于常江，祁成年，張?jiān)粕?，沈敏，楊華，楊永林

(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

綿羊eIF3h基因克隆、原核表達(dá)及蛋白鑒定

于常江1，2，祁成年1，張?jiān)粕?，沈敏2，楊華2，楊永林2

(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

【目的】克隆綿羊真核翻譯起始因子eIF3h，構(gòu)建原核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)，檢測(cè)、鑒定帶有His標(biāo)簽的目的蛋白?！痉椒ā扛鶕?jù)Genbank中綿羊eIF3h基因CDS序列設(shè)計(jì)引物，PCR特異擴(kuò)增DNA片段，酶切、連接至pET28α(+)載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)株中誘導(dǎo)eIF3h蛋白表達(dá)。采用SDS-PAGE電泳分析目的蛋白表達(dá)情況，利用Western blot技術(shù)檢測(cè)、鑒定目的蛋白?！窘Y(jié)果】正確、完整的克隆到綿羊eIF3h基因CDS區(qū)序列，片段全長(zhǎng)1 059 bp。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)株后，在37℃，1 mmol/L濃度的IPTG誘導(dǎo)3.5 h后獲得以包涵體形式存在的目的蛋白，分子量大小約為40 kD。【結(jié)論】獲得了完整、正解的綿羊eIF3h基因CDS區(qū)序列片段，構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體，成功誘導(dǎo)了綿羊eIF3h基因外源表達(dá)的目的蛋白，為綿羊eIF3h基因的后續(xù)研究提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

綿羊；eIF3h基因；基因克??；載體構(gòu)建；原核表達(dá)

0 引 言

【研究意義】羊毛品質(zhì)是影響綿羊經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要因素之一，研究和闡明羊毛生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制將為羊毛細(xì)度、長(zhǎng)度、密度等性狀的提升起到重要作用，有利于增強(qiáng)新疆未來(lái)細(xì)羊毛的競(jìng)爭(zhēng)力和市場(chǎng)價(jià)格。在生物體生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制中，真核翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factor)參與了眾多蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程，是一類能夠確保形成正確的mRNA-核糖體復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成，維持細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)[1]。eIF3h基因(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit h)作為eIF3家族重要的亞基之一[2-3]，分子量為40 kD，故也稱為eIF3p40或eIF3S3，人類定位于染色體8q23上[4]，而綿羊定位在染色體9號(hào)上，其主要作用是參與蛋白質(zhì)翻譯及對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控，從而影響蛋白質(zhì)合成和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)。了解該基因在羊毛成長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用，改良綿羊經(jīng)濟(jì)性狀，更好的對(duì)繁殖育種工作產(chǎn)生積極的影響?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】實(shí)驗(yàn)室前期工作中發(fā)現(xiàn)該基因在粗細(xì)毛羊種間存在較高表達(dá)差異。同時(shí)有研究表明，eIF3h基因在人類多種惡性腫瘤中存在高表達(dá)現(xiàn)象[5-7]，反映其與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，繼而推測(cè)其可能參與羊毛生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)過(guò)程?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為揭示eIF3h基因在粗、細(xì)毛羊的對(duì)羊毛生長(zhǎng)發(fā)育的影響，明確其調(diào)控機(jī)制和功能，了解綿羊eIF3h基因的表達(dá)序列信息和體外蛋白表達(dá)情況就顯得尤為重要。實(shí)驗(yàn)主要對(duì)目的基因CDS區(qū)片段進(jìn)行克隆，并構(gòu)建其表達(dá)載體，使目的蛋白得到準(zhǔn)確表達(dá)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】試驗(yàn)完整克隆eIF3h基因CDS序列片斷，再在原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，驗(yàn)證序列的正確性，為綿羊eIF3h基因的功能研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用菌株(BL21、DH5α)、原核表達(dá)載體pET28α(+)為實(shí)驗(yàn)室保存，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為美利奴細(xì)毛羊(軍墾型)。

1.1.2 主要試劑

RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen。PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自東洋紡績(jī)株式會(huì)社。15～150 kDa雙色預(yù)染蛋白Marker，卡那抗生素，一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒及eIF3h抗體購(gòu)自上海生工公司生物技術(shù)公司。質(zhì)粒純化抽提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Bio-tek。其它常用試劑為實(shí)驗(yàn)室自備。

1.2 方 法

1.2.1 綿羊成纖維細(xì)胞總RNA的提取及eIF3h基因克隆

用Trizol法從正常的原代綿羊成纖維細(xì)胞中提取總RNA，核酸蛋白分析儀檢測(cè)其濃度及純度，0.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)總RNA完整性。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)合成為cDNA，用以作為克隆綿羊eIF3h基因的模板，稀釋并保存于-20℃。(具體操作步驟參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū))

