李陽(yáng)，李健強(qiáng)，宋素琴，王靜，楚敏

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830021； 3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091； 4.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系，種苗健康北京市工程研究中心，北京 100193)

高放射土壤中拮抗放線菌菌株的篩選及鑒定

李陽(yáng)1,2，李健強(qiáng)3,4，宋素琴3，王靜1，楚敏3

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830021； 3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091； 4.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系，種苗健康北京市工程研究中心，北京 100193)

【目的】從新疆高放射土壤中分離和篩選出對(duì)蘋果樹腐爛病等有拮抗作用的放線菌，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。 【方法】采用對(duì)峙培養(yǎng)法通過(guò)初篩、復(fù)篩測(cè)定拮抗菌對(duì)8種病原菌的拮抗效果，根據(jù)篩選出菌株CH10的形態(tài)特征、生理生化特性及 16S rDNA 序列對(duì)其進(jìn)行鑒定?！窘Y(jié)果】從70種放線菌中篩選出對(duì)蘋果樹腐爛病等8種新疆作物重要病原菌都具有良好拮抗效果的 CH10。【結(jié)論】菌株CH10屬于鏈霉菌屬，對(duì)蘋果樹腐爛病菌等有良好的拮抗效果，為該病害的生物防治提供研究基礎(chǔ)。

拮抗放線菌；病原菌；蘋果腐爛病；16S rDNA；鏈霉菌

0 引 言

【研究意義】蘋果樹腐爛病(Applevalsacanker)俗名“臭皮病、爛皮病、串濕病”等，是ValsamaliMiyabeetYamada(蘋果腐皮殼屬真菌)侵染引起的一種病害，該病在我國(guó)蘋果產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，可導(dǎo)致果樹主干及整樹死亡，嚴(yán)重時(shí)甚至毀園[1-2]。國(guó)家有關(guān)部門2008年調(diào)查結(jié)果表明，蘋果樹腐爛病的平均發(fā)病率為52.7%，發(fā)病嚴(yán)重的地區(qū)發(fā)病率甚至高達(dá)85%以上[3]。2011年甘肅省蘋果樹腐爛病總面積7.5×104hm2，平均發(fā)病率達(dá)到40%，對(duì)蘋果產(chǎn)業(yè)的市場(chǎng)發(fā)展造成了嚴(yán)重的影響[4]。2011年4～5月在新疆阿克蘇市紅旗坡農(nóng)場(chǎng)腐爛病平均發(fā)病率為26.79%，比往年均高。蘋果是多年生木本植物，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)特別有效的抗腐品種[5-6]。歷年來(lái)蘋果樹腐爛病防治主要通過(guò)化學(xué)藥劑控制或延緩病情發(fā)展，但大量化學(xué)藥劑的使用也造成了嚴(yán)重后果，例如果園生態(tài)環(huán)境污染惡化，病原菌產(chǎn)生抗藥性，除此之外還給食品帶來(lái)嚴(yán)重的安全隱患等等。因此，尋找對(duì)環(huán)境污染小、高效的生物防治方法，防治蘋果腐爛病有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】20世紀(jì)80年代以來(lái)，生物防治作為一種安全有效的防治方法越發(fā)關(guān)注。郜佐鵬等[7]研究發(fā)現(xiàn)多種植物內(nèi)生的放線菌可以抑制蘋果樹腐爛病。高克祥等[8]、Xin & Shang[9]、鄧振山等[10]先后報(bào)道哈茨木霉Trichodermaharzianum、深綠木霉Trichodermaatroviride和螺旋毛殼Chaetomiumspirale對(duì)蘋果樹腐爛病主要病原菌具有重寄生或抑制效果；展麗然等[11]在土壤樣品中篩選到對(duì)腐爛病菌具有拮抗作用的放線菌 Z-6，初步鑒定為金色類群Aureus，屬于鏈霉菌屬Streptomyces。張清明等[12]從健康蘋果樹枝條分離到了一株拮抗放線菌卡伍爾鏈霉菌(Streptomycescavourensis)A-2，其發(fā)酵濾液對(duì)蘋果樹腐爛病的抑制率達(dá)90%以上?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】采自新疆高放射土壤的放線菌，其是微生物中重要的一類菌，放線菌中的許多屬如鏈霉菌(Streptomyces)作為一種植物根圈促生菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria，PGPR)在文獻(xiàn)已有大量報(bào)道[13]。近千種的抗生素及其衍生物來(lái)源于放線菌，已投入到生產(chǎn)與生活應(yīng)用中的有90種左右[14]。目前已經(jīng)發(fā)掘的抗生素80%是由放線菌產(chǎn)生的[15]，該生物資源有著廣泛的應(yīng)用前景?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】拮抗菌形態(tài)特征及鑒定生理生化特性，及其發(fā)酵液的抑菌作用和成分分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌種

