段亞佼黃小麗詹瑰然樊 威段 靖趙一璘鄧永強(qiáng)耿 毅陳德芳汪開(kāi)毓

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水產(chǎn)系, 成都 611130; 2. 云南省會(huì)澤縣水產(chǎn)工作站, 曲靖 654200; 3. 四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,內(nèi)江 641000; 4. 四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心, 成都 610041; 5. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 成都 611130)

雜交鲇惡臭假單胞菌的分離鑒定及其病理?yè)p傷研究

段亞佼1黃小麗1詹瑰然2樊 威3段 靖1趙一璘1鄧永強(qiáng)4耿 毅5陳德芳1汪開(kāi)毓5

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水產(chǎn)系, 成都 611130; 2. 云南省會(huì)澤縣水產(chǎn)工作站, 曲靖 654200; 3. 四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,內(nèi)江 641000; 4. 四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心, 成都 610041; 5. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 成都 611130)

為確定一起雜交鲇皮膚潰瘍癥的病原, 實(shí)驗(yàn)從病魚(yú)體內(nèi)分離到幾株優(yōu)勢(shì)菌(DYJ140914-DYJ140917), 根據(jù)4株分離菌的形態(tài)、生理生化特性, 結(jié)合16S rRNA和gyrB基因序列測(cè)定(GenBank登錄號(hào)分別為KP693689和KP693690)與系統(tǒng)發(fā)育分析, 將其鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。在此基礎(chǔ)上以腹腔注射的方式進(jìn)行人工感染試驗(yàn), 證實(shí)其為雜交鲇潰瘍癥的病原菌。病魚(yú)組織器官具有典型的病理變化, 其主要靶器官為肝臟、皮膚肌肉以及腎間質(zhì), 分別引起多灶性壞死性肝炎、壞死性肌炎及壞死性間質(zhì)性腎炎。此外, 還可引起心外膜、心內(nèi)膜炎及壞死性脾炎。藥敏結(jié)果顯示該菌對(duì)強(qiáng)力霉素、諾氟沙星和左氧氟沙星等藥物敏感; 對(duì)青霉素、氟苯尼考、磺胺甲基異惡唑、頭孢西丁、阿奇霉素等藥物耐藥。

雜交鲇; 惡臭假單胞菌; 16S rRNA; gyrB; 病理?yè)p傷

惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)為一種革蘭氏陰性、需氧短桿菌, 隸屬于假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、假單胞菌屬(Pseudomonas), 是一種具有腐化作用的細(xì)菌, 常常存在于含氧的土壤及水環(huán)境中[1], 多為葡萄球菌性燙傷樣皮膚綜合征[2]、敗血癥[3]、化膿性中耳炎, 角膜鞏膜炎和由食物中毒導(dǎo)致的痢疾樣腹瀉等[4]人類(lèi)感染性疾病的病原體。該菌極易感染粒細(xì)胞缺乏癌患者[5,6]和新生兒[2]等免疫功能低下者, 并且還可以引起眼部及耳部感染、傷口感染等[7,8]。研究表明, 惡臭假單胞菌不僅可引起人類(lèi)臨床感染, 而且也可引起水生動(dòng)物感染發(fā)病?？蓪?dǎo)致香魚(yú)(Plecoglossus altivelis)、黃鰭短須石首魚(yú)(Umbrina roncador)、(Seriola quinqueradiata)[9]、大黃魚(yú)(Larimichthys crocea)、大鯢(Andrias davidianus)大規(guī)模死亡[10,11], 也可引起黑鯛(Sparus macrocephlus)腸胃炎[12], 歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)爛鰓病[13], 羅氏沼蝦(Macrobra'chiumrosenbergiideman)黃鰓、黑鰓病[14], 虹鱒(Oncorhynchus mykiss)皮膚嚴(yán)重潰瘍[15]等。

雜交鲇(Hybrid catfish)是國(guó)內(nèi)近年興起的養(yǎng)殖品種, 是由南方大口鲇(Silurus soldatovi meridionalis Chen, ♂)和本地鲇(Silurus asotus Linnaeus, ♀)雜交而成, 雜交優(yōu)勢(shì)明顯[16], 既具有大口鲇父本固有的個(gè)體大、生長(zhǎng)快、攝食力強(qiáng)和肉味鮮美的特點(diǎn), 又具有鲇母本固有的性情較溫和、同類(lèi)相殘力較弱、養(yǎng)殖成活率較高的特點(diǎn)[17]。因其肉質(zhì)鮮美, 嫩滑少刺而備受廣大消費(fèi)者青睞。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大, 雜交鲇的病害問(wèn)題日漸突出, 已經(jīng)嚴(yán)重影響了雜交鲇養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[18]。

