沉默茉莉酸甲基轉(zhuǎn)移酶(GhJMT)基因?qū)γ藁ㄓ酌缟碇笜说挠绊?/h1>
2017-04-13 06:50:24安汶鎧嚴曉紅包秋娟張富春
新疆農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年2期
安汶鎧，嚴曉紅，包秋娟，張富春
(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)
沉默茉莉酸甲基轉(zhuǎn)移酶(GhJMT)基因?qū)γ藁ㄓ酌缟碇笜说挠绊?/p>
安汶鎧，嚴曉紅，包秋娟，張富春
(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)
【目的】通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS)沉默棉花茉莉酸甲酯轉(zhuǎn)移酶(GhJMT)基因，分析GhJMT基因在干旱脅迫下的功能?！痉椒ā坷肞CR技術(shù)擴增獲得450 bp的GhJMT沉默基因片段，與pTRV-RNA2質(zhì)粒連接構(gòu)建成重組載體pTRV-GhJMT，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(GV3101)，侵染的棉花幼苗1個月后再進行PEG6000干旱脅迫處理24 h，檢測干旱脅迫下棉花幼苗的含水量、光合色素含量及滲調(diào)物質(zhì)、抗氧化物、丙二醛(MDA)濃度和酶活性的變化?！窘Y(jié)果】顯示沉默GhJMT后棉花幼苗葉片中可溶性糖、抗壞血酸(ASA)、甜菜堿、脯氨酸含量和超氧化物氣化酶(SOD) 活力分別降低了42.1%、36.6%、69.4%、71.6% 和16.67%，而MDA、O2-和H2O2含量則分別增加了0.43、1.45和0.59倍?！窘Y(jié)論】棉花GhJMT基因的沉默能夠直接影響干旱脅迫后棉花幼苗的抗旱生理生化特性，降低棉花的抗旱能力。
棉花；干旱脅迫；VIGS；生理生化特性；基因表達
0 引 言
【研究意義】棉花是關(guān)系國計民生的戰(zhàn)略物資，也是重要的經(jīng)濟農(nóng)作物。新疆作為中國的棉花主產(chǎn)區(qū)，年產(chǎn)量占到全國產(chǎn)量的一半。但新疆的干旱少雨的氣候條件，成為影響新疆棉花產(chǎn)量的主要因素[1]。干旱能夠?qū)е旅藁ǖ纳L發(fā)育受抑制、大幅度降低產(chǎn)量[2]，因此研究棉花的抗旱調(diào)控機制，提高棉花的抗旱特性，有助于提高新疆棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)，對棉花產(chǎn)業(yè)的豐收保證具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】茉莉酸甲酯是一種新型的植物激素，參與植物生長發(fā)育和抗逆調(diào)控的眾多過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯能夠參與植物的多種抗逆反應(yīng)，當植物受到脅迫時，植物體內(nèi)茉莉酸甲酯的合成顯著升高，從而誘導(dǎo)抗逆相關(guān)基因的表達[3-5]?！颈狙芯壳腥朦c】已有研究表明茉莉酸甲酯可以提高植物的抗凍[6]、耐旱[7]和抗病蟲[8]的作用。而茉莉酸甲酯的合成是由茉莉酸通過茉莉酸甲酯轉(zhuǎn)移酶(JMT)的催化生成的，因此通過沉默JMT基因可以探討茉莉酸甲酯在逆境條件下對植物的抗逆性的調(diào)節(jié)功能?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究應(yīng)用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(virus-induced gene silencing，VIGS)沉默棉花‘新陸早17號’的茉莉酸甲酯轉(zhuǎn)移酶(GhJMT)基因，研究沉默后棉花幼苗的含水量、滲調(diào)物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)量摩爾濃度及酶活性的變化，為闡明GhJMT的功能提供實驗依據(jù)，也為研究茉莉酸甲酯在棉花中的抗旱功能奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 沉默所用實驗苗的無菌種植
棉花種子是由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所瑪納斯實驗站提供的棉花栽種品種新陸早17號(Gossypiumhirsutumvariety)。挑取大小一致籽粒飽滿的棉花種子，先用70%乙醇消毒1 min，蒸餾水沖洗多次，接著用15%的雙氧水浸種5 h，再蒸餾水沖洗多次，最后播種到固體MS培養(yǎng)基中，進行無菌培養(yǎng)，10 d后打開封口膜煉苗2 d，然后將棉花幼苗轉(zhuǎn)至Hoagland營養(yǎng)液[9-10]中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d后作為研究材料。
1.2 方 法
1.2.1 棉花幼苗的處理
以子葉平展的棉花幼苗為注射材料，沉默注射后10～15 d時，陽性組(注射 pTRV-CAL1)的棉花幼苗的1～2片真葉陸續(xù)出現(xiàn)漂白現(xiàn)象。統(tǒng)計注射pTRV-CAL1的棉花幼苗白化率為25/30=83.34%，沉默成功。30 d后再用2.5%的PEG6000模擬干旱脅迫處理24 h后，分別采取葉片，放置于-80℃冰箱，備用。
1.2.2 VIGS重組載體的構(gòu)建與注射棉花
實驗所用的pTRV(pTRV-RNA1和pTRV-RNA2)載體與攜帶CAL1基因病毒載體由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈。CLA1基因(Cloroplastosalterados1 gene)編碼1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶，該酶參與葉綠體的發(fā)育，在進化中高度保守，棉花中將CLA1基因沉默后植株葉片表現(xiàn)出光漂白癥狀[11]，因此以漂白性狀作為VIGS體系操作成功與否的評判標準。
VIGS重組載體的構(gòu)建是根據(jù)GhJMT干涉位點分析結(jié)果設(shè)計特異性引物，以cDNA 為模板進行RT-PCR擴增，擴增產(chǎn)物和pTRV-RNA2 載體分別進行雙酶切(KpnⅠ和EcoRⅠ)后，進行轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌；測序鑒定出陽性克隆。VIGS重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101：pTRV-RNA1、pTRV-RNA2、pTRV-CLA1、pTRV-GhJMT分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。
