程鉥濼，言 楓，顧一煌△

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院，南京 210014;2.南京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，南京 210029)

電針足三里對雷公藤甲素致急性肝損傷大鼠IL-10 與TNF-α的影響?

程鉥濼1，言 楓2，顧一煌2△

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院，南京 210014;2.南京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，南京 210029)

目的:觀察電針對雷公藤甲素致急性肝損傷大鼠IL－10與TNF－α的影響及其對肝臟的保護作用。方法:30只健康SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組和電針組，正常組不給予任何干預，模型組給予雷公藤甲素灌胃5 d，電針組給予同等劑量雷公藤甲素灌胃并給予電針足三里刺激5 d后，檢測各組大鼠ALT、AST、TNF－α、IL－10含量。結果:模型組ALT、AST、TNF－α含量高于空白組，IL－10含量低于空白組;電針組IL－10含量高于模型組，TNF－α、ALT、AST含量低于模型組;電針組IL－10、AST含量高于空白組，TNF－α、ALT含量低于空白組，差異無統(tǒng)計學意義。結論:電針足三里能減輕雷公藤甲素所致肝損傷，其機制可能與調(diào)節(jié)抗炎及促炎作用平衡有關。

電針;雷公藤;肝損傷;抗炎因子;促炎因子

雷公藤(tripterygium wilfordii Hook.f.)是一種有廣泛藥用價值的中草藥，具有抑制免疫反應、抗腫瘤等多種藥理作用。臨床應用涉及腎病、內(nèi)分泌疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、皮膚病、眼病、婦科病等多個領域，尤其在類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等風濕免疫性疾病中應用廣泛，療效顯著［1］。雷公藤主要有效成分為雷公藤甲素(TP)等雷公藤二萜內(nèi)酯，其相關效價比雷公藤總苷高100～200倍，具有顯著的抗炎、免疫抑制、抗生育、抗腫瘤等活性。同時也是雷公藤引起毒副作用的主要成分［2］，對心、肝、骨髓、胸、脾、腎及生殖系統(tǒng)等都有一定的毒性。這也在一定程度上限制了雷公藤的臨床應用。肝臟是雷公藤的主要分解代謝臟器，故肝臟毒性是雷公藤毒性反應出現(xiàn)最多的器官。本實驗旨在探求電針足三里對雷公藤甲素致急性肝損傷大鼠的作用及其病理機制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量(250± 20)g，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供(合格證號SCXK(京)2012～0001)。實驗中有關動物的處理符合2006年科學技術部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。雷公藤甲素購自上海金穗生物科技有限公司，AST(谷草轉(zhuǎn)氨酶)、ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)試劑盒及TNF－α(腫瘤壞死因子－α)、IL－10(白介素－10)酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及取材 健康SD大鼠30只，按每組10只隨機分為正常組、模型組和電針組。模型組與電針組大鼠在參考柴智等相關報道［3－4］及預實驗基礎上，將雷公藤甲素標準品溶于丙二醇溶液中，丙二醇在終溶液中比例不超過20%(V/V)，按照3.0 mg/kg劑量連續(xù)灌胃5 d制造大鼠急性肝損傷模型。正常組不進行任何干預;電針組于造模第1天開始將大鼠固定在自制木板上，參照李忠仁主編的《實驗針灸學》［5］，在兩側足三里穴接電針儀以頻率1 Hz/s、強度2～4 mA的刺激量(以足趾輕微顫動為度)行電針30 min，每日1次，連續(xù)治療5 d。實驗結束后各組大鼠眼眶取血3 ml，3000 r/min離心10 min后，取其上清液0.5 ml保存于－20℃冰箱。所有大鼠處死，迅速取肝臟相同部位組織，生理鹽水漂洗后投入液氮，－70℃冰箱中保存。

1.2.2 指標檢測 取冰凍的血清標本，常溫融化后采用微量酶標法測定血清ALT、AST含量。采用ELISA方法，嚴格按照說明書要求操作，分別檢測肝組織勻漿IL－10、TNF－a水平，根據(jù)標準曲線求得所測樣品濃度。取部分相同部位肝臟組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片后在光鏡下進行HE染色，使用MIE3.0圖像處理軟件進行圖像分析。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用完全隨機設計的單因素方差分析，組間比較選擇LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

灌胃24 h內(nèi)，模型組10只大鼠飲食與活動減少，大便稀;電針組大鼠活動尚可，大便軟，飲食減少;治療5 d之后模型組大鼠死亡2只，死亡原因考慮與雷公藤甲素的毒性作用有關;電針組大鼠活動較前增加，大便偏軟，飲食稍有增加，死亡1只，死亡原因考慮與雷公藤的毒性作用有關。

2.2 實驗結果

表1顯示，模型組ALT、AST、TNF－α含量均高于空白組(P＜0.05)，IL－10含量低于空白組(P＜0.05)，說明造模成功;與模型組比較，電針組IL－10含量高于模型組(P＜0.05)，TNF－α、ALT、AST含量均低于模型組(P＜0.05)，提示大鼠肝損傷程度有所減輕;與空白組比較，電針組IL－10、AST含量高于空白組(P＜0.05)，提示電針并未使肝功能恢復正常，TNF－α、ALT含量均低于空白組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠血清ALT、AST與肝組織中IL-10、TNF-α的表達(±s)

表1 各組大鼠血清ALT、AST與肝組織中IL-10、TNF-α的表達(±s)