放線菌來(lái)自新疆放射土壤。供試病原菌蘋果樹腐爛菌-ValsamaliAkesu，蘋果莖點(diǎn)霉-PhomaPomi，擬分枝孢鏈孢霉-FusariumSporotrichioides，大麗輪枝菌-VerticilliumdahliaShihezi，色二孢屬真菌-Diplodiaseriata，立枯絲核-Solani，鏈格孢-Alternariaalternata，蘋果樹腐爛病菌-ValsamaliQingdao由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院、新疆農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工所等提供，分離自果樹或果實(shí)。表1

表1 病原菌種類

Table 1 Category pathogens

編號(hào)病原菌Pathogens致病作物PathogenicCrop致病名稱PathogenicName來(lái)源Sources1蘋果樹腐爛病菌 ValsaMaliAkesu蘋果樹蘋果樹腐爛病蘋果樹2大麗輪枝桿菌 VerticilliumDahliaeShihezi棉花棉花黃萎病石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院3色二孢屬真菌 DiplodiaSeriata葡萄葡萄莖潰爛新疆農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工所4擬分枝孢鐮孢霉 FuswiumSporotpichioides梨梨腐爛病梨5立枯絲核 Solani蘋果樹蘋果苗立枯病石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院6蘋果樹腐爛病菌 ValsaMaliQingdao蘋果樹蘋果樹腐爛病新疆農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工所7蘋果擬莖點(diǎn)霉 PhomaPomi蘋果蘋果褐點(diǎn)病斑蘋果8鏈格孢 AltemariaAltemata蘋果蘋果霉心病新疆農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工所

1.1.2 培養(yǎng)基配制

PDA培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)病原菌。配制方法：稱200 g馬鈴薯切成小塊，加1 000 mL水煮沸30 min，用雙層紗布過(guò)濾，加水至1 000 mL，然后加入20 g葡萄糖完全溶解，加瓊脂20 g，pH自然。

高氏培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)放線菌。配制方法：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL pH=7.2～7.4。

1.1.3 主要儀器

LDZX-50KBS全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器；SPX-288生化培養(yǎng)箱。

THZ-98A回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床；Fa2204電子天平。

1.2 方 法

1.2.1 放線菌菌株的分離與拮抗菌株的篩選

1.2.1.1 放線菌菌株的分離與純化

土樣來(lái)自新疆高放射區(qū)土壤，經(jīng)風(fēng)干后篩濾保存。電子天平上稱取樣品10.000 g放入裝有90 mL無(wú)菌水和玻璃珠的三角瓶中，于搖床上振蕩30 min后樣品與無(wú)菌水充分混合均勻制得樣品懸液。然后在無(wú)菌條件下用移液槍吸取1 000 μL注入無(wú)菌水中，稀釋至10 mL溶液，然后按比例制成樣品稀釋液10∶2、10∶3、10∶4、10∶5、10∶6。分別吸取100 μL上述稀釋液，在高氏培養(yǎng)基上采用稀釋涂布法分離放線菌菌株，30℃培養(yǎng)24 h，然后根據(jù)其形態(tài)、透明度、顏色等挑取形狀差異明顯的菌落。挑取單菌落采用平板劃線進(jìn)行純化、培養(yǎng)并編號(hào)，5℃保存[16]。

1.2.1.2 蘋果樹腐爛病菌拮抗菌株的初篩

通過(guò)傳統(tǒng)的對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行初篩[17]，將活化好的8株常見(jiàn)作物病菌制成直徑約5 mm的菌餅，依次用滅過(guò)菌的鑷子接種在倒有PDA培養(yǎng)基的中央，同時(shí)將活化好的放線菌菌株，以菌餅形式接于距病原菌相同距離的4個(gè)角上，每皿重復(fù)三次，以不接種放線菌菌株只接種病原菌的平皿作為對(duì)照，置30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，記錄對(duì)照平板菌落直徑，觀察記錄處理試驗(yàn)有無(wú)抑菌圈并測(cè)量病原菌菌落直徑。