2014年9月, 四川省眉山某養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖的雜交鲇出現(xiàn)了以皮膚褪色、潰爛為主要特征的疾病, 發(fā)病率達(dá)到85%以上, 死亡率達(dá)70%以上。為明確該病病原, 本研究從患病雜交鲇中分離出一株高致病性病原菌, 采用常規(guī)生理生化鑒定結(jié)合病理學(xué)診斷進(jìn)行初步鑒定, 對(duì)16S rRNA、gyrB基因進(jìn)行測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 對(duì)該菌做進(jìn)一步鑒定, 最終確診為惡臭假單胞菌感染, 同時(shí)檢測(cè)了藥物敏感性, 旨在為雜交鲇潰瘍病的正確診斷以及防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物具有典型患病癥狀的雜交鲇15尾, 取自四川眉山雜交鲇養(yǎng)殖場(chǎng), 體長(zhǎng)26—30 cm,用于剖檢觀察、病料采集和病原菌分離; 健康雜交鲇120尾(體長(zhǎng)20—25 cm), 取自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)基地, 用于回歸實(shí)驗(yàn)。

主要試劑腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(MH)、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、細(xì)菌生化微量鑒定管及抗生素藥敏紙片均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司; 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen); PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 尸檢

將患病雜交鲇用MS222麻醉后剖解, 依次觀察腹腔、胸腔、圍心腔內(nèi)各內(nèi)臟器官黏膜及大體病變情況。將鰓絲、消化道內(nèi)容物、體表黏液等置于載玻片上壓片鏡檢; 同時(shí)取腎臟于潔凈載玻片上制作組織觸片, 風(fēng)干后進(jìn)行diff-quick染色, 油鏡檢查。

1.3 病原菌分離

取具有典型癥狀的病魚(yú), 用無(wú)菌生理鹽水對(duì)病魚(yú)的體表進(jìn)行沖洗, 然后用滅菌剪刀打開(kāi)腹腔, 無(wú)菌環(huán)境下從腎和脾取樣, 于BHI平板上劃線(xiàn), 28℃培養(yǎng)24—48h, 觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)一步劃線(xiàn)純化, 獲得細(xì)菌純培養(yǎng)菌株, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分離菌生理生化鑒定

用BHI培養(yǎng)基, 28℃培養(yǎng)病原菌18—24h, 對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色, 在顯微鏡下觀察; 用接種針接種到細(xì)菌生化反應(yīng)微量鑒定管中, 28℃恒溫培養(yǎng)24h, 按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[19]的方法進(jìn)行主要理化特性檢測(cè)。

1.5 16S rRNA及gyrB基因序列測(cè)定和分析

病原菌DNA提取取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮菌液, 離心收集菌體, 使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)病原菌基因組DNA進(jìn)行提取。

PCR擴(kuò)增與測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析采用16S rRNA的通用引物[20](上游引物: 5′-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′, 下游引物: 5′-GGCTACCT TGTTACGACTT-3′)和gyrB基因通用引物[21](上游引物: 5′-GAAGGCGGNACNCAYGAAG-3′, 下游引物: 5′-CTTCRTGNGTNCCGCCTTC-3′)(Y代表C/T, R代表A/G, N代表A、T、C或G)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR反應(yīng)條件為: 94℃ 5min; 94℃ 1min, 54℃ 1min, 72℃ 2min, 30個(gè)循環(huán); 72℃ 10min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別約為1500與1200 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)為預(yù)期目的條帶后進(jìn)行純化,然后連接到pMD19-T載體(TaKaRa)并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)大腸桿菌中, 送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)定核苷酸序列。將病原菌的16S rRNA和gryB基因序列和已知GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列進(jìn)行Blast比對(duì), 同時(shí)保存同屬菌株的16S rRNA及gyrB序列信息, 利用MEGA 4.1和DNA Star 5.0軟件進(jìn)行序列同源性分析, 并用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 分離菌回歸感染實(shí)驗(yàn)

