肖 偉， 羅 藝

小鼠局灶性腦缺血再灌注后IL-33及其受體的時程表達

肖 偉1， 羅 藝2

目的 檢測白細胞介素-33(IL-33)及其膜受體ST2和可溶型受體sST2在小鼠局灶性腦缺血再灌注后不同時程的表達特征。方法 利用線栓法閉塞大腦中動脈(MCAO)30 min誘導建立小鼠可逆性局灶性腦缺血再灌注損傷模型，通過半定量RT-PCR檢測腦缺血再灌注后6 h、24 h和3 d缺血腦組織中IL-33及其膜受體ST2、凋亡相關蛋白Caspase-8和Caspase-3的mRNA表達水平，并通過免疫組織化學染色觀察了IL-33在不同缺血腦區(qū)(運動皮質、感覺皮質、海馬和紋狀體)的時程表達情況；ELISA法檢測了小鼠MCAO模型再灌注后不同時間點血清中IL-33及其可溶型受體sST2的表達水平。結果 IL-33 mRNA在缺血后6 h和3 d表達減少，但在24 h無明顯改變；凋亡相關蛋白Caspase-3和Caspase-8 在缺血后3個時間點均顯著增高，且Caspase-3在6 h和3 d的m RNA表達水平較24 h高；ST2 mRNA在缺血后6 h無減少，但在24 h和3 d有明顯減少；除了MCAO 24 h組運動皮質和紋狀體陽性染色增加外，IL-33陽性細胞數在缺血后不同時程各腦區(qū)均有不同程度減少；缺血后外周血中IL-33的表達量無明顯升高或降低，而sST2的表達水平在缺血后6 h即已顯著升高。結論 腦缺血再灌注后IL-33/ST2信號通路被下調，其與sST2表達增多的效應發(fā)揮和神經元凋亡有關。

腦缺血再灌注； 大腦中動脈栓塞； 白細胞介素-33； ST2受體； 神經元凋亡

Neuronal apoptosis

白細胞介素(Interleukin，IL)-33是近年來發(fā)現的IL-1家族新成員，它作為細胞因子，可通過IL-33/ST2信號通路促進Th2型免疫反應，同時也是一種核蛋白，可參與調控基因轉錄[1，2]。在炎性刺激下，IL-33還可以作為一種“警報素”警示組織損傷或應激[3]。IL-33是ST2受體的唯一特異性配體，其生物學活性的發(fā)揮主要依賴于和跨膜型ST2受體(ST2)的結合，另有一種可溶型ST2(sST2，可溶性血清基質裂解素)作為IL-33的誘騙受體可抑制IL-33/ST2信號轉導[4]。IL-33調節(jié)免疫反應的作用具有多樣性，取決于不同的疾病和模型。IL-33可促進Th2型炎癥性疾病的發(fā)病，如哮喘、特應性皮炎和過敏反應等，然而在一些與Th2型免疫反應相關的疾病或模型，如動脈粥樣硬化、多發(fā)性硬化和實驗性腸炎等，IL-33可通過促進Th1/Th2平衡向Th2偏移而起到保護性作用[4]。此外，新近研究還發(fā)現了IL-33可調節(jié)Th17型免疫應答[5]。IL-33在多組織器官高表達，而腦和脊髓是IL-33表達量最高的器官之一，提示IL-33在調節(jié)中樞神經系統(tǒng)(CNS)的病理生理學過程中可能起著重要作用[1]。近年來，有關IL-33或IL-33/ST2信號通路在中樞神經系統(tǒng)疾病中的作用是神經免疫學的研究熱點之一。

