胡容平，石軍，林立金，葉慧麗*，姚琳，周游

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610066;2.綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川綿陽(yáng)621023;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬研究所，四川成都611130)

四川獼猴桃軟腐病防治初步研究

胡容平1，石軍2，林立金3，葉慧麗1*，姚琳1，周游3

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610066;2.綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川綿陽(yáng)621023;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬研究所，四川成都611130)

本試驗(yàn)以木霉菌(Trichoderma spp.)為生防篩選材料，針對(duì)獼猴桃軟腐病(葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea)，通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)、難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的拮抗試驗(yàn)以及5種殺菌劑對(duì)病原菌的毒力測(cè)定，為獼猴桃軟腐病生物、化學(xué)防治提供參考的理論依據(jù)。結(jié)果表明，菌株T156-37對(duì)葡萄座腔菌的拮抗效果最好，抑制率達(dá)到66.11%。木霉菌株T163-8的難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)葡萄座腔菌的抑制作用最好，抑制率達(dá)到63.26%。25%咪鮮胺在室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)效果顯著，其次是30%苯醚甲環(huán)唑.丙環(huán)唑，EC50(μg/ mL)分別是0.3825和10.2351。

獼猴桃;軟腐病;木霉;生物防治;毒力測(cè)定

獼猴桃素有“維C之王”的美譽(yù)，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)［1］。四川生態(tài)條件適宜栽植獼猴桃，栽培面積已近4萬(wàn)hm2，是四川省具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水果之一，為提高農(nóng)民收入，增加社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益做出了巨大貢獻(xiàn)［3］。但隨著獼猴桃種植面積的擴(kuò)大和種植時(shí)間的延長(zhǎng)，病蟲(chóng)害問(wèn)題日益突出，特別是采后病害對(duì)獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展影響很大，其中獼猴桃軟腐病是貯藏期的重要病害［4－5］，采后發(fā)病率通常在10%左右，嚴(yán)重者可達(dá)20%以上，大大降低了獼猴桃的商品性，給獼猴桃生產(chǎn)造成了重大損失［6］。

1985年P(guān)ennycook在新西蘭于首次報(bào)道獼猴桃軟腐病以來(lái)［7］，其防治方法就一直受到重視，但大都采用傳統(tǒng)單一的化學(xué)防治方法，既污染環(huán)境，又增加農(nóng)殘，長(zhǎng)期使用還產(chǎn)生了抗藥性，難以達(dá)到理想防治效果［8－9］。隨著綠色植保理念的不斷深入，運(yùn)用生物防治手段控制植物病害已越來(lái)越受到世界各國(guó)的重視［10－11］。在植物真菌病害生物防治中，木霉(Trichoderma spp.)是一種重要的生防因子，具有廣闊的生防應(yīng)用前景。木霉在20世紀(jì)30年代就被確認(rèn)具有生防能力，并且在國(guó)內(nèi)外研究中，利用木霉防治植物病害特別是真菌引起的腐爛病害報(bào)道較多［12－14］。本研究結(jié)合篩選生防木霉菌與高效低毒化學(xué)藥劑的綜合防治方法，為獼猴桃軟腐病的有效防治提供參考。

表1 供試藥劑Table 1 Tested pesticides

1 材料與方法

1.1 供試材料

病原菌:葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)，獼猴桃產(chǎn)區(qū)采樣分離、鑒定所得。供試生防菌株:共20株木霉(Trichoderma spp.)，于產(chǎn)區(qū)采集獼猴桃植株根際土樣，分離純化所得，部分菌株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植病系提供。培養(yǎng)基:PDA(馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基)。供試藥劑見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木霉對(duì)葡萄座腔菌的對(duì)峙培養(yǎng)菌塊的制備:取分離獲得的葡萄座腔菌和木霉，分別接種于PDA平板培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，然后用直徑5 mm的已經(jīng)滅菌的打孔器在菌落邊緣打取菌塊備用。對(duì)峙培養(yǎng):在直徑9 cm的PDA平板培養(yǎng)基上，在相距3 cm處分別接入上述制備好的木霉菌塊和葡萄座腔菌塊，將兩菌株菌片同時(shí)接種到PDA平板上，以單獨(dú)接種各供試菌的菌塊為對(duì)照，置于培養(yǎng)箱中25℃黑暗培養(yǎng)3 d。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，定期觀察葡萄座腔菌的生長(zhǎng)情況，記錄生長(zhǎng)直徑［15］。

