孫菲菲 胡松群 張潔 吳笛 張啟成 盛菊萍 張魯平

南通大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（南通226001）

·臨床研究·

高通量基因捕獲測(cè)序技術(shù)在一遺傳性耳聾大家系中的應(yīng)用

孫菲菲 胡松群 張潔 吳笛 張啟成 盛菊萍 張魯平

南通大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（南通226001）

目的分析一個(gè)常染色體顯性遺傳性非綜合征耳聾大家系的臨床特征，進(jìn)行候選致病基因的突變篩查。方法對(duì)家系成員進(jìn)行病史采集、全身檢查、聽(tīng)力學(xué)評(píng)估及顳骨CT檢查；抽提家系成員外周血基因組DNA；整理分析家系資料繪制系譜圖；使用定向捕獲聯(lián)合二代測(cè)序技術(shù),對(duì)包括所有已知非綜合性耳聾的137個(gè)耳聾相關(guān)基因的外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子序列進(jìn)行篩查；對(duì)可疑基因進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果該家系共4代，現(xiàn)存家系成員28人，系譜分析符合常染色體顯性遺傳特征。參與本研究的耳聾患者9人，均為語(yǔ)后聾，均表現(xiàn)為遲發(fā)性、漸進(jìn)性聽(tīng)力下降，發(fā)病年齡6～18歲，聽(tīng)力曲線(xiàn)多為平坦型。先證者（Ⅳ-4）檢測(cè)結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)分析濾過(guò)后確定2個(gè)潛在基因致病突位點(diǎn):MYH14,c.359C＞T,p.S120L;COL11A2,c.4478G＞A,p.R1493Q。后續(xù)經(jīng)直接測(cè)序驗(yàn)證,在該家系中，只有MYH14,c.359C＞T變異和家系的表型共分離，其余1個(gè)可疑突變位點(diǎn)在家系中無(wú)共分離現(xiàn)象。結(jié)論本研究鑒定了一個(gè)常染色體顯性遺傳性非綜合征耳聾大家系的致病突變（MYH14,c.359C＞T），同時(shí)證實(shí)高通量基因捕獲測(cè)序技術(shù)是遺傳性耳聾的一種行之有效的分子診斷工具。

常染色體顯性遺傳；耳聾；家系；外顯子捕獲；基因突變

1 Nantong science and technology plan frontier and key technology innovation fund（MS22015048）；2；the postgraduate innovation program from Nantong University,YKC16110；3 National Science Foundation of China 81641155.

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest

遺傳性耳聾具有很高的遺傳異質(zhì)性，目前已成功定位超過(guò)170個(gè)非綜合征耳聾基因位點(diǎn)，成功克隆的非綜合征性耳聾基因超過(guò)80多個(gè)，常染色體隱性和顯性遺傳性非綜合征耳聾的基因座位已經(jīng)分別排序到DFNB103和DFNA67（http://hereditary?hearingloss.org）。在這樣的背景下，采用傳統(tǒng)方法對(duì)所收集的耳聾家系進(jìn)行基因鑒定，往往既耗時(shí)又成本高。目標(biāo)基因外顯子捕獲及測(cè)序（targeted next-generation sequencing）技術(shù)的快速發(fā)展，為解決上述棘手問(wèn)題提供了契機(jī)[1-3]。本文利用高通量基因捕獲測(cè)序技術(shù)，成功鑒定了一個(gè)常染色體顯性遺傳性非綜合征耳聾大家系的突變基因，結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1家系資料的采集

本研究家系位于江蘇省鹽城市，命名為YC-1家系。先證者為24歲的女性，因聽(tīng)力下降伴耳鳴就診于南通大學(xué)附屬醫(yī)院耳科門(mén)診，純音測(cè)聽(tīng)發(fā)現(xiàn)雙耳輕度感音神經(jīng)性耳聾。經(jīng)詢(xún)問(wèn)家族史得知，患者父親及直系家屬中多人患有聽(tīng)力障礙。遂進(jìn)一步對(duì)先證者及其父親進(jìn)行詳細(xì)的病史采集和臨床檢查；并通過(guò)先證者父親的幫助，獲得家系其他成員的臨床資料。家系成員在家系調(diào)查時(shí)，均通過(guò)詳細(xì)的病史采集（一般情況、聽(tīng)力損失的起病年齡及誘因、進(jìn)展情況、有無(wú)耳鳴、眩暈等伴隨癥狀、耳毒性藥物、既往有無(wú)系統(tǒng)性疾病及噪聲接觸史等）、體格檢查（對(duì)所有的家系成員進(jìn)行全身體檢，特別關(guān)注毛發(fā)、皮膚、視力、眼底、虹膜的顏色、脊柱、外周神經(jīng)的發(fā)育情況、智力、言語(yǔ)發(fā)育情況，排除綜合癥型遺傳性耳聾）、聽(tīng)力學(xué)檢查及相關(guān)特殊檢查情況。為排除耳部器質(zhì)性病變，對(duì)先證者及部分患者做了顳骨高分辨率CT掃描。家系成員均抽取外周靜脈血6ml(采血管含EDTAK2抗凝劑)，提取基因組DNA備用。本研究得到受試者的知情同意及南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)倫理論證認(rèn)可。

