李凌凌,劉曜寧,呂早生,楊忠華,左振宇,宋采薇

(武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,湖北 武漢,430081)

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重組葡萄糖脫氫酶的表達(dá)及輔酶再生應(yīng)用研究

李凌凌,劉曜寧,呂早生,楊忠華,左振宇,宋采薇

(武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,湖北 武漢,430081)

為解決異源表達(dá)酮還原酶域EryKR1的重組大腸桿菌EscherichiacoliBL21(pET28a-eryKR1)催化環(huán)己酮還原時(shí)消耗的氫供體NADPH再生的問(wèn)題，構(gòu)建了克隆枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因gdh的重組菌E.coliBL21(pET28a-gdh)，其中的gdh基因經(jīng)Nucleotide BLAST功能分析顯示與枯草芽孢桿菌9902的gdh基因序列(登錄號(hào)為EF626962.1)的一致性達(dá)到100%。SDS-PAGE檢測(cè)顯示該重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可以高效表達(dá)出葡萄糖脫氫酶(GDH)，其表達(dá)量占全菌可溶性蛋白質(zhì)的64%。GDH粗酶液的比酶活為137.90 U/mg。通過(guò)氣相色譜檢測(cè)添加了E.coliBL21(pET28a-gdh)的E.coliBL21(pET28a-eryKR1)環(huán)己酮還原反應(yīng)體系中的環(huán)己醇含量，結(jié)果顯示加入重組GDH的雙重組菌耦合反應(yīng)體系中環(huán)己醇的產(chǎn)率為82.21%，是未添加GDH的反應(yīng)體系對(duì)應(yīng)值的3.23倍，表明重組GDH可以為EryKR1還原環(huán)己酮系統(tǒng)解決輔酶再生問(wèn)題。

葡萄糖脫氫酶；重組菌；異源表達(dá)；輔酶再生；生物催化；環(huán)己酮；枯草芽孢桿菌

利用氧化還原酶催化潛手性羰基化合物不對(duì)稱還原合成手性醇是生物技術(shù)中一個(gè)具有巨大發(fā)展前景的研究領(lǐng)域。但是，這個(gè)催化反應(yīng)需要大量?jī)r(jià)格昂貴且穩(wěn)定性低的輔酶協(xié)助才能進(jìn)行，從而極大地阻礙了氧化還原酶的大規(guī)模應(yīng)用，因此構(gòu)建低成本、高效的輔酶再生系統(tǒng)是解決問(wèn)題的關(guān)鍵[1]。解決輔酶再生的方法有化學(xué)法、電化學(xué)法、光化學(xué)法和酶法[2]，其中酶法更受青睞。酶法輔酶再生中負(fù)責(zé)將NAD(P)+轉(zhuǎn)化成NAD(P)H的酶有葡萄糖脫氫酶(GDH)和甲酸脫氫酶等。葡萄糖脫氫酶具有高穩(wěn)定性和強(qiáng)特異性，而且能夠以廉價(jià)的葡萄糖為底物進(jìn)行反應(yīng)，因此有著廣泛的應(yīng)用前景。目前，研究人員已經(jīng)在巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)菌、弱氧化醋酸桿菌、嗜酸熱原體等微生物中分離到了葡萄糖脫氫酶[3-6]，其中枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶的產(chǎn)量高，純化方便，已被廣泛應(yīng)用于輔酶的再生。酶法輔酶再生包括游離酶或固定化酶催化以及全細(xì)胞催化等方式[2]。游離酶或固定化酶催化具有可控性強(qiáng)、可連續(xù)操作且易于放大的特點(diǎn)，但其成本過(guò)高，酶的穩(wěn)定性和壽命也有限；而全細(xì)胞催化省去了復(fù)雜的分離和純化步驟，操作比較方便。

