樊 磊，曾一笑，吳 菲，譚秋林，孫 東*

(1.中北大學電子測試技術(shù)重點實驗室，太原030051;2.儀器科學與動態(tài)測試教育部重點實驗室，太原030051)

基于微環(huán)形陣列電極的細胞分離富集芯片的設(shè)計與實驗研究*

樊 磊1，2，曾一笑1，2，吳 菲1，2，譚秋林1，2，孫 東1，2*

(1.中北大學電子測試技術(shù)重點實驗室，太原030051;2.儀器科學與動態(tài)測試教育部重點實驗室，太原030051)

根據(jù)介電泳操作原理，設(shè)計了微環(huán)形陣列電極結(jié)構(gòu)，建立了細胞分離富集芯片模型，采用COMSOL軟件分析微環(huán)形陣列電極的電場分布和介電泳力方向并確定了最大和最小電場強度的位置，利用ITO玻璃和PDMS制備了細胞分離富集芯片。通過酵母菌細胞的介電泳富集實驗和酵母菌細胞與聚苯乙烯小球的分離富集實驗，明確了酵母菌細胞的臨界頻率，實現(xiàn)了酵母菌細胞和聚苯乙烯小球的分離富集。結(jié)果顯示，在溶液電導(dǎo)率為60 μs/cm，交流信號電壓為8 Vp－p時，酵母菌細胞在1 kHz～45 kHz頻率范圍內(nèi)做負介電泳運動并富集在環(huán)形內(nèi)部，45 kHz為酵母菌細胞的臨界頻率，在45 kHz～10 MHz頻率范圍內(nèi)做正介電泳運動并富集在環(huán)形邊緣;1.5 MHz時聚苯乙烯小球做負介電泳運動并富集在環(huán)形內(nèi)部，富集倍數(shù)達到11.66。

生物芯片;細胞分離富集;介電泳;微環(huán)形電極;COMSOL

基于介電泳原理的微流控芯片作為一種新型微粒操作技術(shù)，其操作對象已從簡單的中性粒子擴展到細菌、病毒、細胞等生物粒子，具有非侵入、免標記樣本、快速、高效、樣本需求少等優(yōu)良特性，已可實現(xiàn)微粒的分離富集、排列、誘捕、定位以及生物特性的測試等［1－4］。在生物醫(yī)學工程中，微流控分離富集芯片常用于癌癥的早期診斷與治療［5］，相對正常細胞，癌細胞的濃度特別低，微流控富集芯片可以把癌細胞與正常細胞分離并富集，增大癌細胞的濃度后再進行下一步的檢測分析［6－8］。微電極結(jié)構(gòu)是決定芯片性能的關(guān)鍵，因此設(shè)計性能更好的新型微電極結(jié)構(gòu)越來越受到研究人員的關(guān)注。Becker等［9］設(shè)計了城堡式電極結(jié)構(gòu)，通過施加變頻交流信號，實現(xiàn)了血清中乳腺癌細胞的分離富集;Cheng等［10］利用5×5陣列電極結(jié)構(gòu)，在6 V、30 kHz的交流信號下實現(xiàn)了皮膚癌細胞與血細胞的分離富集;Li等［11］采用十字交叉的電極結(jié)構(gòu)，根據(jù)活死細胞所受的介電泳力不同，分離富集了活的和死的李斯特菌。但是以上電極結(jié)構(gòu)都不能在封閉的區(qū)域中實現(xiàn)目標細胞的分析測試。

本研究依據(jù)介電泳操作原理，以細胞分離富集為目的，設(shè)計并制備了一種基于4×4微環(huán)形陣列電極的細胞分離富集芯片。此芯片包含陣列式的封閉環(huán)形隔離區(qū)域，通過施加不同頻率、不同幅值的交流信號，將目標細胞富集在環(huán)形內(nèi)部，雜質(zhì)細胞富集在環(huán)形邊緣，使目標細胞與雜質(zhì)細胞隔離，增大目標細胞濃度、減小雜質(zhì)細胞影響后可實現(xiàn)封閉環(huán)形區(qū)域中目標細胞的分析測試，從而提高實驗數(shù)據(jù)的精確度。相比以上電極結(jié)構(gòu)，該環(huán)形陣列電極克服了三維電極和雙層電極制作工藝復(fù)雜的問題，制作工藝簡單;充分利用每個環(huán)形提供更強的電場進而產(chǎn)生更大的介電泳力，有利于目標細胞的富集;利用更接近實際細胞生存環(huán)境的高電導(dǎo)率溶液產(chǎn)生負介電泳效應(yīng)分離富集細胞，有利于細胞活性的保持;具有可擴展性，增加環(huán)形結(jié)構(gòu)的數(shù)量后可以得到更大的陣列，從而產(chǎn)生更多的封閉分析區(qū)域，有利于降低細胞測試時間。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