缺血性腦卒中是中老年人常見的腦血管疾病，可以導致腦組織損傷并伴隨炎癥反應，從而引發(fā)一系列癥候群。研究表明，中國北方人群IL-33基因單核苷酸多態(tài)性與缺血性腦卒中具有相關性，提示了IL-33可能參與了缺血性腦卒中的炎性病理過程[6]。另有一項研究則發(fā)現，急性腦梗塞患者血清中IL-33水平顯著升高[7]。有研究還發(fā)現，IL-33的表達減少加劇了糖尿病模型小鼠缺血再灌注誘導的心肌損傷，提示了其對缺血再灌注損傷可能是一個保護性因素[8]。新近一項臨床研究顯示，血清IL-33低水平表達與急性缺血性腦卒中患者的大梗死面積和疾病嚴重程度相關[9]。而我們先前的研究也提示，IL-33可通過促進Th2應答和抑制Th17應答而緩解缺血性腦損傷[10]。由此可見，IL-33/ST2信號通路在缺血性腦卒中的發(fā)病機制中具有重要作用。本研究擬在缺血性腦卒中動物模型的基礎上，較為全面地分析IL-33及其受體ST2和sST2在腦缺血再灌注后不同時程的表達規(guī)律，為進一步認識IL-33/ST2信號通路在缺血性腦損傷發(fā)病中的具體作用提供科研數據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 健康雄性C57BL/6小鼠(武漢大學動物實驗中心，使用許可證號：SYXK(鄂)2004-0025)，8～10 w齡，體重22～28 g，飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗環(huán)境中，自由攝食和飲水；栓線(北京東沙生物技術有限公司，型號1620-A4)；VECTASTAIN ABC免疫組化試劑盒(Vector Laboratories)；小鼠IL-33抗體(R&D Systems)；TRIZOL試劑盒(MRC公司)；PrimerScriptTMRT Master Mix試劑盒(Takara)；小鼠IL-33和小鼠sST2 ELISA檢測試劑盒(上海西唐生物)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大腦中動脈栓塞(MCAO)模型的制備 參照Zea Longa等建立的大腦中動脈內栓線阻斷法，并結合我們之前的工作基礎做適當改進[11，12]。10%水合氯醛溶液(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉動物。麻醉后小鼠仰臥位固定，頸部正中切開皮膚，鈍性分離各層組織，暴露右側頸總動脈(CCA)，并分離至頸內動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)分叉后一段，置線備用。注意仔細分離以避免損傷迷走神經和氣管。用微動脈夾暫時夾住頸內動脈，近心端結扎頸總動脈和頸外動脈。于頸總動脈上剪開一小口，將直徑為0.16 mm的尼龍栓線(線頭直徑0.20 ± 0.01 mm)經頸總動脈和頸內動脈插入至大腦中動脈起始部，阻斷右側大腦中動脈血流。栓線插入深度距頸外動脈和頸內動脈分叉處為(10±0.5)mm。結扎頸內動脈以固定栓線和防止出血。栓塞30 min后緩慢拔出栓線以實現再灌注。假手術組只進行術前麻醉和血管分離術，不結扎及導入線栓。將小鼠隨機分為假手術組和MCAO模型組，每組再根據術后存活時間分為6 h、24 h和3 d三個亞組，每個時間點6～8只。

1.2.2 神經行為學評估 我們采用Zea Longa評分法對MCAO模型動物的神經行為學進行評估，并加以改進[11]。于處死前進行神經功能評分(雙盲法)，以判斷模型是否成功。評分標準如下：0分，無神經系統(tǒng)功能缺失癥狀，活動正常；1分，輕度局灶性神經功能缺陷，提鼠尾離地時手術對側前肢屈曲內收；2分，中度局灶性神經功能缺陷，行走時小鼠向手術對側轉圈；3分，重度局灶性神經功能缺陷，行走時小鼠肢體向手術對側傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失；5分，死亡。分值越高，說明其神經功能損傷越嚴重，評1～3分視為制備成功的MCAO模型。評為0分、4分或提前死亡的動物均棄之不用。

1.2.3 RT-PCR半定量檢測 于MCAO模型組術后相應時間點(6 h，24 h和3 d)取缺血側腦組織勻漿(假手術組取同側腦組織勻漿)，按TRIZOL試劑盒說明書提取總mRNA。然后按逆轉錄試劑盒說明書合成第一鏈cDNA，用于PCR反應擴增目的基因IL-33、ST2、Caspase-8和Caspase-3(引物序列見表1)。PCR反應體系(25 L)包括：cDNA模板 1 L、雙蒸水 8.5 L、2 × PCR mix 12.5 L、上下游引物各1.5 L。PCR反應條件為：94 ℃ 預變性4 min后進入循環(huán)94 ℃變性 1 min，55 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸40 s共35個循環(huán)，最后再延伸72 ℃ 10 min。擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并采用Quantity One對條帶進行光密度分析。

表1 RT-PCR擴增目的基因的引物序列

1.2.4 免疫組織化學染色 全部實驗動物存活至相應時間點時，在10%水合氯醛深度麻醉下，自左心室通過靜脈套管快速灌注生理鹽水沖洗，待流出清亮液體后，灌注4%多聚甲醛固定液固定15 min。完整取出腦組織，沿冠狀面切取視交叉前后約3 mm厚的腦組織塊，并置于上述固定液中后固定48 h后再移入30%蔗糖溶液中。待組織塊沉底后經恒低溫冰凍切片機作冠狀面連續(xù)切片，片厚20 m。利用VECTASTAIN ABC免疫組化試劑盒(Vector Laboratories)進行免疫組織化學染色，單克隆羊抗小鼠IL-33抗體稀釋度為1：50(R&D Systems)。每組動物每個時間點隨機選取切片20張，每張切片觀察4個高倍鏡視野(200×)，用尼康圖像分析系統(tǒng)(NIS-Elements BR 3.1)進行圖像分析，記錄IL-33陽性細胞數。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 在小鼠MCAO模型缺血再灌注后相應時間點進行眼眶采血，室溫靜置30 min后，1500 r/min 離心10 min，收集血清保存于-80 ℃。按ELISA試劑盒說明書采用雙抗體夾心法測定血清中IL-33和sST2水平。