克隆了糖多孢紅霉菌聚酮合成酶模塊1中酮還原酶域基因的重組大腸桿菌EscherichiacoliBL21(pET28a-eryKR1)可以催化潛手性脂環(huán)酮的不對(duì)稱還原[7]，但此反應(yīng)需要消耗大量昂貴的輔酶NADPH。本研究旨在構(gòu)建重組表達(dá)枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌，通過(guò)基因工程手段實(shí)現(xiàn)葡萄糖脫氫酶的異源高效表達(dá)，并采用雙重組菌耦合的全細(xì)胞催化方法，解決酮還原酶域催化的還原反應(yīng)中的輔酶再生問(wèn)題(其中以環(huán)己酮替代潛手性脂環(huán)酮作為底物)，以期降低生產(chǎn)成本，提高市場(chǎng)價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis168)、大腸桿菌表達(dá)載體pET28a質(zhì)粒及重組菌E.coliBL21(pET28a-eryKR1)為本實(shí)驗(yàn)室保藏；大腸桿菌BL21(E.coliBL21(DE3))為本實(shí)驗(yàn)宿主菌，購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

LB培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[8]配制，用于培養(yǎng)大腸桿菌BL21和枯草芽孢桿菌。篩選抗性菌株時(shí)，加入終濃度為100 μg/mL的卡拉霉素。

1.1.2 主要試劑

Lysozyme、蛋白酶K、pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ、T4DNA連接酶、DNA Ladder Marker、Protein Marker、DNA Loading Buffer、微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及高純度質(zhì)粒小提試劑盒均為康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中登錄號(hào)為EF626962.1的枯草芽孢桿菌9902的葡萄糖脫氫酶基因序列設(shè)計(jì)合成引物。為了便于葡萄糖脫氫酶基因的克隆，在正向引物和反向引物前分別加上NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，并加上適量保護(hù)堿基，設(shè)計(jì)的引物如下：Gdh1X：5’-gccatatgTATCCGGATTTAAAAGGAAAAGTCGTCGC-3’(gc為保護(hù)性堿基，catatg為NdeⅠ酶切位點(diǎn))；Gdh2：5’-ggaattcTTAACCGCGGCCTGCCTGGAA-3’(g為保護(hù)性堿基，gaattc為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))。引物提交給武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系：CTAB法提取的枯草芽孢桿菌基因組DNA 2 μL，dNTP(each 2.5 mmol/L)2.5 μL，10×pfu DNA聚合酶緩沖液2.5 μL，DMSO 2.5 μL，引物Gdh1X(25 μmol/L)0.5 μL，引物Gdh2(25 μmol/L)0.5 μL，pfu DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，最后補(bǔ)無(wú)菌水至25 μL；PCR擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[7]。

1.2.2 枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的克隆

按照微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的說(shuō)明書回收純化PCR產(chǎn)物中的目標(biāo)片段、PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物。按照高純度質(zhì)粒小提試劑盒的說(shuō)明書提取質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及載體的雙酶切、連接方法和連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化方法按照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。重組質(zhì)粒由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 重組葡萄糖脫氫酶的誘導(dǎo)表達(dá)

按照5%的接種量將構(gòu)建的重組菌種子液接種到50 mL含100 μg/mL 卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 h左右加入IPTG(終濃度為1 mmol/L)，30 ℃、150 r/min誘導(dǎo)6 h。離心(4 ℃，12 000g，10 min)收集菌體沉淀，用0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)洗滌重懸后，超聲波破碎(400 W，工作3 s間歇5 s，10 min)。離心(4 ℃，12 000g，10 min)收集上清液(即粗酶液)，測(cè)定其酶活、蛋白質(zhì)含量并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

測(cè)定酶活的反應(yīng)體系(3 mL)：粗酶液20 μL、20 mmol/L NADP+300 μL、125 mmol/L葡萄糖2.4 mL和0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)280 μL。該體系置于37 ℃反應(yīng)30 min，期間在340 nm下測(cè)量NADPH的吸光值變化曲線，根據(jù)曲線斜率計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)的NADPH含量變化情況。酶活單位U定義為在本實(shí)驗(yàn)條件下，1 min催化還原1 μmol NADP+生成NADPH所需要的酶量。以上測(cè)定過(guò)程重復(fù)3次。采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品[8]；根據(jù)文獻(xiàn)[8]進(jìn)行SDS-PAGE分析；