圖1是微流控芯片實驗測試平臺，包括:計算機、LabSmith微流體控制系統(tǒng)、AFG－3081函數(shù)信號發(fā)生器(臺灣GWIUSTEK公司)、CCD相機(德國Imaging Source公司)、電動變焦鏡頭(美國Navitar公司)、20X物鏡(日本Nikon公司)、濾光片組合(包括發(fā)射濾光片、激發(fā)濾光片、二向色鏡)(日本Nikon公司)、LED光源以及RollerBlock三軸位移調(diào)節(jié)臺(美國THORLABS公司)。

圖1 實驗測試平臺示意圖

實驗試劑包括:正光刻膠(RZJ304，蘇州瑞紅)、正膠顯影液(RZX－3038，蘇州瑞紅)、正膠剝離液(RBL－3368，蘇州瑞紅)、負光刻膠(SU－8 2050，MICRO CHEM)、SU－8顯影液(MICRO CHEM)、ITO刻蝕液(37.5%鹽酸、65%硝酸、水的體積比為50∶3∶50，北京富宇精細化工有限公司)、聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)、固化劑(Sylgard 184 Kit，Dow Corning)、吐溫－20 (Tween-20，Amresco)、磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液，HyClone)、細胞緩沖液(8%蔗糖，0.3%葡萄糖溶液)、安琪酵母菌(安琪酵母股份有限公司)、聚苯乙烯小球(天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心)、去離子水。

1.2 實驗過程

1.2.1 酵母菌細胞介電泳富集實驗步驟

進行實驗時，首先將少量酵母放入5 mL的去離子水中，并置于30℃的恒溫箱中培養(yǎng)3 h使酵母菌細胞復(fù)蘇;后離心，吸掉上清液，加適量去離子水，放入超聲清洗機震蕩使細胞均勻懸浮，重復(fù)3次后離心吸掉上清液，加入細胞緩沖液，用PBS緩沖液調(diào)節(jié)溶液電導(dǎo)率至60 μs/cm并超聲震蕩制得酵母菌細胞懸浮液，測得其濃度為 8×106/mL;使用LabSmith微流體控制系統(tǒng)將其注入芯片，對電極施加交流信號，通過CCD相機觀察并記錄酵母菌細胞的運動富集情況。

1.2.2 酵母菌細胞與聚苯乙烯小球分離富集實驗步驟

取50 μL聚苯乙烯小球溶液，用同樣的方法處理得到濃度為7.6×105/mL的小球懸浮液后，以10∶1的體積比混合酵母菌細胞懸浮液和小球懸浮液，使用PBS緩沖液調(diào)節(jié)其電導(dǎo)率為60 μs/cm，超聲震蕩后制得酵母菌細胞與聚苯乙烯小球的混合液。取適量使用LabSmith微流體控制系統(tǒng)將其注入芯片，對電極施加交流信號，通過CCD相機觀察并記錄兩種微粒的分離富集情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 介電泳操作原理

介電泳是指在空間非均勻電場中，懸浮在一定溶液中的微粒相對于溶液的誘導(dǎo)偶極距不同而產(chǎn)生的電遷移［12－14］。對于可以等效為球形的微粒，例如酵母菌、聚苯乙烯小球等，其所受介電泳力的表達式為［15－16］

式中:εm是溶液的介電常數(shù)，r是微粒的半徑，fCM是Clausius-Mossotti因子，Re［fCM］是其實部，是梯度算子。fCM的表達式為［15－16］