2 結 果

2.1 動物神經行為學評分結果 采用改良的Zea Longa 0～5分評分標準，在MCAO各亞組和假手術各亞組的小鼠術前及處死前進行神經行為學癥狀的觀察及評估：(1)所有小鼠在造模前的評分應為0分，否則棄之不用；(2)假手術各亞組在處死前均未出現神經功能缺損體征，評為0分；(3)MCAO各亞組在處死前的Longa評分結果顯示，造模成功率即評為1～3分的小鼠只數百分比分別為：MCAO 6 h組76.2%，MCAO 24 h組72.7%和MCAO 3 d組66.7%(見表2)；(4)經統(tǒng)計學分析，各組造模成功小鼠的Longa評分分別為：MCAO 6 h組(2.6±0.2667)，MCAO 24 h組(2.875±0.125)，MCAO 3 d組(2.9167±0.193)，各組間評分無顯著學差異。結果表明，缺血再灌注后6 h到3 d神經功能缺失癥狀穩(wěn)定，并未出現加劇或好轉；(5)將造模成功的各亞組的小鼠隨機分為兩組，分別進行半定量RT-PCR和免疫組織化學染色，所有小鼠均眼眶采血收集血清。

表2 MCAO各亞組處死前的Zea Longa評分結果 (單位：只數)

ZeaLonga評分MCAO6hMCAO24hMCAO3d0分1～3分4～5分216321643165

2.2 IL-33及其受體ST2在缺血腦組織中的mRNA表達情況 提取MCAO模型缺血再灌注后6 h，24 h和3 d組缺血側腦組織總RNA，通過RT-PCR半定量檢測IL-33及其受體ST2 mRNA表達情況，對照為相應時間點的假手術組。此外，檢測了凋亡相關蛋白Caspase-3和Caspase-8在缺血后不同時程的mRNA表達情況，以分析IL-33表達與神經元凋亡的相關性。利用Quantity One軟件對目的基因和內參GAPDH的電泳條帶進行光密度比較及分析。結果顯示，與假手術組相比，ST2 mRNA在缺血后6 h無減少，但在24 h和3 d有明顯減少；IL-33 mRNA在缺血后6 h和3 d表達減少，但在24 h無明顯改變；凋亡相關蛋白Caspase-3和Caspase-8 在缺血后3個時間點均顯著增高，且Caspase-3在6 h和3 d的m RNA表達水平較24 h高(見圖1)。

2.3 IL-33在MCAO模型再灌注后不同時程各缺血腦區(qū)的表達情況 通過免疫組織化學染色ABC法對IL-33在短暫性腦缺血再灌注后不同時程不同腦區(qū)的表達情況進行了觀察。觀察的缺血側腦區(qū)包括：運動皮質、感覺皮質、海馬和紋狀體。DAB顯色陽性的細胞呈棕黃色顆粒，顯色陽性的毛細血管呈棕黃色桿狀。結果顯示，與假手術組相比，MCAO 6 h和MCAO 3 d組檢測到的IL-33陽性細胞數在四個腦區(qū)均有不同程度的減少(除了MCAO 6 h組運動皮質IL-33表達變化不甚明顯外)。

A：MCAO組和假手術組(Sham組)術后6 h、24 h和3 d腦組織中IL-33、ST2、Caspase-8和Caspase-3 mRNA表達的條帶圖示，以GAPDH作為內參；B：IL-33/GAPDH光密度比值柱狀圖；C：ST2/GAPDH光密度比值柱狀圖；D：Caspase-8/GAPDH光密度比值柱狀圖；E：Caspase-3/GAPDH光密度比值柱狀圖；表示該MCAO亞組與其相應Sham亞組比較，#表示該MCAO亞組與其它MCAO亞組比較*P<0.05

圖1 IL-33、ST2、Caspase-8和Caspase-3在腦缺血后不同時程的mRNA表達情況

Pmc：運動皮質；Psc：感覺皮質；Hi：海馬；Cpu：紋狀體；Sham：假手術組。黑色箭頭所指為染色陽性細胞，白色箭頭所指為免疫反應陽性的毛細血管。標尺：50 m(40倍鏡下)