查找Genbank中預(yù)測(cè)的綿羊eIF3h基因(101115801)的參考序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，分別插入酶切位點(diǎn)(EcoRI、HindIII)：

上游引物F：5’-3’CCGGAATTCATGGCGTCCCGCAAGGAAG；

下游引物R：5’-3’CCCAAGCTTTTAGCTGTTGTATTCTTGAAGAGCC。

PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：ddH2O 17.25 μL、Buffer 2.5 μL、MgSO41 μL、dNTP 2.5 μL、上游引物(F)0.375 μL、下游引物(R)0.375 μL、KOD-Plus聚合酶0.5 μL、模板cDNA 0.5 μL。反應(yīng)程序(35 cycles)：95℃、3 min，95℃、30s，60℃、30s，72℃、75s，72℃、10 min，4℃、30 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并使用Omega膠回收試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行回收，再將回收產(chǎn)物經(jīng)過(guò)核酸蛋白分析儀檢測(cè)，以確定其濃度。

1.2.2eIF3h- pET28α(+)原核表達(dá)載體的構(gòu)建

取純化確定濃度后的pET28α(+)載體及PCR回收產(chǎn)物，分別進(jìn)行EcoRI、HindIII雙酶切，體系參照New Englang BioLabs試劑盒說(shuō)明書(shū)調(diào)整：Cutsmart Buffer 2.5 μL、EcoRI限制性內(nèi)切酶 0.5 μL、HindIII限制性內(nèi)切酶 0.5 μL、ddH2O 18.5 μL、pET28α(+) 3 μL；Cutsmart Buffer 2.5 μL、EcoRI限制性內(nèi)切酶 0.5 μL、HindIII限制性內(nèi)切酶 0.5 μL、ddH2O 17 μL、膠回收產(chǎn)物 4.5 μL。將酶切產(chǎn)物再進(jìn)行瓊脂糖回收純化，并用核酸蛋白分析儀檢測(cè)濃度，-20℃保存。

根據(jù)測(cè)得酶切產(chǎn)物計(jì)算目的片段與載體連接比例，選擇合適連接體系，用T4DNA連接酶將酶切過(guò)后的目的片段與載體連接，總體系10 μL，具體體系為：Buffer 1 μL、eIF3h酶切產(chǎn)物4 μL、pET28α(+)載體酶切產(chǎn)物 4.5 μL、T4DNA連接酶 0.5 μL，16℃連接12 h。將上述連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42℃水浴90s，冰浴5 min，加入1 mL無(wú)抗性LB液體培養(yǎng)基，輕柔混勻后37℃搖床培養(yǎng)1 h。取培養(yǎng)1 h的轉(zhuǎn)化混合物100 μL均勻涂布于含卡那抗性的固體培養(yǎng)基平板中，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

挑取一定數(shù)量涂布后平板上的單克隆菌落，劃線于含卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基平板中，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h。蘸取一定量菌體，以菌體為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，初步檢測(cè)是否為構(gòu)建的表達(dá)載體。篩選條帶大小正確的菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，再進(jìn)行EcoRI、HindIII酶切鑒定以及送樣至生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.2.3eIE3h重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒eIF3h-pET28α(+)轉(zhuǎn)入至E.coliBL21感受態(tài)中，具體篩選步驟同上。將BL21(eIF3h-pET28α(+))單克隆菌落接種于含抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h。用移液器吸取部分培養(yǎng)物，按照1∶100的比例重新接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌液OD值約為0.6時(shí)，加入IPTG(終濃度分別為0.2 mmol/L、 0.5 mmol/L、0.8 mmol/L)，誘導(dǎo)3.5 h。收集不同終濃度下IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4eIE3h重組蛋白的免疫反應(yīng)性分析

重組陽(yáng)性菌BL21(eIF3h-pET28α(+))、pET28α(+)、BL21裂解物經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜(冰浴條件下300 mA恒流1 h)，于37℃用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h；封閉后以4℃孵育一抗(1∶1 000稀釋，兔抗)過(guò)夜，37℃孵育二抗(1∶5 000稀釋，HPR標(biāo)記抗小鼠IgG)2 h，期間每孵育完一次抗體后用TBST洗膜3次，每次10 min。配合使用相應(yīng)ECL化學(xué)發(fā)光劑，曝光，顯影，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊成纖維細(xì)胞總RNA提取及eIF3h基因的擴(kuò)增

