王凌志，柴紀(jì)嚴(yán)，劉旭東，劉文俊，趙金茹，王守巖，單德紅，張立德，王德山

β-內(nèi)啡肽過(guò)度釋放參與脾氣虛納少和腹脹的形成?

王凌志，柴紀(jì)嚴(yán)，劉旭東，劉文俊，趙金茹，王守巖，單德紅，張立德，王德山△

納少與腹脹是脾氣虛證的常見(jiàn)癥狀，二者常常同時(shí)出現(xiàn)，其生物學(xué)機(jī)制目前尚不清楚?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，進(jìn)食行為主要受控于下丘腦的攝食中樞與飽中樞，二者相互拮抗，前者啟動(dòng)進(jìn)食行為，后者中斷進(jìn)食。前阿黑皮素(proopiomelanocortin，POMC)神經(jīng)元為厭食神經(jīng)元，其合成分泌的 β－內(nèi)啡肽(βendorphin，β－EP)能夠作用于攝食神經(jīng)元，降低其興奮性，抑制食欲，中斷進(jìn)食［1－2］。這些中樞信號(hào)傳至外周后，能夠影響腸神經(jīng)系統(tǒng)分泌β－EP，進(jìn)而通過(guò)抑制胃腸平滑肌興奮性和Cajal細(xì)胞等多條途徑降低胃腸動(dòng)力［3－4］。飲食不節(jié)和過(guò)度疲勞是誘發(fā)脾氣虛證的常見(jiàn)病因，而這兩個(gè)因素也能誘發(fā)β－EP過(guò)度釋放［5－6］，因此推測(cè)β－EP過(guò)度釋放在脾氣虛納少與腹脹的發(fā)生中起重要作用。為證實(shí)此假說(shuō)，特開(kāi)展本實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量(200±10)g，購(gòu)于遼寧省本溪巿實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK(遼)－2010－0001)，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)SYXK(遼)－2013－000－9)，室溫18～23℃，相對(duì)濕度45%～55%，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑 β－EP檢測(cè)試劑盒和兔抗大鼠β－EPμ受體多克隆抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司(中國(guó))，羊抗兔IgG、S－P超敏試劑盒和DAB均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司(中國(guó))。

1.1.3 儀器 BIO－RAD iMark酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)，BI－2000圖像分析系統(tǒng)(中國(guó)成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型復(fù)制及評(píng)價(jià) 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和脾氣虛組(模型組)各10只。對(duì)照組不造模，模型組按文獻(xiàn)方法［7－8］復(fù)制大鼠脾氣虛模型并評(píng)價(jià)，即在15 d內(nèi)先飽食1 d再禁食2 d，共5個(gè)循環(huán)，同時(shí)每日水溫35～37℃游泳至力竭;評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):大鼠出現(xiàn)消瘦、食少、神疲乏力、毛色枯槁無(wú)光澤等。

1.2.2 大鼠“納少”評(píng)價(jià) 主要檢測(cè)24 h進(jìn)食/水量，即大鼠單只放入代謝籠24 h后，測(cè)量投食/水量和剩余食/水量，二者差值即為其24 h進(jìn)食/水量。

1.2.3 大鼠“腹脹”評(píng)價(jià) 采用炭末推進(jìn)法檢測(cè)胃殘留率和小腸推進(jìn)率。大鼠禁食不禁水24 h后，給予10%炭粉混懸液(5%活性炭和10%阿拉伯膠)灌胃(1 mL/100 g)，30 min后10%水合氯醛麻醉大鼠(0.35 mL/100 g)，打開(kāi)腹腔分別取胃與小腸，量取胃內(nèi)炭末量與總灌胃量相比為胃殘留率;量取小腸內(nèi)炭粉前端至幽門(mén)距離，與幽門(mén)至小腸末端距離之比為小腸推進(jìn)率。

1.2.4 組織β－EP水平檢測(cè) 取麻醉大鼠的下丘腦、胃和幽門(mén)下1～2 cm小腸，制備組織勻漿，凍存?zhèn)溆?。采用ELISA方法，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)上述組織β－EP水平。

