張良林王 帥高 宏

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 中國(guó)科學(xué)院藻類(lèi)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

應(yīng)用生物膜干涉技術(shù)檢測(cè)魚(yú)腥藻HetR結(jié)合靶DNA的親和力

張良林1,2王 帥1,2高 宏1

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 中國(guó)科學(xué)院藻類(lèi)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

魚(yú)腥藻PCC7120是一種固氮絲狀藍(lán)藻, 當(dāng)環(huán)境中化合態(tài)氮源充足時(shí), 其藻絲只有進(jìn)行光合作用的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞;在環(huán)境中缺乏可利用的氮源時(shí), 部分營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞會(huì)在藻絲上以一種半規(guī)律的格式分化成異形胞(異形胞間隔約10個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞), 從而進(jìn)行固氮作用。早在1984年, Wolk實(shí)驗(yàn)室通過(guò)與大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移的方式, 成功地將穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)入魚(yú)腥藻PCC7120, 建立了遺傳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)[1]。在2001年, 日本Kazusa研究中心完成了對(duì)魚(yú)腥藻PCC7120全基因組測(cè)序[2]。有規(guī)律的細(xì)胞分化格式, 成熟的遺傳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)以及完整可用的基因組序列使得魚(yú)腥藻PCC7120成為了研究原核細(xì)胞分化的模式生物。

魚(yú)腥藻PCC7120異形胞的分化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,涉及多個(gè)基因的協(xié)調(diào)參與。根據(jù)目前的研究, HetR被公認(rèn)為是異形胞分化的主調(diào)控因子。文獻(xiàn)報(bào)道, HetR是一個(gè)具有雙鏈DNA結(jié)合活性的同源二聚體[3], 通過(guò)結(jié)合基因啟動(dòng)子區(qū)域(包括其自身啟動(dòng)子)從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[4,5]。對(duì)于HetR蛋白和靶DNA的結(jié)合力的研究, 研究者主要采用的經(jīng)典的EMSA方法[4—6], 該方法通過(guò)觀察DNA條帶的遷移能直觀的反應(yīng)蛋白與DNA的結(jié)合情況。然而, 該方法局限性是不能對(duì)蛋白結(jié)合靶DNA親和力進(jìn)行準(zhǔn)確地定量。因而研究者們正試圖嘗試一些新的方法, 探究HetR結(jié)合靶DNA的奧秘。

生物膜干涉技術(shù)(Bio-Layer Interferometry, BLI))是一種快速檢測(cè)分子間相互作用的方法, 該方法由ForteBio公司開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì), 在Octet系統(tǒng)中可完成實(shí)驗(yàn)操作。其基本原理是, 在光纖制成的生物傳感器底端覆蓋生物分子相容層, 偶聯(lián)配體后形成生物膜層, 進(jìn)而用配體與靶分子反應(yīng)。大分子結(jié)合傳感器底端偶聯(lián)的配體時(shí)會(huì)導(dǎo)致生物膜層厚度增加, 反射光干涉光譜曲線將產(chǎn)生遷移, 儀器可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)相位移的變化, 并將其轉(zhuǎn)化為可衡量分子間相互作用大小的參數(shù)。BLI技術(shù)對(duì)于研究蛋白與DNA結(jié)合有著廣泛的應(yīng)用前景[7,8]。

本研究利用BLI技術(shù), 研究了魚(yú)腥藻PCC7120異形胞分化主調(diào)控因子HetR與其靶DNA(PhetP與PhetZ)的結(jié)合情況, 并對(duì)其親和力進(jìn)行了定量分析。本文也是BLI技術(shù)在魚(yú)腥藻異形胞發(fā)育研究領(lǐng)域應(yīng)用的首次報(bào)道, 為該領(lǐng)域的研究提供了新的研究方法。

1 材料與方法

1.1 EF-Ts-HetR蛋白的表達(dá)純化及定量

本研究使用的蛋白是EF-Ts-HetR, 在HetR的N-端融合了一個(gè)EF-Ts標(biāo)簽。表達(dá)菌株由本實(shí)驗(yàn)室杜野博士構(gòu)建[5]。蛋白C-端含有6His標(biāo)簽, 因而利用Ni2+柱親和層析的方法, 具體方法按照His·Bind Purification Kit (Novagen)進(jìn)行。純化后的蛋白用20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0緩沖液在超濾管(Millipore, 截留分子量3 K)中脫鹽純化。蛋白定量采用康維世紀(jì)的Super-Bradford Protein Assay Kit試劑盒。

