李燕燕 趙 艷

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310018）

轉(zhuǎn)2mG2-epsps基因水稻種子蛋白質(zhì)非預(yù)期變異分析

李燕燕 趙 艷

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310018）

以轉(zhuǎn)2mG2-epsps基因抗草甘膦水稻為材料，根據(jù)實(shí)質(zhì)等同性原則，分析轉(zhuǎn)基因（genetically modified，GM）水稻種子可溶性蛋白含量和組分的非預(yù)期變異。結(jié)果表明：與非轉(zhuǎn)基因親本相比，GM水稻種子的總可溶性蛋白含量極顯著降低，主要受谷蛋白含量變異影響。但清、球、醇、谷4種蛋白含量的最高變異幅度（9.12%）低于P1和P2兩親本之間的最大差異幅度（14.67%）。說(shuō)明GM水稻種子的可溶性蛋白含量非預(yù)期變異在安全范圍內(nèi)，但營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)可能與親本品系存在差異。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，GM水稻株系T12和T22分別有12和14個(gè)蛋白譜帶發(fā)生了非預(yù)期變異，涉及4種可溶性蛋白的組分，多數(shù)表現(xiàn)為含量變化。突出的是，2個(gè)GM水稻株系中均新增加了41 ku和56 ku谷蛋白組分，需要進(jìn)一步通過(guò)毒理學(xué)分析評(píng)價(jià)其食品安全性。

轉(zhuǎn)基因水稻 種子可溶性蛋白 實(shí)質(zhì)等同性 非預(yù)期變異

水稻作為全球最重要的農(nóng)作物，近年來(lái)面積和單產(chǎn)的增長(zhǎng)率逐年變小，病蟲(chóng)草害和自然災(zāi)害頻發(fā)是主要的誘因［1］，雜草稻與水稻爭(zhēng)光、爭(zhēng)水、爭(zhēng)肥，嚴(yán)重威脅水稻生產(chǎn)，造成水稻減產(chǎn)［2］。草甘膦是一種高效、廣譜除草劑，由于其作用的靶標(biāo)酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）只存在于植物和微生物中，具有很高的毒理學(xué)和環(huán)境安全性。由于草甘膦除草劑集中了高效、安全、低成本、無(wú)殘留、易降解等諸多優(yōu)點(diǎn)，從1996年以來(lái)，草甘膦／抗草甘膦轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的雜草控制模式取得了巨大成功，世界范圍內(nèi)約90%的轉(zhuǎn)基因（genetically modified，GM）農(nóng)作物攜帶草甘膦抗性基因［3］。抗草甘膦除草劑GM水稻新品種的培育對(duì)于雜草控制和提高水稻產(chǎn)量有重要現(xiàn)實(shí)意義。2mG2-epsps是我國(guó)科學(xué)家林敏從熒光假單胞菌（pseudom onas fluorescens）G2菌株中克隆后經(jīng)優(yōu)化改造獲得的耐草甘膦新基因，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)［4］，本課題組前期培育成功的轉(zhuǎn)2mG2-epsps基因GM水稻新品系應(yīng)用前景廣闊。

國(guó)際社會(huì)對(duì)GM作物及食品的安全性存在廣泛爭(zhēng)議，公眾對(duì)GM作物非預(yù)期變異效應(yīng)影響人類健康的擔(dān)憂是GM作物商品化應(yīng)用的主要障礙［5］。非預(yù)期效應(yīng)是指除了由目的基因插入產(chǎn)生的可預(yù)料效應(yīng)之外，在相同環(huán)境和條件下種植的GM作物與非轉(zhuǎn)基因親本在表型、反應(yīng)和成分上所表現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異［6］。人們擔(dān)心GM作物的非預(yù)期效應(yīng)可能影響食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，甚至可能產(chǎn)生對(duì)人類和動(dòng)物健康有害的毒素［5］。1993年OECD（Organization for Economic Cooperation and Development）提出的實(shí)質(zhì)等同性原則是GM食品安全性評(píng)價(jià)的重要依據(jù)，旨在通過(guò)比對(duì)分析識(shí)別GM作物與親本之間相似的和不等同的新成分，然后對(duì)新成分進(jìn)行進(jìn)一步的毒理學(xué)評(píng)價(jià)［7］。在成分比對(duì)方面，由于DNA和RNA通常不具有食品安全風(fēng)險(xiǎn)，GM作物安全性評(píng)價(jià)主要以基因表達(dá)產(chǎn)物特別是蛋白質(zhì)作為分析對(duì)象［8］。根據(jù)溶解性，稻米蛋白可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白［9］。本研究根據(jù)實(shí)質(zhì)等同性原則，分析抗草甘膦GM水稻種子可溶性蛋白含量和組分的非預(yù)期變異，為抗草甘膦GM水稻的安全性評(píng)價(jià)和商品化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)2mG2-epsps基因純合株系T12、T22和各自的非轉(zhuǎn)基因親本對(duì)照粳稻品種日本晴（P1）、JP574（P2），于2013年12月種植于海南轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)田，2014年5月收獲水稻種子，自然曬干后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 稻米可溶性蛋白提取