1.2.1.3 蘋果樹腐爛病菌拮抗菌株的復(fù)篩

挑取病原菌絲放入5 mL無(wú)菌水中，移取200 μL病原菌懸浮液于PDA 培養(yǎng)基中，用刮鏟鋪勻，對(duì)稱接種直徑一定的放線菌菌餅，以加入等體積無(wú)菌病原菌培養(yǎng)液的處理作為對(duì)照，每皿重復(fù)三次，30℃恒溫培養(yǎng)3 d，測(cè)量處理菌落直徑并計(jì)算其抑菌率。選取對(duì)蘋果樹腐爛病菌具有較好活性的拮抗菌CH10進(jìn)行廣譜性測(cè)定。按上述方法對(duì)8種供試病原菌進(jìn)行拮抗率測(cè)定，每皿重復(fù)三次，30℃恒溫培養(yǎng)測(cè)量拮抗圈直徑并計(jì)算抑菌率。

d0-為對(duì)照病原菌直徑(mm)；

d-為處理病原菌直徑(mm)；

5-菌餅直徑(mm)；

1.2.2 菌株CH10的鑒定

形態(tài)及生理生化特征鑒定：根據(jù)《放線菌的分離與鑒定》[18]進(jìn)行。通過(guò)16S rDNA的序列進(jìn)行菌株鑒定，實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：

1.2.2.1 主要儀器

表2 儀器耗材

Table 2 Instrument supplies

名稱Name型號(hào)Model廠家Manufacturer規(guī)格Specifications備注NotePCR儀DL9700東林昌盛96孔PCR擴(kuò)增恒溫孵育器Constanttemperature鼎國(guó)昌盛世膠回收溶膠16S引物16Sprimers鼎國(guó)昌盛PAGEPCR擴(kuò)增2XMix鼎國(guó)昌盛2U/ulDNA聚合酶回收試劑盒RecoveryKitNEP025-1鼎國(guó)昌盛50T片斷回收純化

1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)流程

細(xì)菌基因組提取

(1)2 mL沉菌，加入800 μL CTAB抽提液，65℃水浴40 min。

(2)加入800 μL氯仿異戊醇，混勻，12 000 r/min，離心10 min。

(3)取上清，加600 μL氯仿異戊醇，12 000 r/min，離心10 min。

(4)取上清，加入1 mL CTAB沉淀液，12 000 r/min，離心10 min。

(5)倒掉上清，10 min揮發(fā)晾干，加200 μL H2O，吸打混勻。

(6)加入400 μL無(wú)水乙醇，20 μL 3MNaAC，-20℃沉淀30 min。

(7)4℃，12 000 r/min，10 min離心加入500 μL 80%乙醇洗2次，12 000 r/min，10 min離心到上清，溶70 μL水。

1.3.2.2 目的片段擴(kuò)增

引物合成：

F16S-27:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；

R16S-1492:CGGTTACCTTGTTACGACTTC；

反應(yīng)體系

表3 反應(yīng)體系

Table Reaction system

組成Constitution體積Volume(μL)2XMix2527F(10μM)11492R(10μM)1DNA模板2ddH2O21

反應(yīng)條件：

回收PCR產(chǎn)物

(1)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片斷。

(2)加入回收試劑溶液A 300 μL/0.1 g，60℃水浴至膠完全溶化。

(3)加入50 μL回收試劑溶液B，混勻。

(4)將溶液置于離心柱中，靜置5 min，12 000 r/min，1 min，棄去液體。

(5)加入500 μL 80%乙醇，12 000 r/min，離心1 min，棄液體，重復(fù)一次。

(6)12 000 r/min，離心5 min，甩干余液，棄液體，晾干5～8 min。

(7)將離心柱置于新的離心管中，加入30 μL滅菌雙蒸水，靜置10 min。

(8)13 000 r/min，離心3 min，管底即為純化產(chǎn)物，取3 μL電泳檢測(cè)。

將測(cè)序得到的序列采用 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST軟件與GenBank 中的核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，檢索同源性高的菌株用于系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果樹腐爛病拮抗放線菌菌株的篩選