將菌株接種于BHI肉湯, 28℃搖床培養(yǎng)24h, 用麥?zhǔn)媳葷峁軐⒕簼舛日{(diào)至3.4×108、3.4×107、3.4×106、3.4×105和3.4×104CFU/mL, 分別經(jīng)腹腔注射健康的雜交鲇, 注射劑量0.1 mL/尾, 20尾/組。另選20尾魚(yú)每尾注射0.1 mL 0.65%無(wú)菌生理鹽水作為對(duì)照組。每天正常喂養(yǎng)、通氣換水, 并把實(shí)驗(yàn)組水溫控制在(20±1)℃, 詳細(xì)觀察魚(yú)的臨床表現(xiàn)并統(tǒng)計(jì)死亡情況, 連續(xù)觀察7d。

1.7 藥敏試驗(yàn)

采用瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)測(cè)定分離菌株對(duì)11種抗菌素的藥物敏感性。無(wú)菌環(huán)境下將菌接種在BHI肉湯中, 用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)菌液濃度至1.5×108CFU/ m,然后將稀釋后的菌液涂布于BHI平板上, 貼上藥敏紙片, 28℃培養(yǎng)24h后, 測(cè)定抑菌圈直徑并判定結(jié)果, 敏感度根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.8 組織病理?yè)p傷觀察

取患病癥狀明顯雜交鲇的皮膚肌肉、腦、心臟、鰓、腎、肝、脾、胃腸道等內(nèi)臟器官組織, 用10%的中性緩沖福爾馬林固定液固定, 酒精梯度脫水,二甲苯透明, 石蠟包埋、切片, 蘇木精-伊紅(HE)染色, 中性樹(shù)脂膠封片后, 顯微鏡觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 尸檢

患病雜交鲇魚(yú)體體表大面積多處褪色, 出現(xiàn)典型潰瘍?cè)? 眼睛周?chē)つw出血褪色, 嚴(yán)重潰瘍(圖1A); 魚(yú)體背部皮膚發(fā)白嚴(yán)重, 大面積深度潰爛(圖1B); 尾部出現(xiàn)潰瘍?cè)? 尾鰭潰爛(圖 1C); 剖解后觀察到肝臟腫大, 邊緣光滑, 質(zhì)硬; 脾臟邊緣鈍圓, 腫大。腎臟組織觸片diff-quick染色可見(jiàn)細(xì)胞間隙中存在多量桿狀細(xì)菌, 未觀察到寄生蟲(chóng)(圖 1D)。

圖 1 雜交鲇感染惡臭假單胞菌的主要剖解癥狀及腎臟觸片觀察Fig. 1 Major anatomy symptoms and kidney imprint of Pseudomonas putida infected with hybrid catfishA. 眼周潰瘍?cè)?★); B. 背部肌肉深度潰瘍(★), 出血; C. 尾鰭潰爛(★); D.腎臟觸片可見(jiàn)短桿菌(→)A. Ulceration of the skin around the eyes (★); B. Ulceration and discoloration of the dorsum skin (★); C. Caudal fin rot (★); D. Some bacterias and inflammatory cells in the Intercellular (→)

2.2 病原菌的分離純化與形態(tài)學(xué)特性

從患病15尾雜交鲇腎和脾中均分離獲得大量細(xì)菌, 其菌落形態(tài)基本一致, 在BHI平板上, 28℃培養(yǎng)24h后, 形成邊緣整齊, 濕潤(rùn), 呈圓形, 中央隆起,直徑1—2 mm淡黃色半透明的圓形菌落, 革蘭氏染色結(jié)果顯示為陰性, 短桿狀。選擇形態(tài)一致, 純度較高的優(yōu)勢(shì)菌保種備用, 共獲得4株分離菌, 分別命名為: DYJ140914、DYJ140915、DYJ140916、DYJ140917。

2.3 生化鑒定結(jié)果

結(jié)果表明, 4株分離菌的主要生化特性一致(表1), 根據(jù)其生長(zhǎng)特性及生理生化特征, 初步判定為惡臭假單胞菌(P. putida)。

2.4 16S rRNA和gyrB基因序列測(cè)定結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析