水稻種子經(jīng)脫殼、磨粉、過(guò)80目篩，用丙酮脫脂制成脫脂米粉。按參考文獻(xiàn)［9］方法，分別用蒸餾水、5%NaCl、70%乙醇和0.1 mol／L NaOH依次從脫脂米粉中分級(jí)提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白。采用Bradford方法［10］測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，換算出每g脫脂米粉中各種可溶性蛋白的含量。

蛋白含量（mg／g脫脂米粉）＝蛋白濃度（mg／mL）×提取液體積（mL）／脫脂米粉質(zhì)量（g）

1.2.2 稻米蛋白組分SDS-PAGE分析

參照江紹玫等［11］的SDS-PAGE電泳法分析稻米4種蛋白組分。采用Tris-甘氨酸高pH不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，14%分離膠，5%濃縮膠，每孔上樣蛋白質(zhì)量為8 μg。采用恒壓式電泳，濃縮膠電壓為80 V，樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)至130 V。電泳結(jié)束后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色后，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，用Quantity one軟件對(duì)電泳圖譜中的蛋白質(zhì)組分條帶進(jìn)行定量取值分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

水稻種子可溶性蛋白含量測(cè)定時(shí)，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果以X±s（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示，并以P為對(duì)照，應(yīng)用Origin軟件對(duì)GM水稻樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性統(tǒng)計(jì)分析。

用Quantity one軟件對(duì)SDS-PAGE電泳條帶進(jìn)行掃描定量分析取值時(shí)，將親本具有的蛋白組分條帶含量取值定義為1，當(dāng)GM水稻樣本某蛋白組分含量的取值比親本相應(yīng)的條帶增加或減少0.40倍和0.80倍以上時(shí)，標(biāo)記為該蛋白組分與親本差異顯著和極顯著，視為非預(yù)期變異組分。

分別以P1和P2為對(duì)照，對(duì)T12和T22 2個(gè)GM水稻株系的種子可溶性蛋白含量進(jìn)行差異顯著性分析（表1），并將T12和T22的可溶性蛋白含量變異趨勢(shì)和幅度匯總于表2。T12和T22的總可溶性蛋白含量分別比各自親本降低3.43%和6.43%，差異顯著。T12的球蛋白含量比P1顯著增加，谷蛋白卻比P1極顯著降低。T22株系除了清蛋白含量比親本顯著增加外，球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量均比P2

顯著或極顯著降低，變異幅度在3.86%～9.12%之間。由于谷蛋白占比最多，因此，GM水稻種子總可溶性蛋白含量降低的變異幅度主要由谷蛋白含量決定。

表1 轉(zhuǎn)基因水稻與親本種子可溶性蛋白含量（mg／g米粉）變異分析

表2 轉(zhuǎn)基因水稻種子可溶性蛋白含量變異趨勢(shì)和幅度匯總

2 結(jié)果與分析

2.1 GM水稻的種子蛋白含量變異分析

T12和T22這2個(gè)GM水稻株系與各自親本的種子可溶性蛋白質(zhì)含量的比較結(jié)果見(jiàn)表1。2個(gè)親本品種P1和P2的可溶性蛋白質(zhì)含量差異顯著，P2品種的總可溶性蛋白顯著高于P1。4種可溶性蛋白中，谷蛋白占比最大，分別達(dá)到P1和P2總可溶性蛋白的67.67%和65.27%，但在2個(gè)親本品種間谷含量差異不顯著。P2的清、球、醇溶蛋白含量分別比P1增加6.27%、14.67%、9.95%，說(shuō)明水稻種子可溶性蛋白質(zhì)含量存在天然的品種差異。