1.2.4 雙重組菌耦合發(fā)酵檢測(cè)輔酶再生系統(tǒng)能力

雙重組菌耦合的發(fā)酵體系(20 mL)：0.4 gE.coliBL21(pET28a-eryKR1)，0.1 gE.coliBL21(pET28a-gdh)，2.5 mg/mL 葡萄糖、0.2 mmol/L NADPH、16.6 μmol/mL 環(huán)己酮和0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)。該體系置于30 ℃、100 r/min振蕩反應(yīng)6 h。反應(yīng)液離心(4 ℃，12 000g，10 min)收集上清液并用等體積乙酸乙酯萃取，按照文獻(xiàn)[7]的氣相色譜條件檢測(cè)有機(jī)相組分。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET-gdh表達(dá)載體的構(gòu)建

以提取的枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板、以Gdh1X和Gdh2的合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物的1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，在750 bp附近存在目的片段，這與目標(biāo)基因gdh的長(zhǎng)度786 bp基本一致。對(duì)質(zhì)粒pET28a和gdh基因的PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，回收后再進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，挑選出疑似陽(yáng)性克隆，從中提取出質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，如圖2所示。質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，將其中連接長(zhǎng)度約為750 bp的gdh基因片段切下來(lái)，證實(shí)了疑似陽(yáng)性克隆中提取出來(lái)的質(zhì)粒就是已克隆了枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的重組質(zhì)粒pET28a-gdh，命名為E.coliBL21(pET28a-gdh)。

對(duì)重組質(zhì)粒pET28a-gdh進(jìn)行基因測(cè)序，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的Nucleotide BLAST功能根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行搜索，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pET28a-gdh上克隆的基因片段與枯草芽孢桿菌9902的葡萄糖脫氫酶基因序列(登錄號(hào)為EF626962.1)之間的相似度和覆蓋程度均達(dá)到100%。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification products

圖2 疑似陽(yáng)性克隆的雙酶切鑒定產(chǎn)物電泳圖

Fig.2 Electrophoretogram of the suspected positive clone by double enzyme digestion

2.2 重組葡萄糖脫氫酶的表達(dá)

利用SDS-PAGE檢測(cè)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的重組菌(E.coliBL21(pET28a-gdh))中葡萄糖脫氫酶的表達(dá)情況，如圖3所示?？紤]到葡萄糖脫氫酶的分子大小約為28.8 kDa，加上表達(dá)蛋白中含有質(zhì)粒pET28a的His-tag標(biāo)簽，預(yù)計(jì)表達(dá)的重組葡萄糖脫氫酶的相對(duì)分子量約為33 kDa。實(shí)驗(yàn)選擇的陰性對(duì)照有：未經(jīng)過(guò)和經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的E.coliBL21(pET28a)以及未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的E.coliBL21(pET28a-gdh)。由圖3可知，同陰性對(duì)照相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的E.coliBL21(pET28a-gdh)檢測(cè)結(jié)果中，在相對(duì)分子量35.0 kDa附近有明顯的葡萄糖脫氫酶表達(dá)條帶，此點(diǎn)與目標(biāo)蛋白的相對(duì)分子量33 kDa一致，表明葡萄糖脫氫酶在重組菌中高效表達(dá)。根據(jù)BandScan 5.0軟件分析SDS-PAGE圖，可知葡萄糖脫氫酶(圖3中的孔道4)的表達(dá)量占重組菌總可溶性蛋白質(zhì)的64%。

圖3 重組葡萄糖脫氫酶的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

Fig.3 SDS-PAGE result of recombinant glucose dehydrogenase

將重組菌E.coliBL21(pET28a-gdh)的粗酶液在適當(dāng)體系(pH7.0)中37 ℃反應(yīng)30 min(以E.coliBL21(pET28a)作為陰性對(duì)照)，測(cè)定反應(yīng)體系在340 nm處的吸光值變化，獲得酶催化反應(yīng)的進(jìn)程曲線。根據(jù)曲線中0～2 min內(nèi)線性階段的斜率可得出吸光值的變化率ΔA=0.75 min-1，結(jié)合NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的公式(y=0.004 83x+0.004 53，R2=0.999 82，其中y為340 nm處的吸光值，x為NADPH濃度(μmol/L))，可計(jì)算出單位時(shí)間內(nèi)NADPH的濃度變化情況，從而得出粗酶液的酶活為23 291.95 U/L，而陰性對(duì)照的酶活僅為50.84 U/L。