式中:ε*p和 ε*m分別是微粒和溶液的復(fù)雜介電常數(shù)，表達式分別為［15－16］

式中:σ是電導(dǎo)率，ω是所施加交流電場的頻率，εp與εm分別是微粒的介電常數(shù)。

當Re［fCM］＞0，即微粒比溶液容易極化時，微粒向高電場區(qū)域運動，稱為正介電泳;當Re［fCM］＜0，即溶液比微粒容易極化時，微粒向低電場區(qū)域運動，稱為負介電泳［17］。圖2是查閱酵母菌細胞相關(guān)參數(shù)［18］后利用MATLAB繪制的溶液電導(dǎo)率為60 μs/cm時酵母菌和聚苯乙烯小球的CM因子曲線，可以看出在1 kHz～10 MHz頻率范圍內(nèi)酵母菌的Re［fCM］異號會表現(xiàn)出負正介電泳行為，而聚苯乙烯小球的Re［fCM］總為負只表現(xiàn)出負介電泳行為。根據(jù)介電泳操作原理，細胞的介電泳效應(yīng)與細胞的半徑、細胞和溶液的介電常數(shù)、電導(dǎo)率和所施加交流信號的頻率有關(guān)［19］，而特定細胞的半徑、介電常數(shù)和電導(dǎo)率已經(jīng)確定，特定溶液的介電常數(shù)變化不大，所以只用調(diào)節(jié)溶液的電導(dǎo)率和施加的交流信號的頻率即可達到對酵母菌細胞和聚苯乙烯小球的分離富集。

圖2 酵母菌細胞和聚苯乙烯小球在電導(dǎo)率為60 μs/cm的溶液中的CM因子實部與頻率的關(guān)系

2.2 介電泳細胞分離富集芯片的設(shè)計與仿真

介電泳細胞分離富集芯片，如圖3(a)和圖3(b)，由玻璃基片、PDMS微通道和ITO微電極構(gòu)成。微通道是立方體上的凹槽，高80 μm，凹槽兩端的兩個通孔分別是溶液的入口和出口;如圖3(c)，ITO微電極包括一個4×4環(huán)形陣列電極和一個地電極，環(huán)形的內(nèi)徑是200 μm，外徑是300 μm，地電極的弧形直徑是400 μm。

圖4(a)是利用Solidworks對微環(huán)形電極和地電極建立的模型，立方體為溶液，查閱資料后設(shè)置它的相對介電常數(shù)為78，電導(dǎo)率為60 μs/cm。將其導(dǎo)入COMSOL對微環(huán)形電極和地電極分別施加電壓為8 Vp－p和－8 Vp－p，頻率為1.5 MHz的交流信號。電極上表面電場強度的仿真結(jié)果如圖4(b)，結(jié)果顯示環(huán)形邊緣的電場強度最大，環(huán)形中心的電場強度最小，且電場強度由環(huán)邊緣到地電極逐漸減小。

圖3 芯片和電極結(jié)構(gòu)原理圖

圖4 仿真模型和結(jié)果

介電泳力的仿真結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示負介電泳力指向環(huán)形中心，正介電泳力指向環(huán)形邊緣，所以可以預(yù)測細胞發(fā)生負介電泳時會匯聚在環(huán)形中心，發(fā)生正介電泳時匯聚在環(huán)形邊緣。

圖5 介電泳力仿真結(jié)果

2.3 介電泳細胞分離富集芯片的制備與測試

首先制備微環(huán)形陣列電極，在鍍有ITO薄膜的玻璃上勻涂一層厚約2 μm的正光刻膠，100℃前烘90 s后進行曝光、顯影、后烘，再利用45℃的ITO刻蝕液去除多余的金屬，得到微環(huán)形陣列電極;接著制備PDMS微通道，在洗凈吹干的硅片上勻涂一層厚約80 μm的負光刻膠，自65℃開始每隔5℃前烘3 min，溫度升至95℃時烘6 min后進行曝光、顯影、后烘得到陽模，將PDMS與固化劑按100∶1比例均勻混合并抽真空、靜置后澆鑄在陽模上，置于95℃環(huán)境中固化2 h，剝離得到PDMS微通道;最后將制成的PDMS微通道和微環(huán)形陣列電極放入真空度為26.6 Pa、射頻功率為30 W的環(huán)境中進行等離子處理，在顯微鏡下對準后置于70℃的恒溫箱中5 min進行鍵合，得到芯片主體。