由于4株菌的主要生理生化特性完全一致, 故選擇其中一株菌(編號(hào)為DYJ140914)進(jìn)行16S rRNA和gyrB基因測(cè)序, 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出16S rRNA和 gyrB基因片段, 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè), 結(jié)果顯示該片段大小約為1427和1149 bp, 與預(yù)期相符。GenBank登錄號(hào)分別為KP693689和KP693690, 測(cè)序結(jié)果表明該產(chǎn)物序列與GenBank數(shù)據(jù)中心上的惡臭假單胞菌P. putida的同源性最高, 在以分離菌16S rRNA和gyrB序列及其GenBank中同源性較高的惡臭假單胞菌屬細(xì)菌16S rRNA及gyrB序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上(圖 2), 分離菌與惡臭假單胞菌聚為一族, 與來(lái)源與其他水生動(dòng)物的惡臭假單胞菌同源性達(dá)99.2%以上。

2.5 人工感染試驗(yàn)

在分離菌株經(jīng)人工感染后, 對(duì)雜交鲇有較強(qiáng)致病力。接種感染8h后, 雜交鲇呼吸頻率加快, 游動(dòng)緩慢無(wú)力, 在水中呈垂懸姿勢(shì)游動(dòng), 隨病情發(fā)展, 部分雜交鲇體表出現(xiàn)不同程度的皮膚發(fā)白、糜爛。

菌液濃度3.4×108CFU/mL組雜交鲇第2天出現(xiàn)死亡, 在感染6d內(nèi)死亡率達(dá)85%; 3.4×107CFU/mL組第2天開(kāi)始死亡, 死亡率60%; 3.4×106CFU/mL組第3天開(kāi)始死亡, 死亡率45%; 對(duì)照組雜交鲇在觀察期內(nèi)均表現(xiàn)正常, 無(wú)死亡情況(表 2)。對(duì)人工感染發(fā)病的雜交鲇進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分離檢測(cè), 獲得與分離菌株DYJ140914形態(tài)及理化特征相同的細(xì)菌。

表 1 分離菌的生化特性Tab. 1 Biochemical characteristics of the isolated strain

2.6 藥敏性檢測(cè)

由表 3可知, 分離菌對(duì)強(qiáng)力霉素、諾氟沙星和左氧氟沙星敏感, 對(duì)新霉素中度敏感, 對(duì)氨芐青霉素、青霉素、氟苯尼考、磺胺甲基異惡唑、頭孢西丁、阿奇霉素、利福平耐藥。

2.7 組織病理?yè)p傷

圖 2 菌株DYJ140914的16S rRNA基因序列(A)、gyrB基因序列(B)及相關(guān)菌株構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic trees were generated using MEGA5.0 based on alignment for 16S rRNA (A) and gyrB gene (B) sequence of the isolate strain DYJ140914 and other related species in Pseudomonas genus

惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)感染雜交鲇造成的病理?yè)p傷主要集中在肝、皮膚肌肉、腎、脾和心臟。其中主要以肝臟、皮膚肌肉、腎間質(zhì)的病變最為明顯。肝臟出現(xiàn)多灶性壞死(圖3A), 壞死灶內(nèi)細(xì)胞濃縮, 胞核碎裂甚至消失, 崩解的組織間隙內(nèi)存在較多桿狀菌(圖 3B); 皮膚表皮壞死脫落(圖 3C), 肌纖維和肌漿凝固, 呈蜂窩狀, 炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), 肌纖維內(nèi)及肌纖維間可見(jiàn)大量桿狀菌(圖 3D); 腎間質(zhì)多灶性壞死(圖 3E), 間質(zhì)內(nèi)大量中性白細(xì)胞浸潤(rùn), 大量紅細(xì)胞積聚, 細(xì)胞間隙可見(jiàn)大量桿狀菌(圖 3F); 除了以上較為嚴(yán)重的典型病變,脾臟和心臟也有一定程度的病變: 其中脾臟淋巴細(xì)胞壞死崩解可見(jiàn)少量桿狀菌(圖 3G), 心外膜及心內(nèi)膜大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖 3H), 心臟動(dòng)脈球外膜外膜空泡樣極度擴(kuò)張(圖 3I)。