圖2 IL-33在MCAO模型小鼠各缺血腦區(qū)的表達情況

圖示為血清中IL-33和sST2表達水平的統(tǒng)計柱狀圖。表示該MCAO亞組與其相應Sham亞組比較*P<0.05

組別(Groups)鼠數(n)PmcPscHiCpuMCAO6hMCAO24hMCAO3dSham5551256．48±5．30112．76±7．20?6．23±1．20#50．89±6．985．60±2．54#37．55±6．26#4．63±0．87#57．14±4．163．45±1．98#20．10±4．18#11．07±2．92#37．83±3．1440．75±5．53#129．81±7．67?29．33±4．50#88．42±5．54

記錄于×200高倍鏡視野下。Pmc：運動皮質；Psc：感覺皮質；Hi：海馬；Cpu：紋狀體；Sham：假手術組。*表示該組與假手術組相應腦區(qū)比較陽性細胞數增多，#表示該組與假手術組相應腦區(qū)比較陽性細胞數減少，P<0.05

在MCAO 24 h組，除了海馬和感覺皮質陽性染色減少比較明顯外，運動皮質和紋狀體的陽性細胞數反而顯著增加。此外，在MCAO 6 h組的感覺皮質和海馬和MCAO 24 h組的海馬還觀察到了免疫反應陽性的毛細血管(見圖2)。MCAO后不同時間點各腦區(qū)IL-33陽性細胞數的統(tǒng)計結果見表3所示。

2.4 MCAO模型缺血再灌注后不同時程血清中IL-33及其可溶型受體sST2的表達情況 通過ELISA法檢測了短暫性腦缺血再灌注后不同時程血清中IL-33和sST2的含量變化。結果顯示，缺血后外周血中IL-33的表達量無明顯升高或降低，而sST2的表達水平在缺血后6 h即已顯著升高(見圖3)。

3 討 論

缺血性腦卒中的病理生理分期不盡一致，綜合文獻報道可分為3期：超急性期(1～6 h)，病理改變可逆；急性期(12～24 h)，病變組織軟化，神經元大量壞死；延遲期(3～14 d)，病變組織液化，神經元凋亡，星形膠質細胞增殖[13]。結合在動物模型的可行性，本研究選擇MCAO模型缺血再灌注后6 h、24 h和3 d作為研究的時間點，以模擬短暫性腦缺血后從超急性期、急性期到延遲期的病變發(fā)展過程。本研究結果表明，腦缺血再灌注后IL-33/ST2信號通路被下調，其與sST2表達增多和神經元凋亡密切相關。

本研究首先對IL-33及其膜受體ST2在短暫性腦缺血后的核酸表達情況進行了檢測。結果顯示，IL-33和ST2在缺血后表達的總體趨勢是下降的，且IL-33隨時程的表達變化與細胞凋亡通路中的主要執(zhí)行基因Caspase-3的表達趨勢呈負相關的。IL-33和ST2在中樞神經系統(tǒng)的亞細胞定位尚無定論。有研究表明，IL-33蛋白在神經元和膠質細胞普遍表達，而ST2蛋白則僅表達于神經元[1]。但也有研究發(fā)現ST2在膠質細胞尤其是星型膠質細胞和小膠質細胞也有表達[14，15]。神經元凋亡或壞死以及膠質細胞的增殖活化是腦缺血后的重要病理生理學改變。因此，推測神經元凋亡或壞死可能是導致IL-33表達減少的主要原因。事實上，IL-33在細胞壞死時可被釋放出來作為alarmin警示組織損傷或炎癥，但在細胞凋亡時，IL-33被caspases剪切促其活性喪失和表達量減少，提示IL-33在神經元凋亡或壞死時可能表現出不同的改變[3，16，17]。在腦缺血急性期，神經元以大量壞死為主要病理改變，IL-33從壞死的神經元中釋放出來可能是導致IL-33在MCAO 24 h表達量基本正常的原因之一。基于IL-33和ST2受體的表達均減少，提示短暫性腦缺血后IL-33/ST2介導的Th2型免疫應答是下調的。

