[J].Vaccine,2008, 26(5):589-594.

[8] Okamoto S,Matsuura M,Takami A,et al.Poly(γ-glutamic acid) nano-particles combined with mucosal influenza virus hemagglutinin vaccine protects against influenza virus infection in mice[J].Vaccine,2009,27(42):5896-5905.

[9] Hee S M,Joong K C,Ryoung P H,et al.Composition for adjuvant containing poly-gamma-glutamic acid: WO090968[P].2006.

[10] Feng J,Gu Y,Quan Y,et al.Improved poly-γ-glutamic acid production inBacillusamyloliquefaciensby modular pathway engineering[J].Metabolic Engineer,2015,32:106-115.

[11] Jiang F,Qi G,Ji Z,et al.Expression of glr gene encoding glutamate racemase inBacilluslicheniformisWX-02 and its regulatory effects on synthesis of poly-γ-glutamic acid[J].Biotechnol Let,2011,33(9):1837-1840.

[12] Tian G,Fu J,Wei X,et al.Enhanced expression of pgdS gene for high production of poly-γ-glutamic aicd with lower molecular weight in Bacillus licheniformis WX-02[J].J Chem Technol Biotechnol,2014,89(12):1825-1832.

[13] Zhang W,Xie H,He Y,et al.Chromosome integration of the Vitreoscilla hemoglobin gene (vgb) mediated by temperature-sensitive plasmid enhances γ-PGA production inBacillusamyloliquefaciens[J].FEMS Microbiol Let,2013,343(2):127-134.

[14] Li X,Gou X,Long D,et al.Physiological and metabolic analysis of nitrate reduction on poly-γ-glutamic acid synthesis inBacilluslicheniformisWX-02[J].Arch Microbiol,2014,196(11):791-799.

[15] Bajaj I B,Singhal R S.Effect of aeration and agitation on synthesis of poly (γ-glutamic acid) in batch cultures ofBacilluslicheniformisNCIM 2324[J].Biotechnol Bioproc Enginee,2010,15(4):635-640.

[16] Kobayashi K.Gradual activation of the response regulator DegU controls serial expression of genes for flagellum formation and biofilm formation inBacillussubtilis[J].Mol Microbiol,2007,66(2):395-409.

[17] 侯偉杰,高 洋,高晶暉,等.三種佐劑對(duì)奶山羊乳房炎滅活疫苗免疫效果的影響[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(1):45-48.

[18] 劉宇卓,李嘉萍,李 銀,等.不同佐劑制備的雞坦布蘇病毒滅活疫苗免疫效果比較[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,28(10):60-63.

[19] 王 凱,何天駿,胡福良.蜂膠佐劑在獸用疫苗中的應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,34(10):111-115.

[20] Mukai K,Kawata-Mukai M,Tanaka T.Stabilization of phosphorylatedBacillussubtilisDegU by DegR[J].J Bacteriol,1992,174(24):7954-7962.

[21] Ohsawa T,Tsukahara K,Ogura M.Bacillussubtilisresponse regulator DegU is a direct activator of pgsB transcription involved in γ-poly-glutamic acid synthesis[J].Biosci Biotechnol Biochem,2009,73(9):2096-3102.

[22] Stanley N R,Lazazzera B A.Defining the genetic differences between wild and domestic strains ofBacillussubtilisthat affect poly-γ-DL-glutamic acid production and biofilm formation[J].Mol Microbiol, 2005,57(4):1143-1158.

Study on Poly-γ-glutamic Acid Biosynthesis with degR Overexpression and Poly-γ-glutamic Acid Adjuvant Effect

TIAN Guang-ming1,YOU Lei2

(1.CollegeofAnimalScience，YangtzeUniversity,Jingzhou,Hubei,434023,China; 2.SchoolofUrbanConstruction,YangtzeUniversity,Jingzhou,Hubei,434023,China)

To investigate the effect of the overexpression of degR gene on the yield of poly-γ-glutamic acid and the immune effect of γ-PGA adjuvant,an engineered strain ofB.licheniformis(WX-02/pHYdegR) was developed.Transformation ofB.licheniformisWX-02 with a shuttle plasmid pHY-degR builded by strong promoter P43 was performed via electroporation.Meanwhile,formalin-killedStaphylococcusaureusproteins were used as immunogen with different adjuvants (alum adjuvant and γ-PGA adjuvant) to immunize healthy mice.The relative immune protection rate was measured after 7 days according to the mouse mortality after injecting viableStaphylococcusaureus.The results showed that the yield of γ-PGA reached 28.5 g/L,increased by 22.6% in comparison with that of the control (23.25 g/L) by enhancing expression of degR geneinvivo.In the immune-protective experiment,the immunogen mixed with γ-PGA adjuvant (2×103ku) had the best immune effect (78.9%) compared with alum adjuvant (52.6%) and pure immunogen (42.1%).Therefore,γ-PGA adjuvant can be used as an ideal adjuvant in veterinary field.

Bacilluslicheniformis;poly-γ-glutamic acid; degR;adjuvant;immune effect

2016-11-11

湖北省教育廳青年人才基金項(xiàng)目(q20151306);濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心基金項(xiàng)目(KF201509)

田光明(1979-)，男，江蘇鹽城人，博士研究生，主要從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)微生物研究。*通訊作者

S852.4

A

1007-5038(2017)04-0046-06