3 討論

在本研究中惡臭假單胞菌感染可引起雜交鲇出現(xiàn)體表皮膚肌肉潰瘍癥, 其潰瘍主要特征為體表出現(xiàn)典型的潰瘍?cè)? 嚴(yán)重者裸露脊柱, 尤以背部肌肉最為明顯。在一定程度上與柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)引起的柱形病、嗜冷黃桿菌(Flavobacterium psychrophilum)引起的冷水病、運(yùn)動(dòng)型氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的敗血癥癥狀相似[15]。但柱狀黃桿菌引起的感染主要在鰭條和鰓部, 以爛鰭和爛鰓為主要表現(xiàn), 皮膚深度潰瘍較少見(jiàn)[22]; 嗜冷黃桿菌引起的冷水病雖然以表皮蒼白褪色、皮膚潰瘍?yōu)橹饕Y狀, 但該病多發(fā)生在水溫較低時(shí)(發(fā)病水溫范圍4—10℃, 水溫15℃時(shí)最為嚴(yán)重)[23], 而本病發(fā)病水溫在20℃左右, 與嗜冷黃桿菌引起的潰瘍病有明顯的流行病學(xué)差異; 運(yùn)動(dòng)型氣單胞菌感染引起的疾病多以敗血癥為主要表現(xiàn), 體表潰瘍癥狀較少見(jiàn)[24], 而本病例中除了內(nèi)臟器官有出血表現(xiàn)外, 還可見(jiàn)體表明顯潰瘍。

表 2 病原菌人工感染健康雜交鲇實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab. 2 The mortality of hybrid catfish challenged (intraperitoneal injection) with different doses of the isolate DYJ140914

表 3 菌株DYJ140914的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab. 3 The sensitivity of isolate bacteria DYJ140914 from a disease outbreak in hybrid catfish to various antimicrobial agents

鲇體表潰瘍癥是危害鲇養(yǎng)殖的主要疾病。從目前研究報(bào)道來(lái)看, 包括嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)[25]、維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)[26]、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)[27]、擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus)[28]、柱狀黃桿菌(Flavobacterium cloumnare)[29]等多種病原均可引起鲇體表潰瘍癥狀。本研究通過(guò)組織病理學(xué)技術(shù), 發(fā)現(xiàn)皮膚肌肉、肝和腎間組織為本病的主要損傷靶器官, 且在這些組織中明顯可見(jiàn)大量桿狀細(xì)菌, 加之腎臟組織觸片中也觀察到相同的桿菌, 故可確定為細(xì)菌感染;同時(shí)利用生理生化、16S rRNA和gryB基因分析對(duì)分離的病原進(jìn)行進(jìn)一步鑒定, 最終確定為惡臭假單胞菌感染致病。迄今為止, 惡臭假單胞菌感染引起雜交鲇體表潰瘍的報(bào)道, 在國(guó)內(nèi)外尚屬首次。

在假單胞菌屬中, 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)已經(jīng)被確認(rèn)為條件致病性病原菌[30—32]。然而,假單胞菌屬的其他菌種也可能是嚴(yán)重的條件致病菌, 例如: 分離于日本鰻鱺(Anguilla japonica)的鰻敗血假單胞菌(Pseudonas anguilliseptica)[33], 紅點(diǎn)鮭鱒(Oncorhynchus rhodurus)上分離的綠針假單胞菌(Pseudonas chlororaphis)[34], 香魚(yú)(P. altivelis)上分離的變形假單胞菌(Pseudonas plecoglossicida)[35]等, 均可感染水生動(dòng)物而致病。本研究結(jié)果表明,惡臭假單胞菌也可感染雜交鲇, 并且有較強(qiáng)的致病性, 由此表明在目前高密度人工養(yǎng)殖條件下, 惡臭假單胞菌正在逐漸獲得感染水生動(dòng)物的能力, 可能演變?yōu)橐环N潛在的水產(chǎn)條件致病菌。

此外, 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示惡臭假單胞菌只對(duì)受試的強(qiáng)力霉素、諾氟沙星和左氧氟沙星3種抗生素敏感, 而對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氯霉素類(lèi)、利福霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)抗生素均具有較強(qiáng)耐藥性。在這3種敏感的抗生素當(dāng)中, 諾氟沙星已經(jīng)禁用, 左氧氟沙星未批準(zhǔn)使用于水產(chǎn)動(dòng)物, 僅強(qiáng)力霉素允許用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物, 故強(qiáng)力霉素可作為治療該病的推薦用藥。但相關(guān)研究表明, 假單胞菌屬增長(zhǎng)速度極快,能快速適應(yīng)不同的環(huán)境條件, 抗生素抗性基因產(chǎn)生迅速。由于在目前中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 使用抗生素是主要的防病治病策略, 故其不利影響可能持續(xù)擴(kuò)大,使治療更加困難。因此, 構(gòu)建健康養(yǎng)殖環(huán)境, 開(kāi)發(fā)針對(duì)性疫苗, 或環(huán)境友好的中藥制劑等是防控該病的理想策略。