1.2聽(tīng)力學(xué)檢查及耳聾表型的分析

對(duì)納入研究的家系成員進(jìn)行如下檢查①純音測(cè)聽(tīng)檢查，初步判斷聽(tīng)力損失程度；②聲導(dǎo)抗檢查(包括鼓室導(dǎo)抗圖、鼓室壓力、聲順值、聲反射)，了解中耳傳導(dǎo)狀況；③耳聲發(fā)射檢測(cè)耳蝸外毛細(xì)胞功能；④聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位進(jìn)行聽(tīng)性腦反應(yīng)(ABR)閾值篩查，綜合上述檢查排除聽(tīng)神經(jīng)病，本研究耳聾表型分析判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Van Camp等2003年提出的《非綜合征型遺傳性耳聾家系遺傳及聽(tīng)力學(xué)描述術(shù)語(yǔ)建議案》，詳見(jiàn)（http://hereditaryhearingloss.org）。應(yīng)用Cyrillic 2.1軟件，根據(jù)家系調(diào)查和聽(tīng)力結(jié)果繪制系譜圖，對(duì)家系的遺傳特征進(jìn)行分析。

1.3候選致病基因突變篩查

通過(guò)北京邁基諾基因科技有限責(zé)任公司開(kāi)發(fā)的耳聾芯片，定向捕獲138個(gè)耳聾相關(guān)基因的外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子序列，其中包括所有已知的非綜合征耳聾基因。二代測(cè)序數(shù)據(jù)分析后得到的疑似致病基因突變位點(diǎn)，再通過(guò)常規(guī)Sanger測(cè)序方法，驗(yàn)證該位點(diǎn)在家系所有成員中與耳聾表型的共分離情況。待驗(yàn)證基因突變位點(diǎn)的擴(kuò)增引物序列如下：COL11A2正反向引物：5＇-AGGACCGGT?GAAAAGGAAAA-3＇，5＇-CATCTTGGAGCCTG?GACCTA-3＇；MYH-14正反向引物：5＇-GAGCTTCAC?GGGTTCGAG-3＇，5＇-CAGTAGGTTCCGAGGCT?GTC-3＇。PCR的擴(kuò)增的反應(yīng)條件簡(jiǎn)述如下：95℃預(yù)變性10min后，94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸45s，3個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，5個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，10個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，17個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后再72℃延伸5min，4℃保存。

2 結(jié)果

2.1家系表型特征

該家系居住于江蘇省鹽城市，共4代33人，現(xiàn)存家系成員3代28人，其中直系親屬19人，9人患病，系譜分析符合常染色體顯性遺傳特征（圖1）。該家系確診的9例感音神經(jīng)性聾患者，年齡10～84歲，患者臨床表現(xiàn)以遲發(fā)性聽(tīng)力下降為主，其他系統(tǒng)未見(jiàn)異常。家系成員中4人有耳鳴病史，均無(wú)前庭功能障礙。9例患者均無(wú)耳毒性藥物接觸史，無(wú)噪聲接觸史，均無(wú)智力障礙。對(duì)先證者（Ⅳ-4）和另外2位家系成員（Ⅱ-5，Ⅲ-3）行顳骨高分辨率CT掃描，未發(fā)現(xiàn)中耳、內(nèi)耳結(jié)構(gòu)異常及內(nèi)聽(tīng)道的占位病變。該家系確診的9例患者聽(tīng)力損失表現(xiàn)較為一致，均為語(yǔ)后聾，表現(xiàn)為遲發(fā)性、進(jìn)行性、雙側(cè)對(duì)稱(chēng)性，發(fā)病年齡9～18歲，聽(tīng)力曲線(xiàn)多為平坦型。開(kāi)始為輕度聽(tīng)力損失，聽(tīng)力損失程度隨年齡而加

圖1 YC-1家系系譜圖Fig.1 Pedigree of family YC-1

圖2 家系YC-1患病成員的聽(tīng)力-年齡對(duì)應(yīng)圖Fig.2 Audiograms of the family YC-1.Hearing thresholds were averages of both ears.All affected members exhibited symmetric audiometric confguration.