VIGS重組載體注射棉花葉片的步驟如下：倒置培養(yǎng)農(nóng)桿菌36～48 h后，挑選單克隆與7 mL LB培養(yǎng)基(LB+50g/mL 卡那霉素+50g/mL 慶大霉素)，28 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)；將菌液接種于50 mL YEB培養(yǎng)基(YEB+20mol/L 乙酰丁香酮+50g/mL 卡那霉素+50g/mL 慶大霉素+100 mmol/L MES)，28 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)，OD600=1.5；酶標儀測量菌液OD600=0.6左右時，將菌液置于無菌離心管，4 000 r/min，離心8 min，棄上清液，合并幾次沉淀的菌體于無菌燒杯中；利用轉(zhuǎn)化液(YEB+200mol/L 乙酰丁香酮+10 mmol/L MES+10 mmol/L MgCl2)懸浮菌體至OD600=1.5；再將pTRV-RNA1分別與pTRV-CLA1、pTRV-RNA2、pTRV-GhJMT的懸浮液等體積混合，置于室溫3 h，分別構(gòu)成預(yù)處理組(pTRV-CLA1)、對照組(pTRV-00)和實驗組(pTRV-GhJMT)。最后將棉花幼苗子葉展平，每株幼苗分別注射2片子葉，每片子葉注射10L左右，每組30株，3次重復(fù)。
1.2.3 棉花幼苗的生化指標的測定
1.2.3.1GhCLA1和GhJMT基因沉默效率的檢測
棉花幼苗注射10 d時，可以觀察到pTRV-CLA1的處理的棉花幼苗出現(xiàn)白化現(xiàn)象。幼苗注射30 d后，將對照組(pTRV-00)和實驗組(pTRV-GhJMT)棉花苗的第2片真葉采樣，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，對GhJMT和Gh18s(實驗選用棉花的18s為內(nèi)參基因)分別設(shè)計熒光定量PCR的特異性引物分別為：
Gh18s-F:5′-CAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTT -3′；
Gh18s-R: 5′-CAAGGAATCGAA ACGAAAGAAGG-3′ ；
GhJMT-F: 5′- GGAATTCCCCACCACCGAAAATAGCTGC -3′；
GhJMT-R: 5′- GGGGTACCGGCCATCACCAAATTG-3′。
實時熒光定量(RT-PCR)參照帶有ROX的Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(美國Invitrogen公司)試劑盒說明書進行。RT-PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 15 s；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40 個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。采用ABI PRISM 7500實時定量PCR儀進行RT-PCR及檢測，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行分析。
1.2.3.2 含水量、光和色素、滲透物質(zhì)和丙二醛(MDA)的測定[12-14]
棉花幼苗注射35 d后，分別干旱脅迫對照組(pTRV-00) 和實驗組(pTRV-GhJMT)棉花幼苗，方法為用2.5%的PEG6000干旱脅迫棉花幼苗24 h，分別取對照組和實驗組注射棉花幼苗的第二片真葉，對棉花幼苗采樣分別用烘干法測定相對水含量。
干旱脅迫處理后，對棉花幼苗采樣分別測定葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量；用酸性茚三酮顯色法測定脯氨酸；蒽酮比色定測定可溶性糖；雷氏鹽法測定甜菜堿；用硫代巴比妥酸比色法測定MDA。
1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
各個實驗均為獨立重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)的處理與作圖分別為Excel 97-2003和GraphPad Prism 5軟件處理分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 重組載體pTRV-GhJMT的構(gòu)建
根據(jù)沉默干涉位點分析結(jié)果得到干涉片段為450 bp，以棉花新陸早17號葉片所提取的cDNA為模板，由設(shè)計特異性引物擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，在450 bp左右出現(xiàn)，擴增產(chǎn)物和pTRV-RNA2 載體分別進行雙酶切(KpnⅠ和EcoRⅠ)后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌GV3101后測序鑒定出陽性克隆。圖1
M:DL 2000; 1～5: pTRV-GhJMT的擴增(左圖): 1～2: pTRV-GhJMT質(zhì)粒的KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定(右圖)
M：DL 2000; 1-5: The amplification of pTRV-GhJMT(left)；1-2: pTRV-GhJMTdigested withKpnⅠandEcoRⅠ(right)
圖1 pTRV-GhJMT的擴增和酶切鑒定
Fig.1 The amplification and digestion analysis of pTRV-GhJMT
2.2GhCLA1和GhJMT基因沉默效率的檢測
棉花幼苗注射30 d后，研究表明，陽性對照GhCLA1植株的第1和2片真葉出現(xiàn)白化現(xiàn)象，白化率達到25/30=83.3%，表明實驗注射成功。圖2A
熒光定量檢測對照組和實驗組中GhJMT基因的表達，研究表明，相對于對照組，實驗組棉花幼苗葉片中GhJMT的表達量僅僅為空載中的32.03%，由此表明棉花苗的GhJMT基因沉默成功。圖2B
注: 沉默GhCLA1后一個月棉花苗的性狀圖 (沉默后使得葉錄素合成受阻葉片表現(xiàn)為漂白)，***表示差異極顯著(P<0.001)
The figure A shows after a month of silenceGhCLA1 traits of cotton seedlings (silence makes leaf blade recorded prostaglandin synthesis hindered the performance of bleach),***indicates significant differences (P<0.001)
圖 2 沉默GhCLA1后的性狀表型(A)及沉默GhJMT后棉花葉片中GhJMT的表達(B)