采用Bradford法測(cè)定該重組菌E.coliBL21(pET28a-gdh)破胞上清液中的蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與吸光值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.005 79x-0.064，R2=0.997 01，y為595 nm處的吸光值，x為蛋白質(zhì)含量(μg/mL))，測(cè)得其中蛋白質(zhì)濃度為168.91 μg/mL，由此得出粗酶液的比酶活為137.90 U/mg，而陰性對(duì)照的蛋白質(zhì)濃度為63.90 μg/mL，比酶活只有0.80 U/mg。

目前，很多研究人員測(cè)定了在大腸桿菌中異源表達(dá)枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶的酶活特性。例如：周麗萍等[10]利用重組葡萄糖脫氫酶的初提液測(cè)定的比酶活為10 U/mg；徐軍等[11]通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件將重組酶的比酶活從10 U/mg提高到97 U/mg；Qiao等[12]構(gòu)建的重組葡萄糖脫氫酶的比酶活為7.8 U/mg；徐嫻等[13]通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間、溫度等條件得出重組葡萄糖脫氫酶的比酶活為9.65 U/mg；李鳴等[14]構(gòu)建的重組菌破碎細(xì)胞上清液葡萄糖脫氫酶比酶活為65.7 U/g。本課題組前期構(gòu)建了克隆枯草芽孢桿菌AB90008中葡萄糖脫氫酶基因的重組大腸桿菌，其中酶的第124位殘基上發(fā)生絲氨酸→半胱氨酸的突變，粗酶液的比酶活僅為18.4 U/mg[7]。為了獲得更適合環(huán)己酮還原體系輔酶再生應(yīng)用的酶活較高的重組菌，本研究重新選擇枯草芽孢桿菌168作為葡萄糖脫氫酶基因的供體菌，從上述檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，重組菌表達(dá)的葡萄糖脫氫酶的酶活和比酶活要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出其他報(bào)道及本課題組前期構(gòu)建的重組菌的相應(yīng)數(shù)據(jù)。

2.3 重組葡萄糖脫氫酶的輔酶再生性能

E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)中的酮還原酶域EryKR1以NADPH為氫供體還原環(huán)己酮，生成環(huán)己醇，在此過(guò)程中NADPH被氧化成NADP+。要想此反應(yīng)能夠循環(huán)反復(fù)，就必須往反應(yīng)體系中不斷添加還原型輔酶NADPH或是完成NADP+的再次還原(即還原性輔酶的再生)。重組菌E.coliBL21(pET28a-gdh)表達(dá)的葡萄糖脫氫酶能夠通過(guò)氧化葡萄糖將NADP+還原成NADPH。

為了檢測(cè)重組葡萄糖脫氫酶在環(huán)己酮還原反應(yīng)體系中的輔酶再生性能，將E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)和E.coliBL21(pET28a-gdh)雙重組菌耦合進(jìn)行環(huán)己酮的發(fā)酵，利用氣相色譜檢測(cè)發(fā)酵液中環(huán)己酮和環(huán)己醇的濃度(見(jiàn)圖4)，從而計(jì)算出相應(yīng)的環(huán)己醇產(chǎn)率(見(jiàn)表1)。

