歐云文,馬小元,王 俊,丁耀忠,張永光,張 杰*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046)

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研究論文

豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的原核表達(dá)及反應(yīng)原性分析

歐云文1,2,馬小元2,王 俊2,丁耀忠2,張永光2,張 杰2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046)

研究豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性，為開發(fā)PCV2的檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。以PCV2 CAU0673毒株的DNA為模板，擴(kuò)增獲得702 bp的目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pET30a(+)原核表達(dá)載體，構(gòu)建pET30a-PCV2-ORF2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)；在37 ℃以1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h；采用Ni-NTA樹脂親和層析純化重組蛋白，并用不同濃度的尿素對(duì)純化蛋白進(jìn)行復(fù)性。SDS-PAGE分析表明，該ORF2編碼基因在大腸埃希菌中得到表達(dá)，蛋白大小約為34 ku；Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，該重組Cap蛋白與PCV2陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，與NA-PRRSV和PPV1血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。成功構(gòu)建了PCV2-ORF2原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了在大腸埃希菌中的表達(dá)，純化后的復(fù)性蛋白具有較好的反應(yīng)原性，為豬圓環(huán)病毒2型檢測(cè)方法建立或試劑盒的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

豬圓環(huán)病毒2型；ORF2基因；原核表達(dá)；反應(yīng)原性

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是無(wú)囊膜的、環(huán)狀、單股負(fù)鏈DNA病毒，為目前已知最小的動(dòng)物病毒；豬感染該病毒后，導(dǎo)致其免疫機(jī)能及生產(chǎn)機(jī)能下降，常表現(xiàn)消瘦、黃疸、呼吸急促、咳喘等臨床癥狀，是嚴(yán)重影響國(guó)內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要病原之一[1]。豬圓環(huán)病毒分為兩個(gè)基因型，即豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)。1974年，Tischer I等[2]首次從PK-15細(xì)胞系中分離出PCV1，長(zhǎng)期研究表明,該病毒無(wú)明顯致病性，廣泛存在于正常豬體內(nèi)的多個(gè)組織器官之中[3-4]；PCV2于1991年在加拿大首次被分離，該病毒可導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，PCV2是豬圓環(huán)病毒家族中非常重要的成員，也是豬群中最常見的豬圓環(huán)病毒型[5]。與此同時(shí)，PCV2常和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)等繁殖障礙性病毒混合感染而導(dǎo)致豬只發(fā)病，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6-9]。因而，加強(qiáng)PCV2的研究，對(duì)有效預(yù)防和控制豬圓環(huán)病毒2型有著重要意義。

PCV2是環(huán)狀、單股負(fù)鏈DNA病毒，基因組大小為1 768 bp，病毒粒子呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，病毒基因組包含有11個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)[10]。其中ORF1主要編碼Rep蛋白，該蛋白是病毒復(fù)制過程中必需的非結(jié)構(gòu)蛋白[11]；ORF3基因位于ORF1區(qū)域之內(nèi)，但是與ORF1的轉(zhuǎn)錄方向相反，ORF3編碼一種病毒復(fù)制所非必需的非結(jié)構(gòu)蛋白，但是其可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的凋亡[12-13]；ORF4位于ORF3基因的內(nèi)部，編碼方向與ORF3相同，其也不是病毒復(fù)制所必需的[14]；ORF5、ORF7、ORF10與ORF1在5′-3′方向相同，位于病毒基因組的負(fù)鏈上，ORF6、ORF8、ORF9、ORF11 與ORF2、ORF3、ORF4在5′-3′方向相同，位于病毒基因組互補(bǔ)鏈上，并且這些閱讀框互相重疊，使PCV2的遺傳信息得到充分表達(dá)[10]。ORF2主要編碼Cap蛋白，Cap蛋白分子量大小約27. 8 ku，由233個(gè)～234個(gè)氨基酸構(gòu)成，該蛋白是PCV2唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，完整的病毒顆粒由Cap蛋白包裹病毒基因組而形成，以及該蛋白與豬圓環(huán)病毒2型的感染與免疫有著密切關(guān)系[15]。因此，Cap蛋白常常作為研發(fā)PCV2疫苗和PCV2檢測(cè)方法的目的蛋白[16-18]。本研究主要以PCV2的ORF2基因?yàn)閰⒖夹蛄?，以PCV2毒株(CAU0673)的DNA為模板，設(shè)計(jì)了編碼Cap蛋白的表達(dá)引物，誘導(dǎo)表達(dá)該氨基酸片段，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，探討該重組蛋白的反應(yīng)原性，為后續(xù)的診斷方法或試劑盒開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 pET30a(+)載體，Novagen公司產(chǎn)品；即用型透析袋，Spectrum公司產(chǎn)品；Ni-NTA樹脂，Qiagen公司產(chǎn)品；PCV2毒株(CAU0673)，中國(guó)獸藥監(jiān)察所保存；PCV2陽(yáng)性血清、NA-PRRSV陽(yáng)性血清，VMRD公司產(chǎn)品；PPV1陽(yáng)性血清，豬細(xì)小病毒滅活疫苗(WH-1株，購(gòu)于中牧實(shí)業(yè)股份有限公司)制備的高免陽(yáng)性血清；NA-PRRSV-N重組蛋白、PPV1-VP2重組蛋白，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室抗體工程課題組實(shí)驗(yàn)室制備；Trans109感受態(tài)和BL21(DE3)感受態(tài)，抗體工程課題組實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 DNA Marker DL 2 000、蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、BamH Ⅰ、XhoⅠ限制性酶，TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量制備試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR清潔試劑盒，AxyPrep公司產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；異丙基-β-D-硫代半乳糖甘(IPTG)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗豬IgG，Sigma公司產(chǎn)品；蛋白胨、酵母提取物， Oxoid(英國(guó))公司產(chǎn)品；卡那霉素，Hyclone公司產(chǎn)品；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的PCV2的ORF2基因?yàn)閰⒖夹蛄?登錄號(hào)：DQ235696)，設(shè)計(jì)Cap蛋白編碼區(qū)的表達(dá)特異性引物，在上游引物加上BamH I限制性酶切位點(diǎn)，在下游引物加上XhoI限制性酶切位點(diǎn)。上游引物P1：5′-CGCGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTC-3′；下游引物P2：5′-CCGCTCGAGTCTTAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3′，引物由Invitrogen(上海)公司合成。