1.2 Biotin-DNA的制備

本研究中使用DNA片段為魚(yú)腥藻PCC7120中hetP和hetZ基因的啟動(dòng)子區(qū)域50/40 bp片段, 均采用5′-biotin標(biāo)記的方法。其中, biotin-ssDNA直接由公司合成標(biāo)記; biotin-dsDNA需要將其中的一條biotin-ssDNA與另一條非標(biāo)記的ssDNA退火形成, 退火緩沖液采用碧云天公司的Annealing Buffer for DNA Oligos (5X)。退火體系總體積100 μL, 各組分及用量如下: Annealing Buffer for DNA Oligos (5×), 20 μL; DNA oligo A (50 μmol/L), 20 μL; DNA oligo B (50 μmol/L) 20 μL; Nuclease-free water, 40 μL。反應(yīng)程序如下: step1 95℃, 2min, 1 cycle; step2 -0.1 ℃/ cycle, 8s, 700 cycles; Step3 4℃ forever。

1.3 BLI實(shí)驗(yàn)

生物膜干涉實(shí)驗(yàn)(Bio-Layer Interferometry, BLI)在Octet RED96系統(tǒng)中完成。實(shí)驗(yàn)采用與儀器匹配的96孔板(Fluotrace 600, LOT E110103S), 反應(yīng)體積為200 μL, 反應(yīng)溫度為28℃。實(shí)驗(yàn)具體方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[7,8]并有相應(yīng)改進(jìn)。方法如下: 將Streptavidin (SA)標(biāo)記的探針于超純水中浸濕5min, 進(jìn)而轉(zhuǎn)移入A Buffer (20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 200 mmol/L NaCl, 1 mmol/L MgCl2, 1 mmol/ L DTT, 0.5 mmol/L EDTA)中進(jìn)行第一次基線(Baseline)步驟, 時(shí)間100s; 探針轉(zhuǎn)移入含有500 nmol/L biotin標(biāo)記的DNA的A Buffer中進(jìn)行DNA固定, 時(shí)間200s; 將固定有DNA的探針重新轉(zhuǎn)移到B Buffer中進(jìn)行第二次基線(Baseline)步驟(B Buffer為含有 6 mg/ mL BSA、1.2% Tween20、10 μg/mL超聲后鮭魚(yú)精DNA的A Buffer),時(shí)間200s; 將探針轉(zhuǎn)移至含有終濃度為C buffer中進(jìn)行蛋白和DNA的結(jié)合步驟(C buffer為含有10 μmol/L EF-TSHetR的B Buffer), 時(shí)間300s; 最后將探針轉(zhuǎn)移至B Buffer中進(jìn)行解離步驟, 時(shí)間300s。

結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)利用Data analysis (ForteBio, version 7.1)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。KD值根據(jù)結(jié)合和解離曲線, 利用nonlinear global fitting model模擬計(jì)算。計(jì)算KD值的實(shí)驗(yàn)設(shè)置蛋白濃度梯度為10、5、2.5和1.25 μmol/L。最終KD值計(jì)算取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果

2.1 BLI對(duì)HetR結(jié)合PhetP50與PhetZ50的差異比較

文獻(xiàn)已報(bào)道HetR可以結(jié)合hetP和hetZ啟動(dòng)子的識(shí)別位點(diǎn), 從而可以調(diào)控hetP與hetZ的表達(dá)[4,5]。我們利用BLI技術(shù)對(duì)EF-Ts-HetR與包含識(shí)別位點(diǎn)的雙鏈DNA片段PhetP50 (5′-AAATGCACAGTAGGCGGGGGTCTAA CCCCTCATTACCTAGTAGAAAATG-3′)和PhetZ50 (5′-TCTGCCCACTAATGTGAGGGTCTAGCCCAGCAGGT GGGATTAGAGAAACA-3′)的結(jié)合進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示, HetR與靶DNA結(jié)合在Octet系統(tǒng)中有明顯的信號(hào)(圖1)。HetR與不同靶DNA的結(jié)合解離曲線已在圖中標(biāo)出(PhetP和PhetZ), control代表不固定DNA的探針與HetR反應(yīng)的陰性對(duì)照。曲線縱坐標(biāo)為相位移變化, 反映了結(jié)合信號(hào)強(qiáng)弱; 橫坐標(biāo)為結(jié)合解離持續(xù)時(shí)間。

圖 1 HetR與PhetP50和PhetZ50的結(jié)合Fig. 1 Binding of HetR with PhetP50 and PhetZ50

2.2 HetR結(jié)合PhetP50與PhetZ50親和力(KD)計(jì)算

圖 1顯示EF-Ts-HetR與PhetP50和PhetZ50有著不同的結(jié)合解離曲線, 進(jìn)而我們同樣利用BLI技術(shù)對(duì)HetR與PhetP50和PhetZ50的結(jié)合進(jìn)行了定量。Octet系統(tǒng)中給出的KD值反映了分子相互作用力的大小。KD值是根據(jù)結(jié)合解離曲線算出的解離常數(shù)(Kd)與結(jié)合常數(shù)(Ka)的比值, 反映了分子間親和力的大小。