由表1可知，當(dāng)環(huán)己酮還原反應(yīng)系統(tǒng)中只加E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)和NADPH(第4組)時(shí)，環(huán)己醇產(chǎn)率很低，僅為5.22%；而當(dāng)體系中加入E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)、E.coliBL21(pET28a-gdh)、葡萄糖和NADPH(第1組)時(shí)，環(huán)己醇的產(chǎn)率高達(dá)82.21%。以E.coliBL21(pET28a)還原環(huán)己酮的反應(yīng)體系作為陰性對(duì)照，其中幾乎檢測(cè)不出環(huán)己醇的含量。由于大腸桿菌中生成的NADPH較少，還原再生NADPH的能力很弱，因此，對(duì)于第3組和第4組沒(méi)有添加GDH輔酶再生系統(tǒng)的環(huán)己酮還原體系，環(huán)己醇產(chǎn)率和環(huán)己酮轉(zhuǎn)化率均很低，表明靠一次性添加外源性的NADPH無(wú)法從根本上滿足環(huán)己酮還原反應(yīng)對(duì)氫供體的需求。通過(guò)第1組和第3組的對(duì)比可知，E.coliBL21(pET28a-gdh)的加入可使環(huán)己醇的產(chǎn)率提升2.23倍；第2組的數(shù)據(jù)表明，即使不添加外源性NADPH，利用大腸桿菌宿主菌中生成的少量NADPH，GDH也能完成輔酶再生循環(huán)，為環(huán)己酮還原反應(yīng)源源不斷地提供氫供體；對(duì)比第1組和第2組的數(shù)據(jù)可知，外源性NADPH的加入可以使環(huán)己醇的產(chǎn)率提升22.5%左右，因此在存在GDH輔酶再生系統(tǒng)的條件下，額外地添加NADPH可以使得輔酶再生循環(huán)的基數(shù)提高，導(dǎo)致氫供體的增長(zhǎng)速率加快，進(jìn)而提高環(huán)己醇的產(chǎn)率。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組菌E.coliBL21(pET28a-gdh)表達(dá)的葡萄糖脫氫酶可以解決E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)催化環(huán)己酮還原體系的輔酶再生問(wèn)題。

(a)第1組：E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)+E.coliBL21(pET28a-gdh)+葡萄糖+NADPH

(b)第2組：E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)+E.coliBL21(pET28a-gdh)+葡萄糖

(c)第3組：E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)+葡萄糖+NADPH

(d)第4組：E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)+ NADPH

圖4 環(huán)己酮發(fā)酵液的氣相色譜圖

Fig.4 Gas chromatography of cyclohexanone fermentation brothes

表1 重組葡萄糖脫氫酶在環(huán)己酮還原體系中的輔酶再生性能檢測(cè)結(jié)果

利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)葡萄糖脫氫酶的高效表達(dá)，并構(gòu)建葡萄糖脫氫酶與羰基還原酶耦聯(lián)的輔酶循環(huán)系統(tǒng)，可以解決生物催化潛手性羰基不對(duì)稱還原中的輔酶再生問(wèn)題。目前，這一輔酶再生方法已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到很多手性化合物的合成中。例如：一些研究人員構(gòu)建的葡萄糖脫氫酶與羰基還原酶耦聯(lián)的輔酶再生體系可以催化4-氯乙酰乙酸乙酯還原生成4-氯-3-羥基丁酸乙酯，其中產(chǎn)率最高可以達(dá)到99%[6,15-16]；Gao等[17]完成了枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶和氧化葡糖桿菌NADPH依賴的羰基還原酶在同一大腸桿菌中耦聯(lián)表達(dá)，這種一菌雙酶的輔酶再生系統(tǒng)可以在75 min內(nèi)還原14.3 g/L雙乙酰生成12.2 g/L (S)-3-羥基丁酮；Ema等[18]實(shí)現(xiàn)了釀酒酵母羰基還原酶和巨大芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶的共表達(dá)，合成了20種醇，其中(S)-2-羥基-4-辛酮的產(chǎn)率為71%；李鳴等[14]共表達(dá)了羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶，建立了雙酶耦聯(lián)反應(yīng)，其中產(chǎn)物(R)-4-甲氧基-1-苯乙醇的產(chǎn)率高達(dá)82%；宿宇寧等[19]將來(lái)源于枯草芽孢桿菌的羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶在大腸桿菌中共表達(dá)，對(duì)10 g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯進(jìn)行不對(duì)稱還原，轉(zhuǎn)化率大于99%；歐陽(yáng)健等[20]將羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶耦聯(lián)再生NADPH不對(duì)稱合成(S)-1-苯基-1,2-乙二醇，轉(zhuǎn)化率達(dá)到90.91%。本研究將構(gòu)建的異源表達(dá)葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌添加到克隆了酮還原酶域基因的重組菌的環(huán)己酮還原反應(yīng)體系中，環(huán)己醇產(chǎn)率可以達(dá)到82.21%。根據(jù)本課題組前期的研究成果，此雙重組菌耦聯(lián)體系可以還原潛手性脂環(huán)酮(如2-甲基環(huán)己酮、1,2-環(huán)己二酮等)[21-22]，說(shuō)明葡萄糖脫氫酶和羰基還原酶的耦聯(lián)除了可以應(yīng)用到4-氯-3-羥基丁酸乙酯等重要手性砌塊的合成中之外，還有望為工業(yè)生產(chǎn)藥物中間體——含環(huán)己基的手性醇解決輔酶再生問(wèn)題。