1.2.2 病毒DNA提取與PCR擴(kuò)增 按照TaKaRa公司 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒的操作說明提取PCV2毒株(CAU0673)DNA，以抽提的DNA為模板，采用50 μL反應(yīng)體系，即Ex-Taq酶25 μL，上、下游引物各1 μL，模板 2.5 μL，補(bǔ)水至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，樣品置-20 ℃保存。

1.2.3 pET30a-PCV2-ORF2重組載體的構(gòu)建與鑒定 利用BamH I和XhoI分別對(duì)pET30a(+)載體和DNA凝膠回收產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系為：PCR膠回收產(chǎn)物或pET30a(+)載體20 μL，10×K buffer 3 μL，BamH I 2 μL，XhoI 2 μL，ddH2O 3 μL，總體積為30 μL。輕微振蕩混勻，瞬時(shí)離心，先放入30 ℃水浴3 h，再37 ℃水浴3 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶16 ℃連接過夜，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于Trans109大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素抗性的LA平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落過夜培養(yǎng)，離心收菌，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行BamH I、XhoI酶切鑒定，將構(gòu)建成功的pET30a-PCV2-ORF2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并按上述相同方法培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR鑒定和BamH I、XhoI酶切鑒定，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送往GENEWIZ(金唯智)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 重組蛋白表達(dá)及SDS-PAGE電泳鑒定 分別設(shè)置終濃度為0.5、1、2 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)溫度為25、30、37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為6、12、24 h，優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件；將篩選出的陽(yáng)性重組質(zhì)粒的表達(dá)菌(即大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài))于37 ℃振蕩培養(yǎng)約3 h，至OD nm 600值為0.6～1.0時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L IPTG于37 ℃誘導(dǎo)6 h，12 000 r/min離心收菌，ddH2O懸浮洗滌，對(duì)菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，觀察重組蛋白表達(dá)情況，再對(duì)重組菌體懸浮液進(jìn)行超聲破碎，離心收集上清裂解液和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，分析重組蛋白的存在方式。