2.2 GM水稻種子蛋白組分變異的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析時(shí)，由于考馬斯亮藍(lán)R250染料與蛋白質(zhì)的定量結(jié)合效應(yīng)，電泳后單個(gè)樣本對(duì)應(yīng)的泳道中分離的蛋白條帶染色的濃淡可反映組分在總蛋白含量中的相對(duì)占比。對(duì)于不同樣本而言，只有當(dāng)上樣的蛋白質(zhì)量相等時(shí)，才能根據(jù)條帶顯色的濃淡比較分子量相同的蛋白組分在不同樣本間的含量差異。將GM水稻株系T12、T22及其各自親本種子的4種可溶性蛋白（清、球、醇、谷）提取液定量測(cè)定后，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整電泳上樣量均為8 μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。由于電泳分析時(shí)各樣本上樣量一致，所以電泳條帶的濃淡可以反映相應(yīng)蛋白組分的相對(duì)含量多少，根據(jù)掃描定量取值結(jié)果，將2個(gè)轉(zhuǎn)基因樣本T12和T22相對(duì)親本的種子蛋白變異組分信息匯總至表3，同時(shí)列出分子量為14～16 ku的水稻過(guò)敏原蛋白條帶的定量取值分析結(jié)果。

2.2.1 非轉(zhuǎn)基因親本P1和P2的種子蛋白組分比較

水稻種子清蛋白（圖1a）條帶最多，蛋白組分復(fù)雜，從正極到負(fù)極分子質(zhì)量分布范圍在9～100 ku之間。P1和P2的清蛋白電泳圖譜相似，組分的含量差值均低于0.4倍，差異不顯著。球蛋白組分的電泳條帶在圖譜中分布清晰（圖1b），共12個(gè)條帶，P1與P2組分一致，只是P2的24 ku和56 ku球蛋白組分含量比P1分別增加0.80倍和0.75倍，差異顯著。醇溶蛋白組分集中于14～16 ku區(qū)域（圖1c），P1的醇溶蛋白組分的電泳條帶14 ku和16 ku比P2的稍淡；兩親本谷蛋白組分的電泳圖譜相似，都包括9、14、19～23、33～38、41和56 ku（圖1d）。在本研究定義的差異水平條件下，P1和P2的清蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白組分差異不顯著，僅球蛋白的個(gè)別組分在含量上有所不同。

圖1 轉(zhuǎn)基因水稻株系與非轉(zhuǎn)基因親本種子蛋白組分的SDS-PAGE電泳圖譜

2.2.2 GM水稻種子蛋白組分變異分析

GM水稻株系T12、T22與各自親本的清蛋白的電泳圖譜比較分析結(jié)果（圖1a和表3）表明，T12的89 ku清蛋白含量比P1增加0.42倍，T22株系的89 ku清蛋白含量卻比P2減少0.43倍，差異顯著。從圖1b和表3結(jié)果可知，GM水稻種子球蛋白組分變異較多。與親本P1相比，T12株系的65、56、24 ku含量顯著增加，變異幅度在0.61～0.65倍之間。T22株系65、57、56、24、21 ku含量顯著降低，僅相當(dāng)于P2相應(yīng)組分含量的1%～55%。

T12和T22株系的14～16 ku醇溶蛋白組分與相應(yīng)親本相比，含量有變化，但差異不顯著（圖1c和表3）。谷蛋白電泳圖中（圖1d），T12和T22與各自的親本相比，變異趨勢(shì)一致，突出的非預(yù)期變異是均新增加了56 ku和41 ku條帶。并且33～38 ku、19～23 ku條帶含量顯著增加，100 ku和9 ku條帶含量比親本顯著減少，取值變異幅度在0.48～0.82倍之間（表3）。

總體上，GM水稻種子的清、球、醇、谷4種蛋白均存在顯著變異的蛋白組分，除了新增的41 ku和56 ku谷蛋白外，其他蛋白組分的非預(yù)期變異主要表現(xiàn)為含量上的增加或降低。