利用MEMS工藝制作完成芯片主體后，連接LabSmith微流體控制系統(tǒng)向芯片注入去離子水測得芯片通水順暢、密封良好，滿足進一步實驗的要求;并向芯片內(nèi)注入吐溫－20溶液，處理PDMS微通道和電極表面后用去離子水沖洗干凈，以減小細胞的非特異性粘附。圖6是通過測試、通道處理、清洗并進行電氣連接后的介電泳細胞分離富集芯片及電極結(jié)構(gòu)的顯微圖。

圖6 制備的芯片及電極顯微圖

2.4 介電泳實驗

2.4.1 酵母菌細胞的介電泳富集實驗

使用LabSmith微流體控制系統(tǒng)向以上芯片注入適量60 μs/cm的酵母菌細胞懸浮液，對電極施加電壓為8 Vp－p，頻率從1 kHz遞增到10 MHz、步長為5 kHz的交流信號，觀察記錄酵母菌細胞的運動情況。

圖7是調(diào)節(jié)頻率為5 kHz時0 min、1 min和2 min后酵母菌細胞的分布情況，藍色箭頭表示酵母菌細胞的遷移方向。結(jié)合電場強度和介電泳力仿真結(jié)果可以看出，在頻率為5 kHz時，酵母菌做負介電泳運動，環(huán)形外部的酵母菌隨著時間的推移逐漸向電場強度最小的環(huán)形中心遷移。

圖7 頻率為5 kHz時，不同時間酵母菌細胞的分布

圖8(a)是頻率遞增到45 kHz時酵母菌細胞的分布情況，可以看出此時酵母菌細胞隨機分布，既有正介電泳運動，又有負介電泳運動，處于正負介電泳的交界處;繼續(xù)增大頻率，圖8(b)和圖8(c)分別是頻率增大到1.5 MHz時，經(jīng)過1 min和2 min后酵母菌細胞的分布情況，藍色箭頭表示酵母菌細胞的遷移方向。結(jié)合電場強度和介電泳力仿真結(jié)果可以看出，此時酵母菌細胞做正介電泳運動，環(huán)形內(nèi)部的酵母菌隨著時間的推移逐漸向電場強度最大的環(huán)形電極邊緣匯聚。

圖8 不同頻率，不同時間酵母菌細胞的分布

所以可得，該芯片能夠操作生物細胞到不同電場區(qū)域，頻率小于45 kHz時，酵母菌細胞做負介電泳運動;45 kHz處于正負介電泳的交界處，即為臨界頻率;大于45 kHz時，做正介電泳運動。

2.4.2 酵母菌細胞與聚苯乙烯小球的分離富集實驗

基于以上酵母菌細胞的介電泳富集實驗，利用配制的酵母菌與聚苯乙烯小球的混合液進行酵母菌細胞與小球的分離富集實驗。根據(jù)如圖2所示的曲線可以預(yù)測，溶液電導(dǎo)率為60 μs/cm，所加交流信號頻率在1 kHz～10 MHz范圍內(nèi)時，聚苯乙烯小球只做負介電泳運動，而酵母菌細胞在大于45 kHz時做正介電泳運動且在1.5 MHz時Re［fCM］達到最大值，結(jié)合電場強度和介電泳力仿真結(jié)果可知，當頻率為1.5 MHz時，聚苯乙烯小球會向電場強度最小的環(huán)形電極中心遷移，酵母菌細胞會向電場強度最大的環(huán)形電極邊緣富集，以此就可以達到分離富集聚苯乙烯小球和酵母菌細胞的目的。圖9是對電極施加電壓為8 Vp－p、頻率為1.5 MHz的交流信號后兩種微粒的分離富集情況，實驗結(jié)果與預(yù)測相一致，酵母菌細胞做正介電泳運動并富集在電場最強的環(huán)形電極邊緣處，聚苯乙烯小球做負介電泳運動并富集在電場最弱的環(huán)形電極內(nèi)部。

圖9 溶液電導(dǎo)率為60 μs/cm時酵母菌細胞和聚苯乙烯小球的分離富集

實驗過程中，個別酵母菌細胞和聚苯乙烯小球沒有遷移是因為酵母菌細胞壁和小球外表面具有黏附性，有可能附著在玻璃基底或者ITO電極上，當所受附著力與液體阻力的合力大于所受的介電泳力時，就不會發(fā)生定向遷移。