3 結(jié)論

(1)構(gòu)建了異源表達(dá)枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌，其中克隆的葡萄糖脫氫酶基因gdh經(jīng)Nucleotide BLAST功能分析顯示與枯草芽孢桿菌9902的gdh基因(登錄號(hào)為EF626962.1)的序列一致性達(dá)到100%。

(2)實(shí)現(xiàn)了重組型葡萄糖脫氫酶的高水平表達(dá)，表達(dá)量占全菌可溶性蛋白質(zhì)的64%，且粗酶液的比酶活達(dá)到137.90 U/mg。

(3)建立了異源表達(dá)葡萄糖脫氫酶和酮還原酶域的雙重組菌耦合還原環(huán)己酮的反應(yīng)體系，其中環(huán)己醇的產(chǎn)率高達(dá)82.21%。由此可解決環(huán)己酮還原反應(yīng)中的輔酶再生問(wèn)題，促進(jìn)酮還原酶域在潛手性脂環(huán)酮不對(duì)稱還原中的工業(yè)應(yīng)用。

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[責(zé)任編輯 尚 晶]

Expression of recombinant glucose dehydrogenase and its application to coenzyme regeneration

LiLingling,LiuYaoning,LvZaosheng,YangZhonghua,ZuoZhenyu,SongCaiwei

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430081, China)

To solve the regeneration of hydrogen donor NADPH for cyclohexanone reduction catalyzed by the recombinant strainEscherichiacoliBL21 (pET28a-eryKR1) heterologously expressing ketoreductase domain (EryKR1), the recombinant strainE.coliBL21 (pET28a-gdh) was constructed which cloned the glucose dehydrogenase(GDH) genegdhfromBacillussubtilis. BLAST analysis showed that nucleotide sequence of the genegdhin the recombinant strain had the consistency of 100% with that ofB.subtilisstrain 9902 (accession number EF626962.1). SDS-PAGE analysis revealed that GDH could be highly expressed in the recombinant strain induced by IPTG, which accounted for 64% of the total soluble protein. Specific activity of GDH crude enzyme was 137.90 U/mg. Recombinat strainE.coliBL21(pET28a-gdh) was added to the cyclohexanone reduction reaction catalyzed byE.coliBL21(pET28a-eryKR1). Gas chromatography analysis showed that the yield of cyclohexanol in the two-recombinant strain reaction system was 82.21% and 3.23 times that of the system withoutE.coliBL21(pET28a-gdh), which confirmed that recombinant GDH could solve the coenzyme regeneration problem for cyclohexanone reduction catalyzed by ketoreductase domain.

glucose dehydrogenase; recombinant strain; heterologous expression; coenzyme regeneration; biocatalysis; cyclohexanone;Bacillussubtilis

10.3969/j.issn.1674-3644.2017.02.014

2016-12-26

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21376184);武漢科技大學(xué)青年科技骨干培育計(jì)劃項(xiàng)目(2016XZ014);武漢科技大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金研究項(xiàng)目(16ZRA044).

李凌凌(1981-)，女，武漢科技大學(xué)副教授，博士. E-mail:moonletsmile@163.com

Q789；TQ925

A

1674-3644(2017)02-0155-06