1.2.2 木霉難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)葡萄座腔菌的拮抗作用圓盤(pán)濾膜法測(cè)定:鋪無(wú)菌玻璃紙于PDA平板上，在玻璃紙中央接種直徑為5 mm的木霉菌塊，28℃恒溫培養(yǎng)。設(shè)置3個(gè)重復(fù)。待木霉菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)玻璃紙前，將玻璃紙移去。在平板中央接種已活化的葡萄座腔菌塊，28℃下恒溫培養(yǎng)。以不接木霉菌塊的PDA平板接種葡萄座腔菌作對(duì)照。培養(yǎng)到預(yù)定時(shí)間后，取出培養(yǎng)皿測(cè)量菌落直徑，每個(gè)菌落用十字交叉法測(cè)量直徑2次，取平均值。

1.2.3 5種殺菌劑對(duì)葡萄座腔菌的毒力測(cè)定采用殺菌劑室內(nèi)生長(zhǎng)速率法測(cè)定。將PDA培養(yǎng)基加熱融化，待其冷卻至40～45℃，添加鏈霉素(濃度1 %)3.3 mL/L后分別配置藥劑的母液，母液分別用定量無(wú)菌水稀釋成所需濃度，加入到冷卻的培養(yǎng)基中，制成含不同濃度藥劑的含藥培養(yǎng)基，充分搖勻后倒入培養(yǎng)皿(培養(yǎng)皿直徑為9 cm)。加入等體無(wú)菌水的PDA平板為對(duì)照。培養(yǎng)基凝固后，用打孔器(5 mm)制取已活化的菌餅，菌絲面朝下接種于含藥培養(yǎng)基中央，每種農(nóng)藥稀釋成5個(gè)濃度梯度，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)光照培養(yǎng)，5 d后十字交叉測(cè)量供試病菌在含不同藥劑的培養(yǎng)基上的菌落直徑，與對(duì)照比較計(jì)算各藥劑處理對(duì)菌落擴(kuò)展的生長(zhǎng)抑制率。

1.2.4 毒力方程的計(jì)算將藥劑對(duì)菌絲的抑制率轉(zhuǎn)換成機(jī)率值(Y)，藥劑各濃度(μg/mL)轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)值(X)，然后進(jìn)行線性回歸分析，求出毒力回歸方程Y=A+BX和相關(guān)系數(shù)，最后計(jì)算出各藥劑對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制中濃度(EC50)。分析比較不同殺菌劑對(duì)供試病菌菌絲生長(zhǎng)速率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉對(duì)葡萄座腔菌的抑制作用

從表2可看出，供試的20株木霉對(duì)葡萄座腔菌菌絲生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，此批菌株抑制率50 %以上的占90%，其中菌株T156-37的抑制率極顯著大于其他菌株，達(dá)到66.11%，抑制效果最差的是菌株T143-12，其抑制率為44.56%。

2.2 木霉難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)葡萄座腔菌的抑制作用

從表3可看出，供試的20株木霉產(chǎn)生的難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)葡萄座腔菌菌絲生長(zhǎng)均有一定抑制作用。抑制率50%以上的菌株占35%，其中木霉菌株T163-8抑制率極顯著高于其它菌株，達(dá)到63.82 %，菌株T7-17抑制效果最差，抑制率只有28.75%。比較對(duì)峙培養(yǎng)，代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制效果不盡相同，存在明顯差異。

在簡(jiǎn)東亮的眼里，李若什么都好，長(zhǎng)得漂亮，性格開(kāi)朗，工作也很努力上進(jìn)。只是有一點(diǎn)讓簡(jiǎn)東亮不理解，那就是李若對(duì)鞋子有著狂熱的嗜好，她可以忍餓挨凍，但鞋子不能不買(mǎi)。

表2 木霉對(duì)葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的抑制率Table 2 Inhibition rate of Trichoderma on Botryosphaeria dothidea

表3 木霉難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的抑制率Table 3 Inhibition rate of Trichoderma difficult volatilemetabolites on Botryosphaeria dothidea

續(xù)表2 Continued table 2

表4 5種殺菌劑對(duì)葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的毒力測(cè)定Table 4 Virulence of tested 5 kinds of fungicides to pathogen of Botryosphaeria dothidea

2.3 種殺菌劑對(duì)葡萄座腔菌的毒力測(cè)定

供試藥劑對(duì)葡萄座腔菌菌絲生長(zhǎng)均具有不同程度的抑制作用。藥劑EC50的大小是衡量藥劑毒力大小的指標(biāo)，藥劑EC50越小說(shuō)明該藥劑的毒力越強(qiáng)。對(duì)葡萄座腔菌殺菌能力最強(qiáng)的是25%咪鮮胺EC，其EC50為0.3825μg/mL，其次是30%苯醚甲環(huán)唑.丙環(huán)唑EC，EC50為10.2351μg/mL，42.4%唑醚.氟酰胺SC的殺菌效果最差，75%百菌清WP和12.5%烯唑醇WP殺菌效果一般。