Fig.2 The phenotypes of cotton after silencingGhCLA1 (A) and effects of silencingGhJMTon expression ofGhJMT(B) in leaves of cotton
2.3 沉默GhJMT基因后對植株含水量及可溶性糖的影響
棉花幼苗對照組和實驗組同在2.5%的PEG6000干旱脅迫24 h后，測量植株含水量結(jié)果顯示(圖3A)，相對于對照組，實驗組植株的含水降低2.9%，二者無顯著性差異。圖3
測定棉花葉片中可溶性糖含量顯示(圖3B)，實驗組葉片中每克干質(zhì)量可溶糖含量為126 ug/g，相對于對照組的葉片中降低42.1%，具有顯著性差異(P<0.05)。圖3
圖3 沉默GhJMT對棉花的含水量和可溶性糖含量變化
Fig.3 Effect of silencedGhJMTon the change of water content and soluble sugar content in leaves of cotton
2.4 沉默GhJMT基因后對棉花葉片抗氧化物質(zhì)含量的影響
PEG6000干旱脅迫處理棉花幼苗24 h，測定實驗組和對照組棉花葉片中每克干質(zhì)量含AsA和GSH的變化。研究表明，實驗組葉片中含188.47mol/g(每克干物質(zhì)中的量) AsA，僅僅為對照組中的36.6%。且二者呈極顯著性差異(P<0.01)(圖4A)。實驗組葉片中GSH為42.27mol/g(圖4B)，與對照組相比較增加53%。二者無顯著性差異。圖4
**表示差異大顯著水平(P<0.01)
**indicates significant differences (P<0.01)
圖4 沉默GhJMT后棉花的抗氧化物質(zhì)含量變化
Fig. 4 Effects of silencedGhJMTon antioxidant content level in leaves of cotton
2.5 沉默GhJMT基因后對棉花葉片光和色素含量的影響
棉花幼苗在2.5%的PEG6000干旱脅迫24 h后，分別對實驗組和對照組的幼苗葉片的葉綠素a、b和類胡蘿卜素測量，結(jié)果表明，與對照組相比，實驗組的棉花葉片中的葉綠素a、b、和類胡蘿卜素以及葉綠素總量分別減少9.1%、10.7%、1.4%和9.6%。二者無顯著性差異。圖5
圖5 沉默GhJMT后棉花的葉綠素含量
Fig.5 Effects of silencedGhJMTon chlorophyllcontentin leaves of cotton
2.6 沉默GhJMT基因后對棉花葉片丙二醛(MDA)含量的影響
PEG6000干旱脅迫24 h后分別進行對照組和實驗組棉花幼苗葉片中的MDA含量進行測定，研究表明，沉默GhJMT基因后，實驗組葉片中每克蛋白質(zhì)含0.765 7mol MDA，相對于對照組葉片中升高0.43倍，二者無顯著性差異。圖6
圖6 沉默GhJMT對棉花的MDA含量
Fig.6 Effect of silencedGhJMTon MDA content in leaves of cotton
2.7 沉默GhJMT基因后對棉花葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響
PEG6000干旱脅迫24 h后，對棉花葉片中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(脯氨酸和甜菜堿)的含量測定表明，實驗組每克葉片干質(zhì)量含脯氨酸25.12g/g，相對于對照組葉片中明顯降低，降為對照組葉片中的28.3%，二者差異極顯著(圖7A)。實驗組每克葉片干質(zhì)量中甜菜堿為107.5 mg/g，相對于對照組也明顯降低，降低69.4%，二者差異極顯著(圖7B)。圖7
**表示差異大顯著水平(P<0.01)，***表示差異大顯著水平(P<0.001)
**indicates significant differences (P<0.01)，***indicates significant differences (P<0.001)
圖7 沉默GhJMT對棉花的脯氨酸和甜菜堿含量
Fig.7 SilencedGhJMTon proline and betaine content in leaves of cotton
2.8 沉默GhJMT基因后對棉花葉片中過氧化物含量的影響
PEG6000干旱脅迫24 h后，測量棉花幼苗葉片中氧自由基和過氧化氫含量，研究表明，實驗組每克葉片鮮重中氧自由基含量為417.1mol/g，相對于對照組葉片中增加1.45倍，二者差異顯著(P<0.05)(圖8A)。實驗組每克葉片鮮重中過氧化氫含量為5.97mol/g，相對于對照組葉片中有所升高，二者無顯著性差異(圖8B)。圖8
*表示差異大顯著水平(P<0.05)
*indicates significant differences (P<0.05)
圖8 沉默GhJMT后棉花的氧化物脅迫水平
Fig.8 SilencedGhJMTon oxidative stress in leaves of cotton
2.9 沉默GhJMT基因后對棉花葉片中抗氧化物酶活性的影響
PEG6000干旱脅迫24 h后，對幼苗葉片的抗氧化酶活性進行測定，結(jié)果表明，沉默GhJMT后實驗組棉花葉片SOD活性為209.6 U/min·g，與對照組相比較顯著降低，為對照組的16.67%，二者差異顯著(P<0.05)(圖9A)。沉默GhJMT后實驗組棉花葉片中POD活性為495.9 U/min·g，與相對照組相比較有一定的增加，二者差異顯著(P<0.05)(圖9B)。圖9
*表示差異大顯著水平(P<0.005)
*indicates significant differences (P<0.005)
圖9 沉默GhJMT對棉花抗氧化物酶活性
Fig.9 SilencedGhJMTon activities of antioxidant enzymes in leaves of cotton
3 討 論
已有大量的研究表明，茉莉酸甲酯對植物脅迫響應(yīng)和生理發(fā)育具著重要的作用。當植物受到干旱脅迫時，植物可以利用茉莉酸合成茉莉酸甲酯來抵抗逆境。而茉莉酸甲基轉(zhuǎn)移酶(GhJMT)為茉莉酸甲酯生物合成的重要酶類，也是其合成過程的限速步驟[15-16]。因此，實驗利用基因沉默方法來研究茉莉酸甲酯在植物抗逆調(diào)節(jié)中發(fā)揮的功能。
基因沉默是研究基因功能的方法之一，目前病毒誘導(dǎo)基因沉默的技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于煙草[17]、番茄[18]、辣椒[19]、矮牽牛[20]等植物相關(guān)基因功能的研究，王麗等[21]最新報道利用VIGS技術(shù)對棉花幼苗GhCPS基因的沉默。實驗參照其方法，用VIGS技術(shù)沉默GhJMT基因，對其基因的功能進行初步摸索。流程為將棉花幼苗注射含有pTRV-GhJMT的重組載體35 d后，提取其總RNA后反轉(zhuǎn)成cDNA，做Real time-PCR檢測GhJMT基因的表達量，僅為對照組 的32.03%，表明GhJMT基因的沉默成功，最后用PEG6000模擬干旱脅迫24 h，測定其生化指標來探討研究茉莉酸甲酯的功能。