2.5 富集倍數(shù)的計算

此芯片使目標細胞富集至環(huán)形電極內(nèi)部增加目標細胞濃度后實現(xiàn)封閉區(qū)域中目標細胞的分析測試，因此定義富集倍數(shù)為施加交流信號后環(huán)形內(nèi)部聚苯乙烯小球占環(huán)形內(nèi)部微?？倲?shù)的百分比與施加交流信號前混合液中聚苯乙烯小球所占百分比的比值。未加電壓為8 Vp－p、頻率為1.5 MHz的交流信號時，聚苯乙烯小球與酵母菌細胞數(shù)目之比為0.94%;施加交流信號后環(huán)形內(nèi)部聚苯乙烯小球數(shù)目為8、酵母菌細胞數(shù)目為65，小球酵母菌之比為10.96%?？傻酶患稊?shù)為11.66。

3 結(jié)論

雖然基于介電泳的微流控技術(shù)已經(jīng)得到了很大發(fā)展，但是仍有進一步研究的必要，設(shè)計更有效的電極結(jié)構(gòu)則尤為重要。本研究表明，溶液電導(dǎo)率為60 μs/cm，所加交流信號電壓為 8 Vp－p，頻率小于45 kHz時，酵母菌細胞發(fā)生負介電泳運動并富集到環(huán)形電極內(nèi)部;頻率為45 kHz時，酵母菌細胞隨機分布，既有正介電泳運動，又有負介電泳運動，為酵母菌細胞正負介電泳的臨界狀態(tài);頻率大于45 kHz小于10 MHz時，酵母菌細胞發(fā)生正介電泳運動并富集到環(huán)形電極邊緣;1.5 MHz時聚苯乙烯小球發(fā)生負介電泳運動并富集到環(huán)形電極內(nèi)部。所設(shè)計的微環(huán)形陣列電極芯片實現(xiàn)了酵母菌細胞的正負介電泳行為，達到了分離富集酵母菌細胞和聚苯乙烯小球的目的，富集倍數(shù)達到11.66，由此證明了該介電泳芯片分離富集生物細胞的可行性。

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樊 磊(1990－)，男，山西運城人，中北大學儀器與電子學院，碩士研究生，研究方向為微納技術(shù)與儀器及生物微流控芯片，18734912353@163.com;

孫 東(1967－)，男，教授，中國香港人，博士研究生導(dǎo)師，研究方向為機器人及其自動化，微納生物傳感與控制，medsun@cityu.edu.hk。

Design and Experimental Study of Cells Isolation and Enrichment Chip-Based on Micro Annular Array Electrode*

FAN Lei1，2，ZENG Yixiao1，2，WU Fei1，2，TAN Qiulin1，2，SUN Dong1，2*
(1.National Key Laboratory for Electronic Measurement Technology，North University of China，Taiyuan 030051，China; 2.Key Laboratory of Instrumentation Science and Dynamic Measurement，Ministry of Education，North University of China，Taiyuan 030051，China)

According to the theory of dielectrophoresis，a kind of cells isolation and enrichment chip of micro annular array was designed and modeled.COMSOL software was used to discover the position of maximum and minimum strength of electric field via analysing the distribution of electric field and the direction of dielectrophoresis force.The chip was fabricated based on ITO glass and PDMS.The cross frequency of yeast cells was obtained after conducting a dielectrophoretic enrichment experiment of yeast cells.Isolation and enrichment of yeast cells and polystyrene particles were realized through carrying out an isolation and enrichment experiment with yeast cells and polystyrene particles.The results showed that yeast cells in solution conductivity of 60 μs/cm did negative DEP response and enriched in the ring inside under a voltage of 8 Vp－pand the frequency of 1 kHz to 45 kHz.The cross frequency of yeast cells was determined to be 45 kHz.Yeast cells did positive DEP response and enriched along the ring edge in the range of 45 kHz to 10 MHz.The polystyrene particles did negative DEP response and enriched in the ring inside under a frequency of 1.5 MHz.The multiple of enrichment reached about 11.66.

biological chip;cells isolation and enrichment;dielectrophoresis;micro annular electrode;COMSOL

TP212.3

A

1004－1699(2017)02－0218－06

C:2575

10.3969/j.issn.1004－1699.2017.02.009

項目來源:山西省百人計劃;西省基礎(chǔ)研究項目(2014011021－3)

2016－07－08 修改日期:2016－08－15