1.2.5 重組蛋白Ni-NTA樹脂純化及復(fù)性 按照QIAGEN公司的Ni-NTA樹脂使用說明書對(duì)以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白分別用包涵體洗滌緩沖液(pH8.0)、2 mol/L尿素洗滌2次～3次，離心棄上清液保留沉淀，再用buffer B(pH8.0)溶解包涵體沉淀，離心棄沉淀保留上清液。將樣品與Ni- NTA樹脂室溫結(jié)合40 min，上柱，然后分別用buffer C(pH6.3)、buffer D(pH5.9)、buffer E(pH4.5)洗滌柱子，并分別收集對(duì)應(yīng)積份，對(duì)每個(gè)積份進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定目的蛋白存在于何種積份，并測(cè)定含有目的蛋白條帶積份的OD 280 nm值。再將純化后的蛋白液依次放于8、4、2、1 mol/L尿素、PBS液中進(jìn)行透析復(fù)性，每種透析液透析時(shí)間為6 h，最后對(duì)復(fù)性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重組蛋白的Western blot分析 純化的復(fù)性重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加PCV2陽(yáng)性血清(1∶100稀釋)于室溫?fù)u床孵育1 h，PBST緩沖液洗滌PVDF膜3遍，再加HRP標(biāo)記的豬二抗(1∶5 000稀釋)于室溫?fù)u床孵育1 h，PBST緩沖液洗PVDF膜3遍，HRP-DAB底物顯色試劑避光顯色10 min，暗室中曝光，同時(shí)設(shè)pET30a空載體誘導(dǎo)表達(dá)菌作為陰性對(duì)照；采用上述相同的方法將復(fù)性PCV2-Cap重組蛋白與復(fù)性NA-PRRSV-N重組蛋白，復(fù)性PCV2-Cap重組蛋白與復(fù)性PPV1-VP2重組蛋白分別轉(zhuǎn)印至2張PVDF膜，脫脂奶粉封閉，分別加豬繁殖與呼吸綜合征病毒(NA-PRRSV)陽(yáng)性血清(1∶100稀釋)、豬細(xì)小病毒1型(PPV1)陽(yáng)性血清(1∶100稀釋)作為一抗，再加HRP標(biāo)記的兔抗豬二抗(1∶5 000稀釋)，顯色曝光。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以PCV2毒株(CAU0673)DNA為模板，P1、P2為引物，擴(kuò)增獲得1條約702 bp的目的片段，而陰性對(duì)照組無(wú)目的片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符合。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.PCV2-ORF2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30a-PCV2-ORF2經(jīng)PCR鑒定，獲得702 bp的部分ORF2基因目的片段，而陰性對(duì)照無(wú)目的條帶(圖2)；重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I、XhoI酶切鑒定，獲得702 bp的ORF2基因片段和5 422 bp的pET30a(+)載體片段(圖3)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1、2重組質(zhì)粒pET30a-PCV2-ORF2(BL21)PCR產(chǎn)物； 3、4.重組質(zhì)粒pET30a-ORF2(Trans109)PCR產(chǎn)物；5.陰性對(duì)照

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.pET30a-PCV2-ORF2重組質(zhì)粒；2～4. pET30a-PCV2-ORF2用BamH I和Xho I雙酶切產(chǎn)物

2.3 重組蛋白表達(dá)、Ni-NTA樹脂純化及復(fù)性結(jié)果

大腸埃希菌BL21(DE3)表達(dá)菌在IPTG終濃度為1 mmol/L、誘導(dǎo)溫度37 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間6 h的條件下，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為34 ku，與理論值相一致，同時(shí)發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要以包涵體形式存在(圖4)，Ni-NTA樹脂純化的目的蛋白主要集中于E2～E7積份，其中在E2-E5階段出現(xiàn)較集中的洗脫峰(圖5和圖6)。

2.4 重組蛋白的Western blot分析結(jié)果

PCV2-Cap重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用PCV2陽(yáng)性血清檢測(cè)重組蛋白的反應(yīng)原性。結(jié)果表明，在34 ku處出現(xiàn)特異性的顯色條帶，而pET30a空載體處無(wú)特異性條帶(圖7)。因此，PCV2-ORF2重組蛋白與PCV2陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。同時(shí)，復(fù)性后的純化重組蛋白不與PPV1、NA-PRRSV陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，這表明該重組蛋白具有很好的特異性(圖7)。

3 討論

豬圓環(huán)病毒2型作為嚴(yán)重影響國(guó)內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要病原之一，豬感染該病毒后，其免疫機(jī)能及生產(chǎn)機(jī)能降低，常常發(fā)生壞死性淋巴結(jié)炎、繁殖障礙、呼吸道綜合征和壞死性肺炎、豬皮炎腎病綜合征、增生性腸炎、滲出性表皮炎等多系統(tǒng)疾病[19]。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET30a空載體；2.pET30a-PCV2-ORF2(BL21)誘導(dǎo)前菌體；3.pET30a-PCV2-ORF2(BL21)誘導(dǎo)超聲破碎后沉淀；4.pET30a-PCV2-ORF2(BL21)誘導(dǎo)后菌體；5.pET30a-PCV2-ORF2(BL21)誘導(dǎo)、超聲破碎后上清液；6.純化后復(fù)性PCV2-Cap蛋白

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.E1液；2.E2液；3.E3液；4.E4液；5.E5液；6.E6液；7.E7液；8.E8液；9.E9液