注:與空白組比較:bP＜0.01;與模型組比較:aP＜0.01

3 討論

多數(shù)研究認為，炎癥反應和免疫系統(tǒng)的激活在肝損傷發(fā)展過程中起重要作用，其中包括促炎因子水平的升高，而炎癥反應時產(chǎn)生的抗炎因子水平也同樣重要，這二者的動態(tài)平衡與肝損傷患者病情的預后和發(fā)展息息相關。

TNF－α在肝臟中主要由激活的枯否氏細胞產(chǎn)生，既能直接損傷肝細胞，又能介導肝臟的炎癥反應，如果大量持續(xù)表達則會延緩肝細胞再生，誘導肝細胞凋亡［6－7］。在肝損傷過程中，巨噬細胞活化、合成和分泌大量促炎細胞因子、趨化因子和ROS(活性氮簇)，激活多形粒細胞釋放氧化物質(zhì)，引起過氧化損傷及微循環(huán)障礙，加重肝損傷導致肝實質(zhì)細胞凋亡壞死。其中TNF－α對肝損傷惡化起了重要作用［8］，不僅可以誘導肝細胞凋亡，還會破壞肝臟微環(huán)境［9］。TNF－α的降低可以減輕肝細胞的壞死和凋亡，減少中性粒細胞的募集和淋巴細胞浸潤，繼而保護肝臟［10］。

IL－10主要由Th2(輔助T細胞)細胞產(chǎn)生，肥大細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、NK細胞以及CD8+T細胞、B細胞均可分泌IL－10，肝內(nèi)IL－10主要來自巨噬細胞、T細胞和Kupffer細胞，其主要生物活性為免疫抑制作用。一方面，IL－10通過抑制Th1細胞的活性［11］，抑制枯否氏細胞的活化，下調(diào)TNF－α、IL－1等促炎癥因子的表達，進而減輕肝損傷［12－13］。另一方面，IL－10可通過抑制樹突狀細胞(dendritic cell，DC)的功能來誘導機體免疫耐受［14］。DC是目前發(fā)現(xiàn)的抗原提呈功能最強的一種抗原提呈細胞［15］，可激活初始T細胞并促進其增殖，誘導特異性免疫應答［16］，IL－10通過抑制DC細胞的成熟從而減少炎性信號的表達。

足三里是足陽明胃經(jīng)合穴，是抗炎及免疫調(diào)節(jié)的要穴。本研究中電針組ALT、AST含量均低于模型組，提示電針足三里能減輕肝細胞的損傷，電針組TNF－α水平低于模型組，IL－10水平高于模型組，說明電針足三里減少促炎因子的表達，同時增強抗炎因子的表達。肝損傷早期的炎癥反應主要是促炎因子水平和抗炎因子水平的平衡被打破，若炎癥反應持續(xù)存在，則會引起機體免疫缺失。針灸作為傳統(tǒng)的中醫(yī)療法，作用機制具有多途徑、多靶點的特點。現(xiàn)代研究也表明，電針能夠促進血液的運行，改善機體的新陳代謝，對臟腑組織器官及體內(nèi)酶系、電解質(zhì)等有特異性的調(diào)整作用。本研究表明，電針可能通過調(diào)節(jié)機體抗炎及促炎作用，使機體趨向穩(wěn)態(tài)，減輕雷公藤甲素所致肝損傷，為臨床藥物減毒研究提供新的思路。

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Effects of Electro-acupuncture at ST36 on Levels of Interleukin-10 and Tumor Necrosis Factor-α in Rats with Acute Hepatic Injury Caused by Triptolide

CHENG Shu－luo1，YAN Feng2，GU Yi－h(huán)uang2△

(1．The affiliated Nanjing West Medicine Combined with TCM Hospital Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210014，China;2．The Second Clinical Medical College，Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210029，China)

Objective:To investigate the effect of Electro－acupuncture on the levels of interleukin－10(IL－10)and tumor necrosis factor－α(TNF－α)in rats with Acute Hepatic Injury Caused by Triptolide and to explore the mechanism. Methods:A total of 30 SD rats were equally randomized into normal group，model and the EA(electro－acupuncture)group; the acute hepatic injury model was established by giving the rats triptolide.Except the normal group，rats of the other groups were given different doses of Triptolide once daily for 5 days.The EA group was given Electro－acupuncture at “Tsusanli”(ST 36)，once daily for 5 days beginning from the first day of modeling.After treatment，all rats were killed to measure the level of ATL，AST，(interleukin)IL－10 and(Tumor Necrosis Factor α)TNF－α contents.Results:In comparison with the normal group，ATL，AST and TNF－α contents were significantly increased and IL－10 contents were decreased in the model group.Compared to the model group，ATL，AST，and TNF－α contents were considerably down－regulated in EA group;IL－10 content was obviously up－regnlated in EA group.Conclusion:Electro－acupuncture at ST 36 can relieve the hepatic injury caused by Triptolide，The mechanism may possibly relate to the regulation of inflammatory response.

Electro－acupuncture;Triptolide;Hepatic injury;Anti－inflammtory cytokine;Serum inflammatory cytokines

R245.9+7

B

1006－3250(2017)02－0245－02

2016－08－18

江蘇省中醫(yī)藥局資助項目(LB13049)－基于H2S氣體信號分子通路的經(jīng)皮穴位電刺激抑制雷公藤甲素肝毒性的機制研究

程鉥濼(1990－)，女，湖北黃岡人，住院醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事針刺效應的臨床與研究。

△通訊作者:顧一煌(1965－)，男，江蘇南通人，教授，醫(yī)學博士，E－mail:gyh5196411@163.com。