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的綿羊成纖維細(xì)胞提取總RNA，并反轉(zhuǎn)成cDNA，使用引物特異性擴(kuò)增eIF3h基因CDS區(qū)，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段大小約為1 059 bp，與預(yù)期片段大小一致。圖1

M：100 bp DNA Ladder；1-2：eIF3l基因PCR產(chǎn)物；3陰性對(duì)照

M: 100 bp DNA Ladder; 1-2: PCR products ofeIF3hgene, 3: Negative control

圖1eIF3h基因PCR產(chǎn)物電泳圖
Fig.1 The agarose gel electrophoresis ofeIF3hgene

2.2eIF3h基因的生物信息學(xué)

綿羊eIF3h基因(101115801)有8個(gè)外顯子，位于綿羊9號(hào)染色體上。兩個(gè)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄本(XM_004011773.3和XM_012144735.2)，mRNA大小分別是1 226 bp和1 229 bp，相差3個(gè)堿基5’-TGA-3’，二者CDS區(qū)序列長(zhǎng)度均為1 059 bp，共編碼352個(gè)相同氨基酸，不同在于CDS區(qū)中5’-3’中第1 011個(gè)堿基分別為T(mén)和C，起始密碼子ATG，終止密碼子TAA，預(yù)測(cè)其分子式為C1754H2778N488O543S16；蛋白分子量為40 kD，等電點(diǎn)為6.19，在溶液中不穩(wěn)定指數(shù)為45.54，高于40的域值，且在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)定，脂肪系數(shù)為79.20，總平均親水指數(shù)為-0.561；對(duì)該基因信號(hào)肽、疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)(TMHMM Server v.2.0)，疏水性最大值為3.22，最小值為-3.83；抗原位點(diǎn)具有15個(gè)，推測(cè)具有較好的免疫原性。

2.3eIE3h-pET28α(+)原核重組表達(dá)載體的構(gòu)建

用EcoRI、HindIII分別雙酶切純化后的PCR產(chǎn)物片段及pET28α(+)質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后，再通過(guò)連接、轉(zhuǎn)化，篩選重組子，使eIF3h基因CDS區(qū)段連接入pET28α(+)載體，并將重組載體命名為eIE3h-pET28α(+)，繪出結(jié)構(gòu)示意。圖2

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒eIE3h-pET28α(+)
Fig.2 Construction of theeIE3h-pET28α(+)expressed plasmid

注：M為marker；1～2為eIE3h- pET28α(+) 載體雙酶切；3為eIE3h-pET28α(+)；4為陰性對(duì)照

Note：M，marker；1-2：Digestion products ofeIE3h- pET28α(+) expression vector；3，eIE3h- pET28α(+) expression vector；4，Negative control

圖3eIE3h-pET28α(+)質(zhì)粒酶切
Fig.3 Digestion results ofeIE3h-pET28α(+) expression vector

將重組質(zhì)粒用EcoRI、HindIII進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，得到大小約1 000～1 500 bp范圍內(nèi)的片段。測(cè)序結(jié)果說(shuō)明，重組質(zhì)粒中插入的片段與Genbank中基因序列完全相同，原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。圖3，圖4

2.4 eIF3h重組蛋白表達(dá)形式的鑒定

篩選、鑒定出轉(zhuǎn)化至E.coliBL21的陽(yáng)性菌株，接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中。37℃過(guò)夜培養(yǎng)，以1∶100的稀釋比例，將培養(yǎng)物重新接種于新培養(yǎng)基，培養(yǎng)物OD值達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)3.5 h。分別收集誘導(dǎo)培養(yǎng)物的上清和沉淀， SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析：外源誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白以包涵體形式存在于沉淀(圖5、圖6分別表示誘導(dǎo)的重組蛋白可溶及不溶部分)，上清未檢測(cè)到重組表達(dá)的目的蛋白；在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白量隨IPTG濃度的增加而增加，與此同時(shí)蛋白量也隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增多。圖5，圖6

圖4eIE3h基因序列部分測(cè)序圖譜
Fig.4 The sequencing map ofeIE3h

2.5eIE3h重組蛋白的鑒定

誘導(dǎo)后的大腸桿菌裂解后，對(duì)該沉淀包涵體蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，查看所表達(dá)的蛋白是否為目的蛋白。結(jié)果顯示：在37℃條件下，經(jīng)0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3.5 h后收集的蛋白產(chǎn)物與抗體發(fā)生較明顯的免疫反應(yīng)，條帶大小約為40 kD(蛋白Marker未顯示)，表明目的蛋白得到表達(dá)，該基因原核表達(dá)成功。圖7