植物在干旱脅迫下導(dǎo)致細胞失水，而且導(dǎo)致活性氧和過氧化氫的生成，作為抵抗和清除活性氧類物質(zhì)的抗氧化物如AsA、GSH和抗氧化酶如SOD、POD，它們能夠減輕或消除氧自由基對植物細胞膜的破壞[22]。研究結(jié)果表明，與空載相比，沉默GhJMT基因后棉花苗的氧自由基、過氧化氫以及MDA含量明顯升高，AsA含量和SOD活性明顯降低。進而表明沉默GhJMT后可能使得棉花的抗旱相關(guān)物質(zhì)的合成受到抑制，減弱棉花抗旱能力。
葉片是植物光合作用的最主要的場所，而葉綠素質(zhì)量摩爾濃度也表明著光合作用的強弱和效率，研究沉默GhJMT和空載后，棉花葉片中葉綠素含量的變化，結(jié)果表明，二者葉綠素含量沒明顯變化，表明茉莉酸甲酯可能不參與棉花幼苗的葉綠素的合成或光合作用相關(guān)的反應(yīng)。
滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)干旱逆境重要的生理調(diào)節(jié)機制，滲透調(diào)節(jié)的相溶性物質(zhì)主要有甜菜堿、脯氨酸和可溶性糖[23]。董桃杏等[24]研究結(jié)果表明水稻在干旱脅迫下經(jīng)茉莉酸甲酯處理顯著性地增加其體內(nèi)的滲調(diào)物質(zhì)。研究結(jié)果表明沉默GhJMT后棉花幼苗相對于空載對照，其葉片的可溶性糖、甜菜堿脯氨酸分別顯著性降低42.1%、69.4%和71.6%。沉默棉花的GhJMT基因后，降低茉莉酸甲酯的合成，可能導(dǎo)致減少滲調(diào)物質(zhì)的合成，進而表明GhJMT基因在抗旱調(diào)控過程發(fā)揮重要作用。近些年關(guān)于茉莉酸、茉莉酸甲酯提高植物的抗逆越來越多，但更深的研究茉莉酸信號通路的調(diào)控機制的研究很少，從而進一步研究其對植物抗旱調(diào)控機制尤為重要。
4 結(jié) 論
研究利用VIGS技術(shù)沉默GhJMT基因抑制了茉莉酸甲酯的合成，結(jié)果顯示與對照組相比能夠減少棉花植株滲調(diào)物質(zhì)含量(脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖)，棉花葉片脯氨酸25.12g/g，降低28.3%，甜菜堿為107.5 mg/g，降低69.4%，可溶糖含量為126 ug/g，降低42.1%。棉花植株過氧化物的含量增高SOD酶活減少，與對照組相比棉花葉片中氧自由基含量為417.1mol/g，增加1.45倍，過氧化氫含量為5.97mol/g，也有一定升高，而棉花葉片SOD活性為209.6 U/min·g，降低16.67%。此外還能增加棉花植株的MDA含量，棉花葉片中每克蛋白質(zhì)含0.765 7mol MDA，升高0.43倍。茉莉酸甲酯對滲透調(diào)節(jié)、氧化脅迫和維持細胞膜的穩(wěn)定性十分重要，是棉花逆境調(diào)節(jié)通路中的重要激素，深入研究茉莉酸的信號通路有助于闡明茉莉酸甲酯的抗逆分子機制。
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Supported by:Joint key fund of National Natural Science Foundation of China and Xinjiang "Exploring key genes related to high-efficiency water utilization and creating of drought resistant materials in cotton" (U1303282)
Silencing Effect of Jasmonic Acid Carboxyl Methyl Transferase(JMT) Gene on Physiological Indexes of Cotton Seedlings
AN Wen-kai, YAN Xiao-hong, BAO Qiu-juan, ZHANG Fu-chun
(XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering,CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)
【Objective】 Jasmonic methylester transferase (JMT) can effectively facilitate the production of jasmonic methylester, so that it enhances plant drought resistance.【Method】A 450 bp silence fragment ofGhJMTwas cloned from cotton XLZ17 (Gossypiumhirsutum) using PCR amplification, and then constructed into vector pTRV. The recombinant plasmid pTRV-GhJMTwas transformed into competentAgrobacteriumtumefaciens(GV3101). Cotton seedlings in hydroponic conditions were infected with the transformedA.tumefaciensGV3101. After one month, the growing cotton seedlings were treated with PEG6000 for 24 h. The water content, the molality of osmotic adjustment substances, photosynthetic pigments, antioxidants and malondialdehyde (MDA) as well as enzymes activities in cotton leaves under drought stress were measured.【Result】The results showed that content of soluble sugar, ASA, betaine, proline and SOD were reduced by 42.1%, 36.6%, 69.4% and 71.6% compared with the pTRV-00, and MDA, O2-and H2O2were increased 0.43, 1.45 and 0.59 times compared with pTRV-GhJMT, respectively.【Conclusion】Our results demonstrate thatGhJMTgene silencing can directly affect the physiological and biochemical characteristics of cotton seedlings treated with drought stress and reduce drought resistant ability of cotton.