圖3 MYH-14及COL11A2基因測(cè)序結(jié)果，箭頭示突變位點(diǎn)Fig.3 Chromatograms of the mutant and wild-type sequences.Sanger sequencing results of the c.359C＞T mutation in the MYH14 gene and c.4478G＞Ain the COL1A2 gene.

2.2候選致病基因篩查結(jié)果

使用定向捕獲聯(lián)合二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)先證者（Ⅳ-4）進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)數(shù)據(jù)分析濾過(guò)后確定2個(gè)潛在致病突位點(diǎn)，結(jié)果為MYH-14,c.359C＞T,p.S120L; COL11A2,c.4478G＞A,p.R1493Q。后續(xù)經(jīng)直接測(cè)序驗(yàn)證（圖3）,在該家系中，只有MYH14變異和家系的表型共分離，后者在家系中無(wú)共分離現(xiàn)象；同時(shí)，比較不同物種MYH14基因編碼的蛋白質(zhì)的差異以進(jìn)行保守性分析，結(jié)果顯示MYH14蛋白120位上的絲氨酸高度保守[2]。

3 討論

2004年Donaudy F等[4]首次確認(rèn)MYH14基因是DFNA4型耳聾的致病基因，MYH14位于19號(hào)染色體，屬于3個(gè)編碼非肌肉肌球蛋白重鏈的基因(MYH9，MYH10，MYH14)之一，在人和小鼠組織中廣泛表達(dá)。在小鼠內(nèi)耳中，Myh14在耳蝸的柯蒂氏器、血管紋和蝸管都有表達(dá)，前庭不表達(dá)，這也解釋了該基因突變引起的耳聾都不伴周?chē)匝灠Y狀。

迄今發(fā)現(xiàn)MYH14基因7個(gè)突變位點(diǎn)（p.S7X、p. A181T、p.S120L、p.G376C、p.D529N、p.R726S和p. L976F）可以引起非綜合征耳聾[4-8]，1個(gè)突變位點(diǎn)（p. R941L）與遺傳性運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)性疾病（HMSN，Hereditary motor and sensory neuropathy）有關(guān)[9]。本研究與Yang[5]等對(duì)一個(gè)德國(guó)耳聾家系的研究，以及國(guó)內(nèi)楊嶸等[6]采集的耳聾大家系的研究結(jié)果一致，以上三個(gè)家系的致病突變都是MYH14基因（p. S120L突變），上述研究提示p.S120可能是MYH14的熱點(diǎn)突變，該推測(cè)仍需今后研究進(jìn)一步證實(shí)。該家系與國(guó)內(nèi)的其他報(bào)道[6]，來(lái)自于同一地方（江蘇鹽城），提示在該地區(qū)的遺傳性耳聾患者中，可以重點(diǎn)篩查MYH14（p.S120突變）。