3 結(jié)論與討論

3.1 木霉對(duì)葡萄座腔菌的拮抗作用

通過(guò)木霉與葡萄座腔菌對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明菌株T156-37對(duì)葡萄座腔菌的抑制效果最好，抑制率達(dá)到66.11%。此批試驗(yàn)菌株系經(jīng)過(guò)初篩后的菌株，均有一定的抑制效果，但不同木霉菌株對(duì)同一葡萄座腔菌株生防效果也存在顯著性差異，一定程度上可以說(shuō)明木霉菌寄生專(zhuān)化性。因此，在木霉菌的生物防治應(yīng)用中，須針對(duì)不同的病原菌采用不同的木霉菌株。相關(guān)研究報(bào)道［16］，木霉的存在多種拮抗機(jī)制，并且?guī)追N作用方式或是協(xié)同或是單一，但就哪種作用方式占主導(dǎo)地位，還需通過(guò)后續(xù)試驗(yàn)研究論證，以找到準(zhǔn)確的抗性機(jī)制，為研制有效木霉菌生防菌提供依據(jù)。

3.2 木霉難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)葡萄座腔菌的抑制作用

木霉在生命活動(dòng)中能夠產(chǎn)生抗真菌的代謝產(chǎn)物。木霉菌株T163-8的代謝產(chǎn)物對(duì)葡萄座腔菌的抑制作用最好，抑制率達(dá)到63.26%。不同木霉菌株間的防治效果有顯著性差異，可能是由于不同木霉菌株的代謝產(chǎn)物含量、成分存在差異，或者由于木霉菌存在不同的生理小種而產(chǎn)生不同作用性質(zhì)的代謝物，從而引起抑制效果呈顯著性差異。此次試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)有些木霉菌株及其難揮發(fā)性代謝物對(duì)葡萄座腔菌的抑制效果都比較好，而有些菌株與其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物抑制效果呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明生防菌株及其代謝產(chǎn)生之間的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。

3.3 殺菌劑對(duì)葡萄座腔菌的毒力測(cè)定

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(責(zé)任編輯 陳虹)

Prelim inary Study on Control Efficiency against Soft Rot Disease of K iw ifruit in Sichuan

HU Rong-ping1，SHI Jun2，LIN Li-jin3，YE Hui-li1*，YAO Lin1，ZHOU You3
(1.Institute of Plant Protection，Sichuan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southwest，Ministry of Agriculture，Sichuan Chengdu 610066，China;2.Mianyang Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Mianyang 621023，China;3.Institute of Pomology and Olericulture，Sichuan Agricultural University，Sichuan Chengdu 611130，China)

Trichoderma spp.，as the biocontrol selectionmaterial，wasused to focuson the biocontrol of kiwifruit soft rot(Botryosphaeria dothidea)in thisexperiment，the confrontation culture of T.spp.and itsantagonistic testson non-volatilemetaboliteswere conducted，and the virulence of five kinds of fungicides to pathogen were determined to provide a reference for the biochemical and chemical control of kiwifruit soft rot.The results showed that the strain T156-37 had the best antagonistic effects on B.dothidea，and the inhibition rate reached 66.11 %.The inhibition rate of non-volatilemetabolites in Trichoderma strain T163-8 was63.26%.The 25%prochloraz in the indoor test resultswere significant，followed by the30%difenoconazoleyl.propiconazole，which EC50(μg/mL)were0.3825 and 10.2351，respectively.

Kiwifruit;Soft rot disease;Trichoderma spp.;Biocontrol control;Toxicity assay

S436.634

A

1001－4829(2017)2－0366－05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.2.021

2016－01－30

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目“獼猴桃軟腐病菌遺傳多樣性及致病力、抗性評(píng)價(jià)體系研究”(2013JY0115);四川省科技支撐項(xiàng)目“利用熒光定量PCR技術(shù)建立獼猴桃軟腐病檢測(cè)預(yù)測(cè)體系”(2015NZ0036);四川省創(chuàng)新能力提升工程項(xiàng)目“四川獼猴桃儲(chǔ)藏期病害主要種類(lèi)、發(fā)生特點(diǎn)及防治技術(shù)研究”(2014CXSF-018)

胡容平(1980－)，男，四川營(yíng)山人，碩士，助理研究員，主要從事植物病害的研究，*為通訊作者，E-mail:44573780 @qq.com。