Gossypiumhirsutum; drought stress; virus-induced gene silencing (VIGS); physiological and biochemical characteristics; gene expression
10.6048/j.issn.1001-4330.2017.02.003
2016-11-07
國家自然科學(xué)基金-新疆聯(lián)合基金重點項目“棉花水分高效利用的關(guān)鍵基因的挖掘及分子機理的研究”(U1303282)
安汶鎧(1990-)，男，碩士研究生，研究方向為分子生物學(xué)，(E-mail)873788221@qq.com
張富春(1962-)，男，教授，博士，研究方向為分子生物學(xué)，(E-mail)zfcxju@xju.edu.cn
S562
A
1001-4330(2017)02-0213-10
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安汶鎧，嚴曉紅，包秋娟，張富春
(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)
沉默茉莉酸甲基轉(zhuǎn)移酶(GhJMT)基因?qū)γ藁ㄓ酌缟碇笜说挠绊?/p>
安汶鎧，嚴曉紅，包秋娟，張富春
(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)
【目的】通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS)沉默棉花茉莉酸甲酯轉(zhuǎn)移酶(GhJMT)基因，分析GhJMT基因在干旱脅迫下的功能?！痉椒ā坷肞CR技術(shù)擴增獲得450 bp的GhJMT沉默基因片段，與pTRV-RNA2質(zhì)粒連接構(gòu)建成重組載體pTRV-GhJMT，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(GV3101)，侵染的棉花幼苗1個月后再進行PEG6000干旱脅迫處理24 h，檢測干旱脅迫下棉花幼苗的含水量、光合色素含量及滲調(diào)物質(zhì)、抗氧化物、丙二醛(MDA)濃度和酶活性的變化?！窘Y(jié)果】顯示沉默GhJMT后棉花幼苗葉片中可溶性糖、抗壞血酸(ASA)、甜菜堿、脯氨酸含量和超氧化物氣化酶(SOD) 活力分別降低了42.1%、36.6%、69.4%、71.6% 和16.67%，而MDA、O2-和H2O2含量則分別增加了0.43、1.45和0.59倍?！窘Y(jié)論】棉花GhJMT基因的沉默能夠直接影響干旱脅迫后棉花幼苗的抗旱生理生化特性，降低棉花的抗旱能力。
棉花；干旱脅迫；VIGS；生理生化特性；基因表達
0 引 言
【研究意義】棉花是關(guān)系國計民生的戰(zhàn)略物資，也是重要的經(jīng)濟農(nóng)作物。新疆作為中國的棉花主產(chǎn)區(qū)，年產(chǎn)量占到全國產(chǎn)量的一半。但新疆的干旱少雨的氣候條件，成為影響新疆棉花產(chǎn)量的主要因素[1]。干旱能夠?qū)е旅藁ǖ纳L發(fā)育受抑制、大幅度降低產(chǎn)量[2]，因此研究棉花的抗旱調(diào)控機制，提高棉花的抗旱特性，有助于提高新疆棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)，對棉花產(chǎn)業(yè)的豐收保證具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】茉莉酸甲酯是一種新型的植物激素，參與植物生長發(fā)育和抗逆調(diào)控的眾多過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯能夠參與植物的多種抗逆反應(yīng)，當植物受到脅迫時，植物體內(nèi)茉莉酸甲酯的合成顯著升高，從而誘導(dǎo)抗逆相關(guān)基因的表達[3-5]?！颈狙芯壳腥朦c】已有研究表明茉莉酸甲酯可以提高植物的抗凍[6]、耐旱[7]和抗病蟲[8]的作用。而茉莉酸甲酯的合成是由茉莉酸通過茉莉酸甲酯轉(zhuǎn)移酶(JMT)的催化生成的，因此通過沉默JMT基因可以探討茉莉酸甲酯在逆境條件下對植物的抗逆性的調(diào)節(jié)功能?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究應(yīng)用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(virus-induced gene silencing，VIGS)沉默棉花‘新陸早17號’的茉莉酸甲酯轉(zhuǎn)移酶(GhJMT)基因，研究沉默后棉花幼苗的含水量、滲調(diào)物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)量摩爾濃度及酶活性的變化，為闡明GhJMT的功能提供實驗依據(jù)，也為研究茉莉酸甲酯在棉花中的抗旱功能奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 沉默所用實驗苗的無菌種植
棉花種子是由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所瑪納斯實驗站提供的棉花栽種品種新陸早17號(Gossypiumhirsutumvariety)。挑取大小一致籽粒飽滿的棉花種子，先用70%乙醇消毒1 min，蒸餾水沖洗多次，接著用15%的雙氧水浸種5 h，再蒸餾水沖洗多次，最后播種到固體MS培養(yǎng)基中，進行無菌培養(yǎng)，10 d后打開封口膜煉苗2 d，然后將棉花幼苗轉(zhuǎn)至Hoagland營養(yǎng)液[9-10]中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d后作為研究材料。
1.2 方 法
1.2.1 棉花幼苗的處理
以子葉平展的棉花幼苗為注射材料，沉默注射后10～15 d時，陽性組(注射 pTRV-CAL1)的棉花幼苗的1～2片真葉陸續(xù)出現(xiàn)漂白現(xiàn)象。統(tǒng)計注射pTRV-CAL1的棉花幼苗白化率為25/30=83.34%，沉默成功。30 d后再用2.5%的PEG6000模擬干旱脅迫處理24 h后，分別采取葉片，放置于-80℃冰箱，備用。
1.2.2 VIGS重組載體的構(gòu)建與注射棉花
實驗所用的pTRV(pTRV-RNA1和pTRV-RNA2)載體與攜帶CAL1基因病毒載體由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈。CLA1基因(Cloroplastosalterados1 gene)編碼1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶，該酶參與葉綠體的發(fā)育，在進化中高度保守，棉花中將CLA1基因沉默后植株葉片表現(xiàn)出光漂白癥狀[11]，因此以漂白性狀作為VIGS體系操作成功與否的評判標準。
VIGS重組載體的構(gòu)建是根據(jù)GhJMT干涉位點分析結(jié)果設(shè)計特異性引物，以cDNA 為模板進行RT-PCR擴增，擴增產(chǎn)物和pTRV-RNA2 載體分別進行雙酶切(KpnⅠ和EcoRⅠ)后，進行轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌；測序鑒定出陽性克隆。VIGS重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101：pTRV-RNA1、pTRV-RNA2、pTRV-CLA1、pTRV-GhJMT分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。