1.2.5 μ受體表達(dá) 采用免疫組化法。取麻醉大鼠的全腦、胃和小腸4%多聚甲醛固定后，制備石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，雙氧水封閉，PBS洗3 min ×3次，檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L，pH6.0)，微波爐中高火3 min，低火維持15 min，冷卻至室溫后PBS 洗3 min×3次;滴加血清封閉液，37℃水浴30 min，棄血清，滴加兔抗大鼠μ受體多克隆抗體(1∶300) 4.0℃過(guò)夜，37℃水浴2 h;PBS洗3 min×3次，滴加羊抗兔IgG，37℃水浴30 min;PBS洗3 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇二甲苯脫水，中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照采用抗體稀釋液代替一抗，步驟同上。μ受體表達(dá)呈棕黃色，位于細(xì)胞膜上，采用BI－2000圖像分析系統(tǒng)分析其平均光密度(MOD)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)動(dòng)物死亡及脫失情況發(fā)生。對(duì)照組大鼠體格健壯，飲食正常，反應(yīng)敏捷，被毛緊密有光澤;模型組大鼠則明顯消瘦食少，神疲乏力，反應(yīng)遲鈍，被毛蓬起無(wú)光澤，達(dá)到模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 大鼠“納少”和“腹脹”情況

表1顯示，與對(duì)照組比較，模型組進(jìn)食量和進(jìn)水量顯著減少(P＜0.05，P＜0.01)，表明該組大鼠出現(xiàn)“納少”;胃殘留率雖有下降但不明顯，小腸推進(jìn)率顯著下降(P＜0.01)，提示該組大鼠存在“腹脹”現(xiàn)象。

2.3 大鼠相關(guān)組織β－EP水平和μ受體表達(dá)

表2顯示，模型組大鼠下丘腦、胃和小腸組織的β－EP水平和μ受體表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 大鼠“納少”和“腹脹”評(píng)價(jià)(±s)

表1 大鼠“納少”和“腹脹”評(píng)價(jià)(±s)

注:與對(duì)照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

表2 2組大鼠相關(guān)組織β-EP水平及μ受體表達(dá)(±s)

表2 2組大鼠相關(guān)組織β-EP水平及μ受體表達(dá)(±s)

注:與對(duì)照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為脾主運(yùn)化，為氣血生化之源，實(shí)際上認(rèn)為脾主導(dǎo)機(jī)體的能量攝入，是維持能量穩(wěn)態(tài)的重要因素。從神經(jīng)生理學(xué)的角度來(lái)說(shuō)，能量穩(wěn)態(tài)主要受控于下丘腦的攝食神經(jīng)元和厭食神經(jīng)元［9］。POMC神經(jīng)元為厭食神經(jīng)元，能夠合成釋放β－EP抑制攝食神經(jīng)元，降低食欲，減少食物攝取。腸神經(jīng)系統(tǒng)受下丘腦影響，除合成釋放經(jīng)典的神經(jīng)遞質(zhì)外，還能夠通過(guò)釋放β－EP，直接或間接地抑制胃腸電活動(dòng)，減少乙酰膽堿分泌，增強(qiáng)環(huán)形肌張力，減弱縱行肌收縮力，引起胃腸運(yùn)動(dòng)停滯［4］。因此，β－EP可以在中樞和胃腸道兩個(gè)方面影響進(jìn)食行為。

研究發(fā)現(xiàn)，禁食和運(yùn)動(dòng)能夠誘發(fā)β－EP過(guò)度釋放。自愿堅(jiān)持5 d以上禁食的患者，其血漿β－EP顯著上升［5］，體育鍛煉或高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)也能促進(jìn)β－EP釋放［6－10］。由于禁食和疲勞也是引起脾氣虛的常見(jiàn)病因，本實(shí)驗(yàn)就采用這兩種因素成功復(fù)制了大鼠的脾氣虛模型，特別是大鼠進(jìn)食水量明顯減少，表明其出現(xiàn)“納少”的類人癥狀。此外，本實(shí)驗(yàn)還觀察到該組大鼠的胃殘留率變小，小腸推進(jìn)率顯著下降，提示大鼠還存在“腹脹”現(xiàn)象，即脾氣虛大鼠同時(shí)出現(xiàn)“納少”和“腹脹”現(xiàn)象。由于高水平的β－EP能夠抑制食欲，減慢胃腸運(yùn)動(dòng)，因此推測(cè)其參與了脾氣虛納少和腹脹的形成。