供試土壤樣品中共分離70株放線菌菌株，經(jīng)初篩和復(fù)篩獲得拮抗性較好的有4株：CH10、P4-A7、BE44-B1(A)、BE3-B6(A)。

在 PDA 平板對(duì)峙試驗(yàn)中，這4株放線菌對(duì)腐爛病菌菌絲產(chǎn)生較好的抑菌作用，拮抗菌邊緣的病原菌生長(zhǎng)速度減緩或停止，形成一個(gè)明顯的抑菌圈。其中菌株CH10對(duì)8種常見(jiàn)作物病原菌的拮抗效果最好。因此，選取拮抗菌 CH10作進(jìn)一步研究。圖1

圖1 拮抗菌篩選圖

Fig.1 The screening of antagonistic actinomycetes

2.2 菌株對(duì)8種果樹病原菌的抑制作用

以上篩選出4個(gè)菌株對(duì)供試病原菌均有不同程度的抑制作用，抑菌率在 18.75%～62..50%，表現(xiàn)出良好的抑菌性。表3，表4

表3 放線菌拮抗圈直徑(mm)

Table 3 Diameter of antagonistic actinomycetes

拮抗菌Antagonist病原菌 Pathogens蘋果樹腐爛病菌ValsamaliAkesu(mm)大麗輪枝桿菌VerticilliumdahliaShihezi(mm)色二孢屬真菌Diplodiaseriata(mm)擬分枝孢鐮孢菌Fusariumsporotrichioides(mm)立枯絲核Solani(mm)蘋果樹腐爛病菌ValsamaliQingdao(mm)蘋果擬莖點(diǎn)霉Escherichiahermannii(mm)鏈格孢Alternariaalternata(mm)CH1034603050245518711664157714211940P4-A731502898278828421685245028422788BE44-B1(A)27402628214323941870302120802270BE3-B6(A)28152892213018541932177323552018

表4 放線菌拮抗效果

Table 4 Antagonistic effection of actinomycetes

拮抗菌Antagonist病原菌 Pathogens蘋果樹腐爛病菌ValsamaliAkesu(mm)大麗輪枝桿菌VerticilliumdahliaShihezi(mm)色二孢屬真菌Diplodiaseriata(mm)擬分枝孢鐮孢菌Fusariumsporotrichioides(mm)立枯絲核Solani(mm)蘋果樹腐爛病菌ValsamaliQingdao(mm)蘋果擬莖點(diǎn)霉Escherichiahermannii(mm)鏈格孢Alternariaalternata(mm)CH1062505125375026252269212518752750P4-A753754750449046152305374146154490BE44-B1(A)43754125312536252625265330053375BE3-B6(A)45524734310225942734245335472891

2.3 拮抗菌株 CH10的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征及生理生化特性

在高氏培養(yǎng)基上CH10菌落呈白色， 邊緣光滑，菌落卵圓形且緊貼培養(yǎng)基，濕潤(rùn)、不透明，菌體呈線狀。CH10的適宜生長(zhǎng)溫度為28～32 ℃，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)及顯微鏡100倍油鏡下觀察。圖2

2.3.2 16S rDNA 序列分析

通過(guò) PCR 擴(kuò)增菌株 CH10 的 16S rDNA，得到1條大約 1 500 bp 的片段，測(cè)序結(jié)果表明該區(qū)段長(zhǎng)度為1 459 bp。將該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast進(jìn)行比對(duì)(登錄號(hào)為KT986228)。圖3，圖4

2.3.3 分子鑒定結(jié)果

測(cè)序比對(duì)測(cè)序結(jié)果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上BLAST比對(duì)，利用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，在以16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中菌株CH10與婁徹氏鏈霉菌(StreptomycesrocheiNBRC12908T)、和淡紫褐鏈霉菌(StreptomycesenissocaesilisNRRLB-16365T)、褶皺鏈霉菌(StreptomycesplicatusNBIC13071T)位于系統(tǒng)進(jìn)化樹上同一分支，其序列的同源性都高達(dá)99%，表明它們的親緣關(guān)系較近。結(jié)合形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特性比較，因此將菌株CH10初步鑒定為鏈霉菌屬。圖5