VIGS重組載體注射棉花葉片的步驟如下：倒置培養(yǎng)農(nóng)桿菌36～48 h后，挑選單克隆與7 mL LB培養(yǎng)基(LB+50g/mL 卡那霉素+50g/mL 慶大霉素)，28 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)；將菌液接種于50 mL YEB培養(yǎng)基(YEB+20mol/L 乙酰丁香酮+50g/mL 卡那霉素+50g/mL 慶大霉素+100 mmol/L MES)，28 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)，OD600=1.5；酶標儀測量菌液OD600=0.6左右時，將菌液置于無菌離心管，4 000 r/min，離心8 min，棄上清液，合并幾次沉淀的菌體于無菌燒杯中；利用轉(zhuǎn)化液(YEB+200mol/L 乙酰丁香酮+10 mmol/L MES+10 mmol/L MgCl2)懸浮菌體至OD600=1.5；再將pTRV-RNA1分別與pTRV-CLA1、pTRV-RNA2、pTRV-GhJMT的懸浮液等體積混合，置于室溫3 h，分別構(gòu)成預(yù)處理組(pTRV-CLA1)、對照組(pTRV-00)和實驗組(pTRV-GhJMT)。最后將棉花幼苗子葉展平，每株幼苗分別注射2片子葉，每片子葉注射10L左右，每組30株，3次重復(fù)。
1.2.3 棉花幼苗的生化指標的測定
1.2.3.1GhCLA1和GhJMT基因沉默效率的檢測
棉花幼苗注射10 d時，可以觀察到pTRV-CLA1的處理的棉花幼苗出現(xiàn)白化現(xiàn)象。幼苗注射30 d后，將對照組(pTRV-00)和實驗組(pTRV-GhJMT)棉花苗的第2片真葉采樣，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，對GhJMT和Gh18s(實驗選用棉花的18s為內(nèi)參基因)分別設(shè)計熒光定量PCR的特異性引物分別為：
Gh18s-F:5′-CAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTT -3′；
Gh18s-R: 5′-CAAGGAATCGAA ACGAAAGAAGG-3′ ；
GhJMT-F: 5′- GGAATTCCCCACCACCGAAAATAGCTGC -3′；
GhJMT-R: 5′- GGGGTACCGGCCATCACCAAATTG-3′。
實時熒光定量(RT-PCR)參照帶有ROX的Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(美國Invitrogen公司)試劑盒說明書進行。RT-PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 15 s；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40 個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。采用ABI PRISM 7500實時定量PCR儀進行RT-PCR及檢測，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行分析。
1.2.3.2 含水量、光和色素、滲透物質(zhì)和丙二醛(MDA)的測定[12-14]
棉花幼苗注射35 d后，分別干旱脅迫對照組(pTRV-00) 和實驗組(pTRV-GhJMT)棉花幼苗，方法為用2.5%的PEG6000干旱脅迫棉花幼苗24 h，分別取對照組和實驗組注射棉花幼苗的第二片真葉，對棉花幼苗采樣分別用烘干法測定相對水含量。
干旱脅迫處理后，對棉花幼苗采樣分別測定葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量；用酸性茚三酮顯色法測定脯氨酸；蒽酮比色定測定可溶性糖；雷氏鹽法測定甜菜堿；用硫代巴比妥酸比色法測定MDA。
1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
各個實驗均為獨立重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)的處理與作圖分別為Excel 97-2003和GraphPad Prism 5軟件處理分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 重組載體pTRV-GhJMT的構(gòu)建
根據(jù)沉默干涉位點分析結(jié)果得到干涉片段為450 bp，以棉花新陸早17號葉片所提取的cDNA為模板，由設(shè)計特異性引物擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，在450 bp左右出現(xiàn)，擴增產(chǎn)物和pTRV-RNA2 載體分別進行雙酶切(KpnⅠ和EcoRⅠ)后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌GV3101后測序鑒定出陽性克隆。圖1
M:DL 2000; 1～5: pTRV-GhJMT的擴增(左圖): 1～2: pTRV-GhJMT質(zhì)粒的KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定(右圖)
M：DL 2000; 1-5: The amplification of pTRV-GhJMT(left)；1-2: pTRV-GhJMTdigested withKpnⅠandEcoRⅠ(right)
圖1 pTRV-GhJMT的擴增和酶切鑒定
Fig.1 The amplification and digestion analysis of pTRV-GhJMT
2.2GhCLA1和GhJMT基因沉默效率的檢測
棉花幼苗注射30 d后，研究表明，陽性對照GhCLA1植株的第1和2片真葉出現(xiàn)白化現(xiàn)象，白化率達到25/30=83.3%，表明實驗注射成功。圖2A
熒光定量檢測對照組和實驗組中GhJMT基因的表達，研究表明，相對于對照組，實驗組棉花幼苗葉片中GhJMT的表達量僅僅為空載中的32.03%，由此表明棉花苗的GhJMT基因沉默成功。圖2B
注: 沉默GhCLA1后一個月棉花苗的性狀圖 (沉默后使得葉錄素合成受阻葉片表現(xiàn)為漂白)，***表示差異極顯著(P<0.001)
The figure A shows after a month of silenceGhCLA1 traits of cotton seedlings (silence makes leaf blade recorded prostaglandin synthesis hindered the performance of bleach),***indicates significant differences (P<0.001)
圖 2 沉默GhCLA1后的性狀表型(A)及沉默GhJMT后棉花葉片中GhJMT的表達(B)
Fig.2 The phenotypes of cotton after silencingGhCLA1 (A) and effects of silencingGhJMTon expression ofGhJMT(B) in leaves of cotton