表3 轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因親本相比種子蛋白組分變異情況匯總

2.2.3 GM水稻種子14～16 ku蛋白組分的變異分析

對(duì)于GM水稻蛋白組分的安全性評(píng)價(jià)中，作為稻米主要抗?fàn)I養(yǎng)因子的過(guò)敏原蛋白非常值得關(guān)注。其中14～16 ku蛋白包含水稻常見(jiàn)的主要過(guò)敏原。圖1顯示，水稻種子清、球、醇溶蛋白電泳圖譜中均包含14～16 ku蛋白區(qū)帶，谷蛋白只有14 ku蛋白條帶。定量取值結(jié)果（表3）表明，雖然4種可溶性蛋白中，GM水稻14～16 ku蛋白與親本相比未達(dá)到本試驗(yàn)定義的差異顯著水平（比親本增加或降低0.4倍及以上），但含量出現(xiàn)變化。其中T12株系的14～16 ku醇溶蛋白含量比P1增加了21%，14 ku谷蛋白組分含量則比P1降低了25%。T22株系的14～16 ku清蛋白含量比P2增加了32%，14～16 ku醇溶蛋白和谷蛋白組分含量分別比親本降低了30%和21%。

3 討論

培育抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)稻田雜草控制意義重大［12］。實(shí)質(zhì)等同性評(píng)價(jià)是轉(zhuǎn)基因水稻商品化應(yīng)用的必要前提。結(jié)果表明，2個(gè)抗草甘膦GM水稻株系T12和T22的種子可溶性蛋白含量和組分均存在非預(yù)期變異。這與前人對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻蛋白質(zhì)變異的研究結(jié)果類似［13-14］。

稻米蛋白在水稻不同亞型、品種間存在明顯差異［15］。本試驗(yàn)GM水稻種子的清、球、醇、谷4種可溶性蛋白含量的最高變異幅度（9.12%）低于P1和P2兩親本之間的最大差異幅度（14.67%）。2004年，OECD發(fā)布的水稻新品種關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分含量的共識(shí)性文件顯示，糙米蛋白含量為7.1%～8.3%［16］，GM水稻株系T12和T22的總可溶性含量分別為71.77和71.32 mg／g，屬于水稻的正常變異范圍。然而，稻米蛋白組分對(duì)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)影響較大，比如清蛋白和球蛋白含多種生理活性蛋白［17］，其中稻米α-球蛋白能顯著降低小鼠血清中的膽固醇［18］，14～16 ku蛋白中的淀粉酶抑制劑具有降血糖的生理功能，也可能引發(fā)食物過(guò)敏反應(yīng)［19-20］。因此，GM水稻種子的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)可能與親本品系存在差異。

在蛋白組分方面，GM水稻T12和T22株系分別有12和14個(gè)蛋白譜帶發(fā)生了非預(yù)期變異，涉及清、球、醇、谷4種可溶性蛋白組分，多數(shù)表現(xiàn)為含量的增減。以谷蛋白組分為例說(shuō)明蛋白電泳條帶反映的組分變異與總蛋白含量之間的關(guān)系。與親本相比，2個(gè)GM水稻株系的33～38 ku、19～24 ku谷蛋白條帶含量顯著增加，甚至產(chǎn)生了56 ku、41 ku新組分，但不能由此預(yù)測(cè)GM水稻總谷蛋白含量的變異方向是增加。這是因?yàn)楣鹊鞍捉M分的SDS-PAGE分析是以各對(duì)比樣本電泳上樣總蛋白量相等為前提的，條帶濃度增加只能說(shuō)明其相對(duì)含量占比在GM水稻總谷蛋白中提高。同理，GM水稻100 ku和9 ku谷蛋白條帶的相對(duì)含量占比比親本顯著減少（圖1d和表3）。事實(shí)上，GM水稻株系T12和T22的總谷蛋白含量均比親本極顯著降低（表1），由于谷蛋白含量占比高達(dá)稻米總蛋白的75%～90%［16］，GM水稻種子總可溶性蛋白含量顯著降低的變異可能主要受谷蛋白含量變異影響。從安全的角度，2個(gè)GM水稻株系新增加的41 ku和56 ku谷蛋白組分，需要進(jìn)一步的食品毒理學(xué)評(píng)價(jià)。