圖6 各積分的蛋白濃度

由于透明帶作用的消失，病毒感染胚胎后，導(dǎo)致胚胎或胎兒死亡[20]。由ORF2編碼的Cap蛋白作為病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，常用于PCV2疫苗和診斷方法的研究。徐文娟等[21]采用細(xì)菌展示技術(shù)(APEx) 系統(tǒng)的篩選位于PCV2b-Cap蛋白上的抗原表位，為該蛋白的深入研究奠定了基礎(chǔ)。張璐等[22]對(duì)非核定位信號(hào)區(qū)的Cap蛋白進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)純化，并制備單克隆抗體，分析了該區(qū)域的抗原表位，為PCV2在胚胎孵育過程中，血清學(xué)診斷和抗原檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。目前，有學(xué)者采用桿狀病毒系統(tǒng)、枯草芽胞桿菌等對(duì)Cap蛋白進(jìn)行表達(dá)研究[23-24]。大腸埃希菌表達(dá)載體作為非常成熟的表達(dá)載體，其擁有生長(zhǎng)速度快、便于培養(yǎng)等特點(diǎn)，并且其中的pET30a載體可用于目的基因的大量誘導(dǎo)表達(dá)[25]。

1，2，6，8.PCV2-Cap重組蛋白；3，4，7.pET30a空載體；5.NA-PRRSV重組N蛋白； 9.PPV1-VP2重組蛋白

本試驗(yàn)通過擴(kuò)增PCV2-ORF2基因(長(zhǎng)度為702 bp)，構(gòu)建pET30a-PCV2-ORF2重組表達(dá)載體，BamH I、XhoI酶切鑒定呈陽(yáng)性。重組大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)在IPTG的誘導(dǎo)下，誘導(dǎo)表達(dá)出大小約為34 ku的重組Cap蛋白，研究發(fā)現(xiàn)目的蛋白以包涵體形式存在。通過Ni-NTA樹脂對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行純化，得到較高純度的目的重組蛋白，并對(duì)純化后蛋白進(jìn)行復(fù)性處理；研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)性后的重組蛋白純度高于復(fù)性前，由于蛋白復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，這可能是重組蛋白在恢復(fù)高級(jí)結(jié)構(gòu)的過程中，在蛋白疏水鍵的形成以及透析膜的濾過等作用下，對(duì)重組蛋白完成了一定程度的純化作用[26]。重組Cap蛋白與PCV2陽(yáng)性血清進(jìn)行Western blot反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明該重組蛋白具有很好的反應(yīng)原性，與NA-PRRSV、PPV1陽(yáng)性血清Western blot反應(yīng)呈陰性，表明不與NA-PRRSV、PPV1陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，該重組Cap蛋白可被用于豬圓環(huán)病毒2型的診斷方法或試劑盒的后續(xù)研究，為豬圓環(huán)病毒2型的防控和診斷奠定了基礎(chǔ)。

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Prokaryotic Expression of ORF2 Gene Fragment of Porcine Circovirus Type 2 and the Reactinogenicity Analysis of the Expressed Protein

OU Yun-wen1,2,MA Xiao-yuan2,WANG Jun2,DING Yao-zhong2,ZHANG Yong-guang2,ZHANG Jie2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu,730070,China;2StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou,Gansu,730046,China)

This experiment was aimed to study the antigenicity of Cap protein of porcine circovirus type 2(PCV2).The gene was amplified from the DNA of PCV2-CAU0673 strain by PCR,whose product was approximately 702 bp.The product was cloned into pET30a(+)vector,PCR,digestion and sequencing were used to identify positive plasmid.The positive recombined plasmid was expressed byE.coliBL21 (DE3) and was induced by IPTG.The recombinant protein was purified by Ni-NTA and refolding.The results of SDS-PAGE showed that the recombined protein was successfully expressed inE.coliBL21 (DE3) with a relative molecular weight of 34 ku.The results of Western blot showed that this recombined protein was specifically reacted with PCV2 positive serum;no cross reacted with NA-PRRSV and PPV1 positive serum.The recombinant vector pET30a-PCV2-ORF2 was successfully constructed,and the recombined Cap protein with excellent reactinogenicity was successfully expressed inE.coliwhich laid a foundation for the diagnosis of PCV2.

Porcine circovirus type 2；ORF2 gene；prokaryotic expression；reactinogenicity

2016-07-28

國(guó)家國(guó)際合作項(xiàng)目 (2012DFG31890)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31072143) 作者簡(jiǎn)介：歐云文(1990-)，男，重慶人，碩士，主要從事人獸共患病及公共衛(wèi)生學(xué)研究。

S852.659.2

A

1007-5038(2017)04-0001-06

*通訊作者