圖2 CH10的形態(tài)特征

Fig.2 Morphological character of CH10

圖3 DNA電泳

Fig.3 Electrophoretic pattern of DNA

注：maker為2000,1600,1000,750,500,250,100bp

圖4 PCR電泳檢測(cè)

Fig.4 Electrophoresis detection of PCR

圖5 依據(jù)菌種CH1016S rDNA序列的N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.5 Phylogenetic tree of strain CH10 based on 16S rDNA sequences

3 討 論

植物根際土壤和植物內(nèi)部存在大量微生物，這些微生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化中與植物和病原菌形成了彼此密切關(guān)系，其中一些微生物對(duì)病原菌產(chǎn)生抑制作用[19]。劉琴[20]、柳成賓[21]、張麗[22]分別分離出的鏈霉菌SR-1102、鏈霉菌TRM42561、婁徹氏鏈霉菌YL-2粗提取液，分別對(duì)黃瓜枯萎病(F.oxysporumf.sp.cucumerinum)、棉花黃萎病(Verticilliumdahliae)、稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)都有較好的抑菌作用。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)簡(jiǎn)單、直觀、快速的對(duì)峙培養(yǎng)法，通過(guò)觀察拮抗圈的大小，在一定時(shí)間內(nèi)就可以對(duì)很多放線菌菌株進(jìn)行篩選，以期為該病害的防治提供參考。

4 結(jié) 論

4.1 研究通過(guò)初篩和復(fù)篩，從來(lái)自新疆高放射區(qū)土壤中的70株放線菌中篩選得到4株對(duì)蘋果樹腐爛病菌具有顯著拮抗作用的菌株，其中 CH10拮抗效果最好。

4.2 經(jīng)菌落形態(tài)培養(yǎng)觀察、生理生化鑒定以及 16S rDNA 序列分析，最終確定菌株CH10為鏈霉菌屬。

4.3 菌株CH10對(duì)蘋果采摘后貯藏保鮮的作用、發(fā)酵濾液的抑菌作用和拮抗物質(zhì)、對(duì)蘋果樹腐爛病的具體生防效果有待進(jìn)一步研究。

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Fund project:Supported by Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program during the Twelfth Five-year Plan Period. (2012BAD42B02); The project of the introduction of the higher-grade talented persons of the Xinjiang Uygur Autonomous Region(2015-2017)

The Screening and Identification of Antagonistic Actinomycetes Strains from the High Radiation Soil

LI Yang1,2， LI Jian-qiang3,4， SONG Su-qin3，WANG Jing1， CHU Min3

(1.CollegeofFoodandPharmaceuticalSciences,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China； 2.XinjiangInstituteofLightIndustryTechnology,Urumqi830021；3.ResearchInstituteofAppliedMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China；4.DepartmentofPlantPathology,BeijingEngineeringResearchCenterofSeedandPlantHealth,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

【Objective】 This project aims to isolate and screen 70 actinomycetes strains from the high radiation soil of Xinjiang by antagonistic effect of 8 kinds of pathogenic bacteria such as theValsamaliMiyabeetYamada.【Method】By the plate confrontation culture method, and through initial screening and repeated screening of antagonistic effect of 8 kinds of pathogenic bacteria, and according to the morphological characteristics of the strains of CH10, the physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence went through identification and analysis.【Result】The results showed that 8 kinds of important pathogens of Xinjiang crops, such as theValsamaliMiyabeetYamada, were screened out from 70 kinds of actinomycetes, which had good antagonistic effect called CH10.【Conclusion】Strain CH10 belongs to the genus streptomyces and it has good antagonistic effect on theValsamaliMiyabeetYamada, which has provided a foundation for the biological control of the disease.

antagonistic actinomycetes; pathogenic bacteria; 16S rDNA identification; streptomyces

2016-09-22

新疆科技援疆項(xiàng)目(201491150)；高層次引進(jìn)人才(2015-2017)

李陽(yáng)(1985-)，女，助教，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锷韺W(xué)，(E-mail)1501740810@qq.com

宋素琴(1976-)，女，副研究員，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锘钚援a(chǎn)物和植物病理學(xué)，(E-mail)suqin_song@163.com 王靜(1978-)，女，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)楣哔A藏保鮮，(E-mail)1944142847@qq.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.01.017

S182

A

1001-4330(2017)01-0132-08