腦的功能是有定位的，不同腦區(qū)具有不同的功能。例如，大腦皮質主要參與運動及感覺功能，紋狀體參與運動和平衡功能，海馬與學習、記憶功能有關。在之前的研究中，我們發(fā)現短暫性腦缺血后運動皮質、感覺皮質、海馬和紋狀體的病理改變比較明顯[12]。因此在本研究中，我們還通過免疫組織化學染色法對這四個腦區(qū)缺血后IL-33的表達情況進行了初步觀察。結果發(fā)現，除了MCAO 24 h運動皮質和紋狀體表達增加外，缺血后IL-33在這四個腦區(qū)的表達改變趨勢都是減少的。IL-33在不同腦區(qū)的不同表達情況提示了IL-33與不同腦區(qū)的功能有相關性。海馬與學習、記憶以及情緒等功能密切相關，是對缺血最敏感的一個腦區(qū)。從MCAO 6 h到3 d組，海馬區(qū)IL-33的表達量都是減少的，提示IL-33與學習記憶可能有一定的相關性。阿爾茨海默病(AD)是一種以學習記憶和認知功能減退為主要表現的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病。之前有一項研究，發(fā)現AD患者腦組織中IL-33的表達水平明顯低于正常人群[18]，提示IL-33可能是AD的一個神經保護性因子。缺血性腦卒中也可以導致認知功能改變，即血管性癡呆(VaD)的發(fā)生[19]。結合本研究結果，推測IL-33與腦缺血后認知功能減退癥狀的發(fā)生有相關性。

近年來，IL-33及其可溶型受體sST2的血清表達水平與疾病的診斷、預后判斷等的相關性已逐漸受到關注，例如IL-33在預測糖尿病腎病并發(fā)癥中的作用、sST2受體作為判斷心力衰竭的生物學標記之一[20，21]。本研究還檢測了小鼠MCAO模型缺血再灌注后血清中IL-33和sST2的表達情況。結果顯示，缺血后外周血中IL-33的表達量無明顯升高或降低，而sST2的表達水平在缺血后6 h即已顯著升高。sST2受體是抑制IL-33/ST2信號轉導的誘導受體，本研究結果提示，短暫性腦缺血可誘導sST2表達急性升高，其可能是IL-33/ST2信號下調的原因之一，因此sST2是否可作為急性缺血性腦卒中早期輔助診斷和評價疾病嚴重程度的一種新型炎性標志物，需進一步驗證。

綜上所述，短暫性腦缺血后IL-33及其受體表達的時相特點提示IL-33/ST2信號通路在缺血性腦損傷的發(fā)病機制中可能具有重要意義；通過上調IL-33/ST2信號通路可能促進損傷后神經功能的恢復，這為缺血性腦損傷的治療開拓了新思路。

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Time course expression of Interleukin-33 and its receptors after focal cerebral ischemia/reperfusion in mice

XIAOWei，LUOYi.

(DepartmentofNephrology，TheCentralHospitalofWuhan，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430014，China)

Objective To examine the expression patterns of Interleukin(IL)-33 and its receptor ST2 and soluble ST2(sST2)in the different stages following transient cerebral ischemia. Methods Adult C57BL/6 mice were subjected to either sham-operation or middle cerebral artery occlusion(MCAO)for 30 min. At 6 h，24 h and 3 d after the onset of reperfusion，the expression levels of IL-33，ST2，Caspase-8 and Caspase-3 mRNA in the ischemic brains were examined by semi-quantitative RT-PCR. We also observed the expression of IL-33 in the different ischemic brain areas including the sensory and motor cortex，hippocampus and striatum(caudoputamen). Moreover，the serum levels of IL-33 and sST2 after MCAO in mice were determined by ELISA. Results Compared to the corresponding sham group，the mRNA level of IL-33 was significantly decreased at 6 h and 3 d after MCAO，but not at 24 h，while ST2 mRNA expression was down-regulated at 24 h and 3 d but not at 6 h after MCAO. The expression of Caspase-3 and Caspase-8 was significantly increased from 6 h after MCAO，and the level of Caspase-3 was higher at 6 h and 3 d than 24 h. Moreover，the numbers of IL-33-positive cells were decreased in the different ischemic brain regions，except for the motor cortex and striatum at MCAO 24 h. No obvious changes were examined in the serum level of IL-33，while the level of sST2 was significantly increased at 6 h after MCAO. Conclusion The IL-33/ST2 signaling pathway was down-regulated after cerebral ischemia/reperfusion，which was related to the increased expression of sST2 and neuronal apoptosis.

Cerebral ischemia/reperfusion； Middle cerebral artery occlusion； Interleukin-33； ST2 receptor；

2017-01-15；

2017-02-17

國家自然科學基金(No. 81501033)

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院風濕與腎內科，湖北 武漢 430014；2.武漢大學中南醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430071)

羅 藝，E-mail：luoyi929@aliyun.com

1003-2754(2017)03-0202-06

R743

A