首先在下丘腦方面，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到模型組大鼠下丘腦β－EP水平和μ受體表達(dá)均顯著升高，提示脾氣虛狀態(tài)下POMC神經(jīng)元功能亢進(jìn)，β－EP被大量合成釋放，結(jié)合其高表達(dá)的受體后能夠強(qiáng)化對(duì)攝食神經(jīng)元的抑制。研究發(fā)現(xiàn)，β－EP能夠直接激活K+通道，促進(jìn)K+外流，使攝食神經(jīng)元超極化，降低其興奮性，還可以抑制攝食神經(jīng)元胞內(nèi)cAMP合成，削弱其合成釋放相關(guān)的促食欲成分［11］。由此推測(cè)脾氣虛時(shí)，下丘腦的厭食神經(jīng)元興奮，進(jìn)食神經(jīng)元抑制，引起食欲下降。其次，本實(shí)驗(yàn)觀察到，模型組大鼠的胃腸組織中β－EP及μ受體表達(dá)水平也顯著升高，推測(cè)脾氣虛時(shí)腸神經(jīng)系統(tǒng)中β－EP能神經(jīng)元功能增強(qiáng)，大量釋放β－EP，與高表達(dá)的μ受體結(jié)合后可以抑制胃腸電活動(dòng)，干擾胃腸動(dòng)力，導(dǎo)致食物推進(jìn)障礙，出現(xiàn)腹脹。因此本研究認(rèn)為，β－EP過(guò)度釋放參與了脾氣虛納少和腹脹的形成。

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(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110847)

目的:研究β－內(nèi)啡肽(β－endorphin，β－EP)與脾氣虛納少和腹脹的關(guān)系。方法:20只雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和脾氣虛模型組(模型組)，每組10只;代謝籠檢測(cè)大鼠24 h進(jìn)食/水量，炭末法評(píng)估胃殘留率和小腸推進(jìn)率，ELISA法檢測(cè)下丘腦、胃和小腸組織β－EP含量，免疫組化法檢測(cè)下丘腦、胃和小腸組織中μ受體表達(dá)。結(jié)果:模型組大鼠的進(jìn)食/水量顯著下降，小腸推進(jìn)率明顯下降，下丘腦、胃和小腸組織中β－EP水平和μ受體表達(dá)顯著增加。結(jié)論:β－EP過(guò)度釋放參與了脾氣虛納少和腹脹的形成。

脾氣虛;β－內(nèi)啡肽;納少;腹脹;μ受體

Over-relasing of β-endorphin Involves in the Formation of Both the Poor Appetite and Abdominal Distension in Spleen Qi Deficiency

WANG Ling－zhi，CHAI Ji－yan，LIU Xu－dong，LIU Wen－jun，ZHAO Jin－ru，
WANG Shou－yan，SHAN De－h(huán)ong，ZHANG Li－de，WANG De－shan△
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning Shenyang 110847，China)

Objective:To study the relation of β－endorphin(β－EP)in the formation of both the poor appetite and abdominal distension in spleen qi deficiency.Methods:20 male SD rats were randomly divided into the control and spleen qi deficiency group(model group)，10 rats each group;metabolic cages were used to detect rat food and water intakes per day;carbon propulsion rate were applied to check the stomach residual rate and small intestine(SI)propelling rate (SIPR);ELISA and immohistochemistry were separately used to measure β－EP concentrations and μ receptor expressions in hypothalamic，stomach and SI tissues.Results:compared with those in the control，model rats significantly showed less food and water intake，reduced SIPR，and enhanced β－EP concentrations and μ receptor expressions of in the hypothalamic，stomach and SI tissues.Conclusion:the overrelease of β－EP involves in the formation of both the poor appetite and abdominal distension in spleen qi deficiency.

Spleen qi deficiency;β－EP;Poor appetite;Abdominal distension;μreceptor

R2－031

B

1006－3250(2017)02－0184－03

2016－07－25

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃) (2013CB531702)－“脾主運(yùn)化、統(tǒng)血”等脾藏象理論研究

王凌志(1977－)，男，遼寧沈陽(yáng)人，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)防治心身疾病的臨床與研究。

△通訊作者:王德山(1951－)，男，遼寧大連人，教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)藥調(diào)控消化吸收的機(jī)制研究，Tel:13889217511，E－mail:wwddss5768@163.com。