2.3 沉默GhJMT基因后對植株含水量及可溶性糖的影響
棉花幼苗對照組和實驗組同在2.5%的PEG6000干旱脅迫24 h后，測量植株含水量結(jié)果顯示(圖3A)，相對于對照組，實驗組植株的含水降低2.9%，二者無顯著性差異。圖3
測定棉花葉片中可溶性糖含量顯示(圖3B)，實驗組葉片中每克干質(zhì)量可溶糖含量為126 ug/g，相對于對照組的葉片中降低42.1%，具有顯著性差異(P<0.05)。圖3
圖3 沉默GhJMT對棉花的含水量和可溶性糖含量變化
Fig.3 Effect of silencedGhJMTon the change of water content and soluble sugar content in leaves of cotton
2.4 沉默GhJMT基因后對棉花葉片抗氧化物質(zhì)含量的影響
PEG6000干旱脅迫處理棉花幼苗24 h，測定實驗組和對照組棉花葉片中每克干質(zhì)量含AsA和GSH的變化。研究表明，實驗組葉片中含188.47mol/g(每克干物質(zhì)中的量) AsA，僅僅為對照組中的36.6%。且二者呈極顯著性差異(P<0.01)(圖4A)。實驗組葉片中GSH為42.27mol/g(圖4B)，與對照組相比較增加53%。二者無顯著性差異。圖4
**表示差異大顯著水平(P<0.01)
**indicates significant differences (P<0.01)
圖4 沉默GhJMT后棉花的抗氧化物質(zhì)含量變化
Fig. 4 Effects of silencedGhJMTon antioxidant content level in leaves of cotton
2.5 沉默GhJMT基因后對棉花葉片光和色素含量的影響
棉花幼苗在2.5%的PEG6000干旱脅迫24 h后，分別對實驗組和對照組的幼苗葉片的葉綠素a、b和類胡蘿卜素測量，結(jié)果表明，與對照組相比，實驗組的棉花葉片中的葉綠素a、b、和類胡蘿卜素以及葉綠素總量分別減少9.1%、10.7%、1.4%和9.6%。二者無顯著性差異。圖5
圖5 沉默GhJMT后棉花的葉綠素含量
Fig.5 Effects of silencedGhJMTon chlorophyllcontentin leaves of cotton
2.6 沉默GhJMT基因后對棉花葉片丙二醛(MDA)含量的影響
PEG6000干旱脅迫24 h后分別進行對照組和實驗組棉花幼苗葉片中的MDA含量進行測定，研究表明，沉默GhJMT基因后，實驗組葉片中每克蛋白質(zhì)含0.765 7mol MDA，相對于對照組葉片中升高0.43倍，二者無顯著性差異。圖6
圖6 沉默GhJMT對棉花的MDA含量
Fig.6 Effect of silencedGhJMTon MDA content in leaves of cotton
2.7 沉默GhJMT基因后對棉花葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響
PEG6000干旱脅迫24 h后，對棉花葉片中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(脯氨酸和甜菜堿)的含量測定表明，實驗組每克葉片干質(zhì)量含脯氨酸25.12g/g，相對于對照組葉片中明顯降低，降為對照組葉片中的28.3%，二者差異極顯著(圖7A)。實驗組每克葉片干質(zhì)量中甜菜堿為107.5 mg/g，相對于對照組也明顯降低，降低69.4%，二者差異極顯著(圖7B)。圖7
**表示差異大顯著水平(P<0.01)，***表示差異大顯著水平(P<0.001)
**indicates significant differences (P<0.01)，***indicates significant differences (P<0.001)
圖7 沉默GhJMT對棉花的脯氨酸和甜菜堿含量
Fig.7 SilencedGhJMTon proline and betaine content in leaves of cotton
2.8 沉默GhJMT基因后對棉花葉片中過氧化物含量的影響
PEG6000干旱脅迫24 h后，測量棉花幼苗葉片中氧自由基和過氧化氫含量，研究表明，實驗組每克葉片鮮重中氧自由基含量為417.1mol/g，相對于對照組葉片中增加1.45倍，二者差異顯著(P<0.05)(圖8A)。實驗組每克葉片鮮重中過氧化氫含量為5.97mol/g，相對于對照組葉片中有所升高，二者無顯著性差異(圖8B)。圖8
*表示差異大顯著水平(P<0.05)
*indicates significant differences (P<0.05)
圖8 沉默GhJMT后棉花的氧化物脅迫水平
Fig.8 SilencedGhJMTon oxidative stress in leaves of cotton
2.9 沉默GhJMT基因后對棉花葉片中抗氧化物酶活性的影響
PEG6000干旱脅迫24 h后，對幼苗葉片的抗氧化酶活性進行測定，結(jié)果表明，沉默GhJMT后實驗組棉花葉片SOD活性為209.6 U/min·g，與對照組相比較顯著降低，為對照組的16.67%，二者差異顯著(P<0.05)(圖9A)。沉默GhJMT后實驗組棉花葉片中POD活性為495.9 U/min·g，與相對照組相比較有一定的增加，二者差異顯著(P<0.05)(圖9B)。圖9
*表示差異大顯著水平(P<0.005)
*indicates significant differences (P<0.005)
圖9 沉默GhJMT對棉花抗氧化物酶活性
Fig.9 SilencedGhJMTon activities of antioxidant enzymes in leaves of cotton
3 討 論
已有大量的研究表明，茉莉酸甲酯對植物脅迫響應(yīng)和生理發(fā)育具著重要的作用。當植物受到干旱脅迫時，植物可以利用茉莉酸合成茉莉酸甲酯來抵抗逆境。而茉莉酸甲基轉(zhuǎn)移酶(GhJMT)為茉莉酸甲酯生物合成的重要酶類，也是其合成過程的限速步驟[15-16]。因此，實驗利用基因沉默方法來研究茉莉酸甲酯在植物抗逆調(diào)節(jié)中發(fā)揮的功能。
基因沉默是研究基因功能的方法之一，目前病毒誘導(dǎo)基因沉默的技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于煙草[17]、番茄[18]、辣椒[19]、矮牽牛[20]等植物相關(guān)基因功能的研究，王麗等[21]最新報道利用VIGS技術(shù)對棉花幼苗GhCPS基因的沉默。實驗參照其方法，用VIGS技術(shù)沉默GhJMT基因，對其基因的功能進行初步摸索。流程為將棉花幼苗注射含有pTRV-GhJMT的重組載體35 d后，提取其總RNA后反轉(zhuǎn)成cDNA，做Real time-PCR檢測GhJMT基因的表達量，僅為對照組 的32.03%，表明GhJMT基因的沉默成功，最后用PEG6000模擬干旱脅迫24 h，測定其生化指標來探討研究茉莉酸甲酯的功能。
植物在干旱脅迫下導(dǎo)致細胞失水，而且導(dǎo)致活性氧和過氧化氫的生成，作為抵抗和清除活性氧類物質(zhì)的抗氧化物如AsA、GSH和抗氧化酶如SOD、POD，它們能夠減輕或消除氧自由基對植物細胞膜的破壞[22]。研究結(jié)果表明，與空載相比，沉默GhJMT基因后棉花苗的氧自由基、過氧化氫以及MDA含量明顯升高，AsA含量和SOD活性明顯降低。進而表明沉默GhJMT后可能使得棉花的抗旱相關(guān)物質(zhì)的合成受到抑制，減弱棉花抗旱能力。