圖 3 雜交鲇惡臭假單胞菌感染的病理組織學(xué)損傷(HE×100, 200, 400, 1000, 標(biāo)尺=10, 100, 200 μm)Fig. 3 Pathohistological lesions of hybrid catfish infected with Pseudomonas putida (HE×100, 200, 400, 1000)A. 肝臟多灶性壞死; B. 肝細(xì)胞間隙內(nèi)大量桿狀菌; C. 皮膚表皮壞死脫落; D. 肌纖維和肌漿凝固, 間隙內(nèi)大量短桿菌; E. 腎間質(zhì)多灶性壞死; F. 間質(zhì)內(nèi)大量中性白細(xì)胞浸潤(rùn), 大量紅細(xì)胞積聚, 細(xì)胞間隙可見(jiàn)桿狀菌; G. 脾臟淋巴細(xì)胞壞死, 少量桿狀菌; H. 心外膜及心內(nèi)膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn); I. 心臟動(dòng)脈球外膜空泡樣極度擴(kuò)張A. Multifocal necrosis in liver; B. Rod-shaped bacteria can observed in the intercellular of liver; C. Epidermis of skin necrosis and shedding; D. Muscle fibers and sarcoplasmic with solidification and honeycomb and many filamentous bacteria exist in muscle fibers; E. Severe focal necrosis in renal interstitium; F. Many erythrocytes, inflammatory cells and rod-shaped bacteria in intercellular of kidney; G. Splenocytes necrosis and with some rod-shaped bacterias; H. Infiltration of inflammatory cells in epicardium and endocardium; I. Adventitia of aortic bulb extreme expansion

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ISOLATION, IDENTIFICATION AND PATHOLOGICAL LESIONS OF PSEUDOMONAS PUTIDA FROM HYBRID CATFISH

DUAN Ya-Jiao1, HUANG Xiao-Li1, ZHAN Gui-Ran2, FAN Wei3, DUAN Jing1, ZHAO Yi-Lin1, DENG Yong-Qiang4, GENG Yi5, CHEN De-Fang1and WANG Kai-Yu5
(1. College of Animal Science and Technology, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2. Fisheries Station of Huize County of Yunnan Province, Qujing 654200, China; 3. Neijiang City Academy of Agricultural Sciences, Neijiang 641000, China; 4. Animal Disease Prevention and Control Center of Sichuan, Chengdu 610041, China; 5. College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

In order to identify the pathogens of the skin ulcer disease in hybrid catfish, several strains of dominant bacteria (DYJ140914-DYJ140917) were isolated from the diseased fish. They were identified as Pseudomonas putida based on morphology, biochemical, physiology characteristics and sequencing of 16S rRNA and gyrase B subunit (gyrB) gene (GeneBank accession number were KP693689 and KP693690 respectively). They were also proved to be the pathogen of the disease by artificial infection experiment. Histologically, liver, skin, muscle, and renal interstitial were the target organs of the disease, which characterized by multifocal necrotic hepatitis, necrotic myositis, and necrotizing interstitial nephritis. Moreover, it could also lead to mild epicardial and endocardial inflammation, and mild necrotic splenitis. The result of drug sensitivity test showed that the isolates were sensitive to the Doxycycline, Norfloxacin, and Levofloxacin, but were resistant to Ampicillin, Azithromycin, Florfenicol, Sinomin, Mefoxin, Penicillin.

Hybrid catfish; Pseudomonas putida; 16S rRNA; gyrB gene; Pathological lesion

S941.1

A

1000-3207(2017)02-0371-08

10.7541/2017.45

2016-02-24;

2016-06-18

四川省科技支撐項(xiàng)目(2014NZ0027)資助 [Supported by the Science and Technology Support Project of Sichuan Province (No. 2014NZ0027)]

段亞佼(1992—), 女, 甘肅慶陽(yáng)人; 碩士研究生; 研究方向水生動(dòng)物疾病學(xué)。E-mail: michelle0118@163.com

黃小麗(1979—), 女, 重慶人; 副教授; 主要從事水生動(dòng)物疾病學(xué)的教學(xué)與研究工作。E-mail: hxldyq@126.com