既往研究發(fā)現(xiàn)的MYH14基因突變位點(diǎn)，幾乎都是通過(guò)大遺傳家系連鎖定位分析候選基因篩查法發(fā)現(xiàn)的[4-6,9]。正如最近戴樸教授提出[2]，高通量測(cè)序的發(fā)展為遺傳性耳聾的診斷帶來(lái)了巨大的機(jī)遇，此項(xiàng)技術(shù)使同時(shí)篩查所有耳聾相關(guān)基因變得簡(jiǎn)便可行。本研究采取該技術(shù)，主要基于如下原因：①盡管連鎖分析仍是遺傳學(xué)研究最有力的工具之一，但對(duì)于研究者而言，需要花費(fèi)相當(dāng)?shù)娜肆ξ锪?，耗時(shí)長(zhǎng)；②隨著耳聾基因越來(lái)越多地被發(fā)現(xiàn)，所研究家系已知耳聾基因突變致病的幾率越來(lái)越大，成功鑒定家系致病突變的可能性隨之也大大增加；③該技術(shù)可以通過(guò)對(duì)家系中多個(gè)耳聾患者和正常聽(tīng)力成員的檢測(cè)，觀(guān)察有無(wú)共分離，提高確定致病性突變的效率。本研究即采取這種策略，對(duì)先證者（Ⅳ-4）進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)數(shù)據(jù)分析濾過(guò)后確定2個(gè)潛在致 病 突 變 位 點(diǎn):MYH14,c.359C＞T,p.S120L; COL11A2,c.4478G＞A,p.R1493Q；通過(guò)PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序驗(yàn)證先證者(Ⅳ-4)的二代測(cè)序結(jié)果無(wú)誤；后續(xù)在該家系中經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，只有變異（MYH14,p.S120L）和家系的表型共分離，突變位點(diǎn)（COL11A2,p.R1493Q）在家系中不共分離，從而排除了其致病可能；經(jīng)保守分析，突變的氨基酸在不同物種間具有高度保守性[5]；從國(guó)內(nèi)外的報(bào)道[5,6]該突變又得到不同人種耳聾家系的證實(shí)，以上都是p. S120L是一個(gè)致病性錯(cuò)義突變的有力證據(jù)，其確切的致病機(jī)制仍需要進(jìn)一步的功能試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。需要指出的是當(dāng)前高通量測(cè)序技術(shù)也存在一定的局限性，也有假陽(yáng)性和假陰性的困擾，假陽(yáng)性影響較小，可以通過(guò)Sanger測(cè)序驗(yàn)證排除；假陰性處理目前困難，主要是由于該技術(shù)本身的局限造成，如對(duì)于如較長(zhǎng)片段插入或缺失突變的檢測(cè)效能有限、不能檢測(cè)內(nèi)含子突變、少量基因編碼區(qū)域(如極高GC含量區(qū)域)檢測(cè)的遺漏等。慶幸的是，既往研究表明遺傳性耳聾基因的致病突變絕大多數(shù)位于編碼區(qū)域，突變又以點(diǎn)突變和小片段的插入或缺失常見(jiàn)，使用該策略，國(guó)內(nèi)外已有多例成功案例報(bào)道[1,2]。

綜上所述，我們采集到一個(gè)常染色體顯性遺傳非綜合征型遲發(fā)性耳聾大家系，應(yīng)用高通量基因捕獲測(cè)序技術(shù)，成功鑒定了該耳聾大家系的致病基因突變；本研究結(jié)果還證實(shí)了該技術(shù)是臨床聾病分子診斷行之有效的檢測(cè)手段，該技術(shù)的臨床推廣應(yīng)用為耳聾患者的精準(zhǔn)診療打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，可望為耳聾家庭帶來(lái)福祉。

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A next-generation sequencing gene panel for molecular diagnosis in a large Chinese family with autosomal dominant hearing loss

Sun Feifei,Hu Songqun,Zhang Jie,Wu Di,Zhang Qicheng,Sheng Juping,Zhang Luping
Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001,China Corresponding author:Zhang Luping Emial:zhanglp910@126.com

Objective To investigate the clinical features of a large Chinese family with progressive autosomal dominant hearing loss,and to search for candidate mutational genes.Methods Collections of detailed medical history, physical examinations,audiologic testing,and CT scan of the temporal bones were performed,and genomic DNA was extracted from peripheral blood samples of the family members.The inheritance model of the family was evaluated.137 deafness genes of the proband were captured and sequenced by targeted next-generation sequencing(NGS),and the results were confirmed by Sanger sequencing．Results This family has 28 members in 4 generations,of whom 9 persons are affected.All affected family members exhibit late-onset,progressive non-syndromic sensorineural hearing loss.The ages of onset were between 6 and 18 year-old.Two heterozygous missenses(MYH14 mutation c.359C＞T and COL11A2 c.4478G＞A)were identified.Variants were further confirmed by Sanger sequencing.Only the MYH14 mutation was co-segregated with autosomal dominant hearing loss phenotype.Conclusions The heterozygous MYH14 mutation c.359C＞T is responsible for the autosomal dominant sensorineural hearing loss in this Chinese family,and this report confirms that targeted NGS technique is a feasible and more cost-effective tool to detect causative mutations in hereditary hearing loss.

Autosomal dominant inheritance；Hereditary hearing loss；Pedigree；Targeted exome sequencing；Gene mutation

R764.43

A

1672-2922（2017）01-57-4

2016-06-20審核人：袁永一）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.01.012

1南通市科技計(jì)劃前沿與關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新基金（MS22015048）；2南通大學(xué)研究生科研創(chuàng)新資助項(xiàng)目（YKC16110）；3國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81641155）

孫菲菲，碩士研究生在讀，研究方向:聾病的分子生物學(xué)

張魯平，Email:zhanglp910@126.com