為準(zhǔn)確計(jì)算KD值, 我們?cè)O(shè)置了EF-Ts-HetR濃度梯度,如圖 2、圖 3中標(biāo)注所示, 曲線分別代表10、5、2.5和1.25 μmol/L的EF-Ts-HetR結(jié)合靶DNA。根據(jù)曲線計(jì)算出, HetR與PhetP50和PhetZ50結(jié)合的KD值分別為0.29±0.07和1.48±0.29。

3 討論

HetR作為有特異位點(diǎn)的DNA結(jié)合蛋白, 在魚(yú)腥藻PCC7120基因組中有著多個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道HetR可以結(jié)合hetP、hetZ、patA、hetR、hepA、alr0202和alr3234的啟動(dòng)子序列, 并且由于這些基因啟動(dòng)子包含的HetR結(jié)合位點(diǎn)完整性的差異, HetR對(duì)于不同片段有著不同的親和力[9]; 經(jīng)典的EMSA實(shí)驗(yàn)多次證明HetR對(duì)hetP和hetZ啟動(dòng)子片段有著相對(duì)較強(qiáng)的結(jié)合力。因而在本研究中, 我們選取了PhetP和PhetZ50 bp片段, 利用BLI技術(shù)對(duì)HetR結(jié)合靶DNA進(jìn)行了定量和定性的分析。

圖 2 不同濃度的EF-Ts-HetR與PhetP50的結(jié)合Fig. 2 Binding of HetR at different concentration with PhetP50

圖 3 不同濃度的EF-Ts-HetR與PhetZ50的結(jié)合Fig. 3 Binding of HetR at different concentration with PhetZ50

通過(guò)對(duì)HetR與PhetP50和PhetZ50片段結(jié)合解離曲線(圖 1)的比較我們可以看出, HetR與PhetP50的結(jié)合和解離速率都明顯快于PhetZ50; 在300s內(nèi), HetR與PhetP50的結(jié)合信號(hào)(λ shift)要強(qiáng)于HetR與PhetZ50的結(jié)合信號(hào)。但BLI的原理, 結(jié)合信號(hào)的大小并不能直接反應(yīng)親和力的強(qiáng)弱, 為了對(duì)HetR與PhetP50和PhetZ50片段的親和力進(jìn)行定量, 我們利用HetR濃度梯度進(jìn)行了KD值精確計(jì)算; KD值即為親和力常數(shù), 它只與分子間相互作用大小有關(guān), 與分子濃度無(wú)關(guān), 其數(shù)值越小代表的分子間親和力越強(qiáng)。通過(guò)KD值的比較我們看出, HetR與PhetP50片段的親和力要明顯強(qiáng)于HetR與PhetZ50片段的親和力, 在數(shù)值上前者約是后者的1/5, 因而我們可以判斷HetR與hetP啟動(dòng)子片段的親和力約是與hetZ片段親和力的5倍。

研究者曾利用EMSA手段, 定性分析了HetR對(duì)不同片段的結(jié)合[9], 發(fā)現(xiàn)HetR在0.125 μmol的時(shí)候即可與hetP啟動(dòng)子片段結(jié)合, 而當(dāng)HetR濃度提高到0.5 μmol/L的時(shí)候才可以和hetZ啟動(dòng)子片段結(jié)合。通過(guò)EMSA簡(jiǎn)單的定量分析, 我們可以看出HetR與hetP啟動(dòng)子片段的親和力約是hetZ啟動(dòng)子片段親和力的4倍左右, 與本研究報(bào)道的5倍十分接近。BLI技術(shù)在蛋白-DNA相互作用研究中將會(huì)發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

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DETECTION OF THE AFFINITY OF HETR, THE KEY REGULATOR OF HETEROCYST DIFFERENTIATION, WITH ITS TARGET DNA IN ANABAENA BY BIOLAYER INTERFEROMETRY

ZHANG Liang-Lin1,2, WANG Shuai1,2and GAO Hong1
(1. Key Laboratory of Algal Biology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

生物膜干涉技術(shù); PCC7120; HetR; DNA結(jié)合能力

Biolayer interferometry; PCC7120; HetR; DNA binding ability

Q344+.1

A

1000-3207(2017)02-0483-03

10.7541/2017.61

2016-03-21;

2016-06-12

國(guó)家自然科學(xué)基金(31270132)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31270132)]

張良林(1986—), 男, 安徽亳州人; 碩士研究生; 研究方向?yàn)樵孱?lèi)遺傳學(xué)。E-mail: 409663786@qq.com

高宏, E-mail: gaoh@ihb.ac.cn