過(guò)敏原是GM水稻安全性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵因素。雖然2個(gè)GM水稻株系14～16 ku蛋白組分含量與親本相比未達(dá)到本試驗(yàn)定義的差異顯著水平（表3），但含量變化仍值得關(guān)注，因?yàn)?4～16ku清蛋白和球蛋白包含水稻主要的過(guò)敏原蛋白［16，20］，其相對(duì)含量占比可能影響GM稻米的過(guò)敏原性。其中T22株系的14～16 ku清蛋白含量比P2增加了32%，T12株系的14～16 ku清蛋白和球蛋白含量與P1表現(xiàn)為實(shí)質(zhì)等同?？梢?jiàn)，對(duì)GM水稻株系的過(guò)敏原安全性評(píng)價(jià)應(yīng)遵從個(gè)案分析原則。

需要指出的是，以非轉(zhuǎn)基因親本為對(duì)照樣本的實(shí)質(zhì)等同性比對(duì)結(jié)果，不能揭示GM水稻非預(yù)期變異的技術(shù)來(lái)源，無(wú)法判定這些非預(yù)期變異由轉(zhuǎn)基因插入引起。這是因?yàn)?，GM水稻的培育包括多個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)，特別是GM水稻經(jīng)歷的組織培養(yǎng)也可能導(dǎo)致非預(yù)期變異效應(yīng)［21］，由組織培養(yǎng)導(dǎo)致的無(wú)性系變異（somaclonal variation）應(yīng)用于小麥、玉米、水稻、高粱等的品種改良已有數(shù)十年的歷史［22］，目前不需要進(jìn)行安全性評(píng)估就能應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。Zhou等［23］報(bào)道組織培養(yǎng)對(duì)水稻的代謝物輪廓譜的改變比轉(zhuǎn)基因插入的影響更顯著。Herman等［24］在綜述20年來(lái)GM作物與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g的實(shí)質(zhì)等同性分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，指出懷疑轉(zhuǎn)基因技術(shù)比傳統(tǒng)育種手段可能引發(fā)更嚴(yán)重的非預(yù)期變異缺乏事實(shí)依據(jù)。建議在實(shí)質(zhì)等同性分析時(shí)，增加GM水稻培養(yǎng)過(guò)程中獲得的組織培養(yǎng)再生株系作為對(duì)照樣本，區(qū)分GM水稻的非預(yù)期變異來(lái)源于轉(zhuǎn)基因插入突變還是組織培養(yǎng)無(wú)性系變異，能為GM水稻的安全性評(píng)價(jià)提供更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4 結(jié)論

抗草甘膦GM水稻株系T12和T22的種子可溶性蛋白含量和組分均存在非預(yù)期變異，但清、球、醇、谷4種可溶性蛋白含量的變異幅度在安全范圍內(nèi)，組分變異多數(shù)為含量的增減。GM水稻種子的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)可能與親本存在差異。GM水稻株系新增加的41 ku和56ku谷蛋白組分需要進(jìn)一步的食品安全性評(píng)價(jià)。

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Analysis of Protein Unintended Variation of Transgenic Rice Seeds with 2mG2-epsps Gene

Li Yanyan Zhao Yan

（College of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310018）

The unintended variation of soluble protein contents and components of genetically modified（GM）rice seeds were analyzed，using glyphosate-resistant GM rice lines harboring 2mG2-epsps gene as materials，according to the principle of substantial equivalence.The results showed that the total soluble protein contents of GM rice seeds decreased very significantly，which were mainly affected by the glutenin content variation，compared to the non-transgenic parent lines.While the maximum content variation range（9.12%）from four kinds of proteins including albumin，globulin，prolamin，glutenin，was lower than the variation difference（14.67%）between the two parent varieties，P1 and P2.This indicated that the unintended variation of soluble protein contents of GM rice lines was within the safety range，but the nutritional quality of GM rice seeds might be different from their parent varieties. SDS-PAGE analysis reveals that there were 12 and 14 unintended variation protein bands in the respective GM rice line T12 and T22，concerning components of four kinds of soluble proteins and most exhibit content changes.Notably，two new glutenin bands of 41 ku and 56 ku were produced in all the two GM rice lines，which must be subjected to further toxicology test for food safety evaluation.

genetically modified rice，seed soluble proteins，substantial equivalence，unintended variation

S188

A

1003-0174（2017）01-0001-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（30871511），農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2011ZX 08010-003）

2015-04-23

李燕燕，女，1987年出生，碩士，生物工程

趙艷，女，1970年出生，教授，植物生化與分子生物學(xué)