M：蛋白marker；1：BL21未誘導(dǎo)；2：BL21誘導(dǎo)；3：BL21(pET28α(+))未誘導(dǎo)；4：BL21(pET28α(+))誘導(dǎo)；5：BL21(載體eIF3h-pET28α(+))未誘導(dǎo)；6：BL21(載體eIF3h-pET28α(+))誘導(dǎo)

M: Protein marker; 1, 3, 5：Without IPTG induction; 2, 4, 6:Induction with 0.8 mmol/L IPTG for BL21, BL21(pET28α(+)), BL21(eIF3h-pET28α(+)), respectively

圖5 可溶性蛋白

Fig.5 Soluble proteins

M：蛋白marker；1：BL21未誘導(dǎo)；2：BL21誘導(dǎo)；3：BL21(pET28α(+))未誘導(dǎo)；4：BL21(pET28α(+))誘導(dǎo)；5：BL21(載體eIF3h-pET28α(+))未誘導(dǎo)；6：BL21(載體eIF3h-pET28α(+))誘導(dǎo)

M: Protein marker; 1, 3, 5:Without IPTG induction; 2, 4, 6:Induction with 0.8 mmol/L IPTG for BL21, BL21(pET28α(+)), BL21(eIF3h-pET28α(+)), respectively

圖6 不可溶性蛋白

Fig.6 Inclusion body proteins

1： BL21未誘導(dǎo)；2：BL21誘導(dǎo)；3：BL21(pET28α(+))未誘導(dǎo)；4：BL21(pET28α(+))誘導(dǎo)；5：BL21(載體eIF3h-pET28α(+))未誘導(dǎo)；6-8：BL21(載體eIF3h-pET28α(+))誘導(dǎo)

M: Protein marker; 1, 3, 5:Without IPTG induction; 2, 4, 6, 7, 8: Induction with 0.8 mmol/L IPTG for BL21, BL21(pET28α(+)), BL21(eIF3h-pET28α(+)), respectively

圖7eIE3h蛋白原核表達(dá)Western blot檢測(cè)
Fig.7 Western blot detect theeIE3hproteins inE.coliBL21

3 討 論

在研究生物體生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，真核翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factors，eIFs)是一類在真核細(xì)胞中扮演著重要作用角色的蛋白質(zhì)，參與了眾多細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育活動(dòng)。eIF3是該家族成員中被廣泛研究的一類因子，在哺乳動(dòng)物中其分子量約為600 kDa，由13個(gè)亞基組成其復(fù)合物，依據(jù)分子量遞減命名為eIF3a至eIF3m，分別發(fā)揮著不同的作用，eIF3h作為eIF3家族重要的亞基之一，對(duì)其作用及功能的研究也逐漸深入起來(lái)。eIF3h在正常細(xì)胞中其活性不高，主要作用是在蛋白質(zhì)翻譯起始過(guò)程中參與蛋白質(zhì)翻譯和對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。有研究表明，隨著eIF3h活性的增高，蛋白質(zhì)的合成能力也會(huì)增加，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[8]。

通常在原核表達(dá)過(guò)程中，常選用克隆載體進(jìn)行目的片段獲取，實(shí)驗(yàn)在目的片段擴(kuò)增初期直接引入酶切位點(diǎn)，未通過(guò)克隆載體pMD18-T直接將其連接至原核表達(dá)載體pET28α(+)中，獲得了較高純度的綿羊eIF3h基因片段，并將原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入至大腸桿菌中，得到了大量以包涵體形式存在的目的蛋白，縮短了質(zhì)粒構(gòu)建周期。

在蛋白表達(dá)時(shí)，外源基因，載體及宿主三者之間的關(guān)系會(huì)影響表達(dá)的正常進(jìn)行；同樣，外部條件的差異也是影響表達(dá)效率的高低的因素之一[9]，諸如誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度、表達(dá)時(shí)間也能決定表達(dá)效率。實(shí)驗(yàn)前期對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、菌液濃度、IPTG濃度等條件作了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)溫度為37℃，菌液OD值為0.6時(shí)加入IPTG，使其終濃度為0.8 mmol/L，經(jīng)過(guò)3.5 h的誘導(dǎo)即可表達(dá)出大量蛋白。通過(guò)對(duì)重組蛋白的分析，該蛋白主要以包涵體形式存在，以包涵體形式存在的蛋白可以免受蛋白水解酶的影響，可以通過(guò)離心即可收集。實(shí)驗(yàn)中獲得的包涵體蛋白只需經(jīng)過(guò)變、復(fù)性處理變?yōu)榭扇苄缘鞍住?/p>