葉片是植物光合作用的最主要的場所，而葉綠素質(zhì)量摩爾濃度也表明著光合作用的強弱和效率，研究沉默GhJMT和空載后，棉花葉片中葉綠素含量的變化，結(jié)果表明，二者葉綠素含量沒明顯變化，表明茉莉酸甲酯可能不參與棉花幼苗的葉綠素的合成或光合作用相關(guān)的反應(yīng)。
滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)干旱逆境重要的生理調(diào)節(jié)機制，滲透調(diào)節(jié)的相溶性物質(zhì)主要有甜菜堿、脯氨酸和可溶性糖[23]。董桃杏等[24]研究結(jié)果表明水稻在干旱脅迫下經(jīng)茉莉酸甲酯處理顯著性地增加其體內(nèi)的滲調(diào)物質(zhì)。研究結(jié)果表明沉默GhJMT后棉花幼苗相對于空載對照，其葉片的可溶性糖、甜菜堿脯氨酸分別顯著性降低42.1%、69.4%和71.6%。沉默棉花的GhJMT基因后，降低茉莉酸甲酯的合成，可能導(dǎo)致減少滲調(diào)物質(zhì)的合成，進而表明GhJMT基因在抗旱調(diào)控過程發(fā)揮重要作用。近些年關(guān)于茉莉酸、茉莉酸甲酯提高植物的抗逆越來越多，但更深的研究茉莉酸信號通路的調(diào)控機制的研究很少，從而進一步研究其對植物抗旱調(diào)控機制尤為重要。
4 結(jié) 論
研究利用VIGS技術(shù)沉默GhJMT基因抑制了茉莉酸甲酯的合成，結(jié)果顯示與對照組相比能夠減少棉花植株滲調(diào)物質(zhì)含量(脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖)，棉花葉片脯氨酸25.12g/g，降低28.3%，甜菜堿為107.5 mg/g，降低69.4%，可溶糖含量為126 ug/g，降低42.1%。棉花植株過氧化物的含量增高SOD酶活減少，與對照組相比棉花葉片中氧自由基含量為417.1mol/g，增加1.45倍，過氧化氫含量為5.97mol/g，也有一定升高，而棉花葉片SOD活性為209.6 U/min·g，降低16.67%。此外還能增加棉花植株的MDA含量，棉花葉片中每克蛋白質(zhì)含0.765 7mol MDA，升高0.43倍。茉莉酸甲酯對滲透調(diào)節(jié)、氧化脅迫和維持細胞膜的穩(wěn)定性十分重要，是棉花逆境調(diào)節(jié)通路中的重要激素，深入研究茉莉酸的信號通路有助于闡明茉莉酸甲酯的抗逆分子機制。
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Supported by:Joint key fund of National Natural Science Foundation of China and Xinjiang "Exploring key genes related to high-efficiency water utilization and creating of drought resistant materials in cotton" (U1303282)
Silencing Effect of Jasmonic Acid Carboxyl Methyl Transferase(JMT) Gene on Physiological Indexes of Cotton Seedlings
AN Wen-kai, YAN Xiao-hong, BAO Qiu-juan, ZHANG Fu-chun
(XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering,CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)
【Objective】 Jasmonic methylester transferase (JMT) can effectively facilitate the production of jasmonic methylester, so that it enhances plant drought resistance.【Method】A 450 bp silence fragment ofGhJMTwas cloned from cotton XLZ17 (Gossypiumhirsutum) using PCR amplification, and then constructed into vector pTRV. The recombinant plasmid pTRV-GhJMTwas transformed into competentAgrobacteriumtumefaciens(GV3101). Cotton seedlings in hydroponic conditions were infected with the transformedA.tumefaciensGV3101. After one month, the growing cotton seedlings were treated with PEG6000 for 24 h. The water content, the molality of osmotic adjustment substances, photosynthetic pigments, antioxidants and malondialdehyde (MDA) as well as enzymes activities in cotton leaves under drought stress were measured.【Result】The results showed that content of soluble sugar, ASA, betaine, proline and SOD were reduced by 42.1%, 36.6%, 69.4% and 71.6% compared with the pTRV-00, and MDA, O2-and H2O2were increased 0.43, 1.45 and 0.59 times compared with pTRV-GhJMT, respectively.【Conclusion】Our results demonstrate thatGhJMTgene silencing can directly affect the physiological and biochemical characteristics of cotton seedlings treated with drought stress and reduce drought resistant ability of cotton.
Gossypiumhirsutum; drought stress; virus-induced gene silencing (VIGS); physiological and biochemical characteristics; gene expression
10.6048/j.issn.1001-4330.2017.02.003
2016-11-07
國家自然科學(xué)基金-新疆聯(lián)合基金重點項目“棉花水分高效利用的關(guān)鍵基因的挖掘及分子機理的研究”(U1303282)
安汶鎧(1990-)，男，碩士研究生，研究方向為分子生物學(xué)，(E-mail)873788221@qq.com
張富春(1962-)，男，教授，博士，研究方向為分子生物學(xué)，(E-mail)zfcxju@xju.edu.cn
S562
A
1001-4330(2017)02-0213-10
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