4 結(jié) 論

從綿羊成纖維細(xì)胞中克隆得到的eIF3h基因片段，經(jīng)測(cè)序比對(duì)與GenBank上預(yù)測(cè)的基因序列(XM_004011773.3)相同，并將該基因片段完整定向的插入在原核表達(dá)載體pET28α(+)中，構(gòu)建的eIE3h-pET28α(+)表達(dá)載體在大腸桿菌中大量表達(dá)，蛋白免疫反應(yīng)檢測(cè)，eIF3h蛋白可被特異性識(shí)別，獲得的產(chǎn)物為目的基因表達(dá)產(chǎn)物，原核表達(dá)成功。通過(guò)對(duì)綿羊eIF3h基因的原核表達(dá)系統(tǒng)的成功實(shí)現(xiàn)，獲得高純度的目的蛋白，為其生物功能研究提供了數(shù)據(jù)參考。

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[7] Cappuzzo, F., Varellagarcia, M., Rossi, E., Gajapathy, S., Valente, M., & Drabkin, H., et al. (2009). Myc and eif3h coamplification significantly improve response and survival of non-small cell lung cancer patients (nsclc) treated with gefitinib.JournalofThoracicOncologyOfficialPublicationoftheInternationalAssociationfortheStudyofLungCancer, 4(4):472-478.

[8] Zhang, L., Smit-Mcbride, Z., Pan, X., Rheinhardt, J., & Hershey, J. W. (2008). An oncogenic role for the phosphorylated h-subunit of human translation initiation factor eif3 *.JournalofBiologicalChemistry, 283(35):24,047-24,060.

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YIN Chang-cheng, HUANG Hua. (2002).EscherichiaColiExpressionSystem[M]. Beijing: Beijing Medical University Press. (in Chinese)

Supported by:The National 863 Plan Project "Study on the functional genes for the wool quality character of sheep "(2013AA102506)；Xinjiang Production and Construction Crops Genetic Resources Innovation and Functional Gene Exploration & Utilization Special Project "Exploration and functional verification of the key genes for the important traits in sheep " (2012BB044)；The Xinjiang Production and Construction Corps Applied Basic Research Project "Germplasm innovation of accurate modified sheep multiplets traits gene by crispr technology"(2016AG008)

Cloning, Prokaryotic Expression and Protein Identification ofeIF3hGene from Ovis aries

YU Chang-jiang1,2, QI Cheng-nian1, ZHANG Yun-sheng2,SHEN Ming2, YANG Hua2, YANG Yong-lin2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,TarimUniversity,AralXinjiang843300，China; 2.StateKeyLaboratoryforSheepGeneticImprovementandHealthyBreeding,ShiheziXinjiang832000,China)

【Objective】 To clone gene of ovis aries eukaryotic translation initiation factor 3 subunit H and construct its prokaryotic expression vector, induce the expression and identify target protein in vitro.【Method】Firstly, the ovis aries gene ofeIF3hwould be cloned from Ovis aries cDNA library using the primers based oneIF3hsequence. The prokaryotic expression vectors were transformed into expression host strain BL21, then after, IPTG was added to induce expression. SDS-PAGE and Western blotting assays were used to detect the expression of target protein.【Result】It successfully clonedeIF3hgene sequences of CDS. The length of the CDS was 1,059 bp. The Escherichia coli containing recombinant vector expressed inclusion body proteins of 40kD after induction by IPTG at 37°C.【Conclusion】The construction of recombinant plasmid is successful, which has provided the basis for further research ofeIF3hmolecule.

ovis aries;eIF3hgene; vector construction; prokaryotic expression

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.02.023

2016-11-11

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目“綿羊毛品質(zhì)性狀功能基因研究”(2013AA102506)；兵團(tuán)種質(zhì)資源創(chuàng)新與功能基因發(fā)掘及利用專項(xiàng)“綿羊重要性狀關(guān)鍵基因的挖掘及其功能驗(yàn)證”(2012BB044)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)應(yīng)用基礎(chǔ)研究“基于CRISPR技術(shù)精確修飾綿羊多胎性狀主效基因的種質(zhì)創(chuàng)新”(2016AG008)

于常江(1989-)，男，新疆石河子人，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料，遺傳育種與繁殖，(E-mail)yhmpk719@yeah.net

祁成年(1965-)，男，甘肅武威人，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料，(E-mail)qcndky@126.com 張?jiān)粕?1976-)，男，陜西漢中人，副研究員，研究方向?yàn)榫d羊育種，(E-mail)xmszys@163.com

S827；S188

A

1001-4330(2017)02-0386-07