唐智嬌范純新王 健宋佳坤

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)海洋生物系統(tǒng)與神經(jīng)科學(xué)研究所, 上海 201306; 3. 上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

Hedgehog參與西伯利亞鱘側(cè)線機(jī)械和電感受器分化的初始證據(jù)

唐智嬌1,2,3范純新1,2,3王 健1,3宋佳坤1,2,3

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)海洋生物系統(tǒng)與神經(jīng)科學(xué)研究所, 上海 201306; 3. 上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

為揭示Hedgehog (Hh)信號(hào)與神經(jīng)丘和壺腹器官分化的關(guān)系, 研究以西伯利亞鱘(Acipenser baerii Brandt)為模型, 首先對(duì)再生過(guò)程中的神經(jīng)丘和壺腹器官的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析, 發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)通路關(guān)鍵基因(Shh、Patched 1)在兩類感受器中差異表達(dá), 且它們的表達(dá)在再生過(guò)程中呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)性。然后用環(huán)巴胺(Cyclopamine, Hh信號(hào)抑制劑)處理西伯利亞鱘胚胎(st29), 用掃描電鏡和FM1-43熒光染色對(duì)西伯利亞鱘仔魚(yú)(st43-st44)分析發(fā)現(xiàn)環(huán)巴胺顯著抑制了壺腹器官的發(fā)育。整體原位雜交表明, Shh、Patched1、Smoothened、Gli2在腹面?zhèn)染€區(qū)域的表達(dá)受到了環(huán)巴胺的抑制。以上結(jié)果暗示Hh信號(hào)通路與神經(jīng)丘和壺腹器官的發(fā)育有關(guān), 推測(cè)Hh信號(hào)在神經(jīng)丘和壺腹器官的分化過(guò)程中起到了重要作用。

西伯利亞鱘; 神經(jīng)丘; 壺腹器官; Hedgehog信號(hào); 環(huán)巴胺

包括魚(yú)類和兩棲類在內(nèi)的低等水生脊椎動(dòng)物具有側(cè)線這一重要的感覺(jué)器官。在系統(tǒng)演化過(guò)程中, 盡管真骨魚(yú)的電感受器發(fā)生了丟失, 但軟骨魚(yú)和非新鰭亞綱的側(cè)線系統(tǒng)都是由感受機(jī)械振動(dòng)的機(jī)械感受器(神經(jīng)丘)和感受弱電場(chǎng)的電感受器(壺腹器官)組成[1,2]。這兩類功能迥異的側(cè)線感受器都由感覺(jué)細(xì)胞、支持細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞組成, 且它們都起源于一系列的側(cè)線基板[3]。頭部側(cè)線基板通過(guò)延伸形成感覺(jué)嵴, 然后在感覺(jué)嵴的中央?yún)^(qū)形成神經(jīng)丘原基, 旁側(cè)區(qū)形成壺腹器官原基[1]。目前, 兩類側(cè)線感受器分化的分子基礎(chǔ)尚不清楚, 而這是理解電感受器在系統(tǒng)進(jìn)化中出現(xiàn)-消失-再出現(xiàn)的關(guān)鍵。

Hedgehog基因最先在果蠅(Drosophila melanogaster)突變體篩選中發(fā)現(xiàn), 其編碼的蛋白是一類重要的形態(tài)生成素, 控制果蠅胚胎的分節(jié)模式。脊椎動(dòng)物中存在3個(gè)Hedgehog的同源基因: Shh、Ihh和Dhh, 分別編碼Shh、Ihh和Dhh蛋白。Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵分子還包括識(shí)別Hh信號(hào)的受體膜蛋白Patched (Ptc)和調(diào)控膜蛋白Smoothened (Smo), 以及可進(jìn)入細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白。當(dāng)Ptc和Hh結(jié)合以后,解除對(duì)Smo的抑制作用, 促使Gli蛋白結(jié)合PKA及CK1等因子與微管形成大分子復(fù)合物, 使得完整Gli蛋白進(jìn)入核內(nèi)激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄[4—6]。在脊椎動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中, Hh信號(hào)通路調(diào)控許多器官和組織的模式形成, 例如眼睛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺、腸和四肢等[7]。

Sapède和Pujades[8]通過(guò)Hh信號(hào)抑制劑環(huán)巴胺處理斑馬魚(yú)(Danio rerio)胚胎, 證明了Hh通路對(duì)橢圓囊后側(cè)聽(tīng)斑(Macula of utricle)毛細(xì)胞的產(chǎn)生和特定神經(jīng)支配的形成至關(guān)重要。Koebernick等[9]用環(huán)巴胺處理非洲爪蟾(Xenopus)胚胎, 發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)調(diào)控非洲爪蟾內(nèi)耳發(fā)育。有趣的是, 側(cè)線系統(tǒng)和內(nèi)耳均起源于頭部神經(jīng)基板[10,11], Koebernick等[9]又進(jìn)一步證明了Smo的高表達(dá)也阻礙了側(cè)線基板發(fā)育,說(shuō)明Hh信號(hào)通路參與聽(tīng)-側(cè)線系統(tǒng)的分化。側(cè)線系統(tǒng)中的機(jī)械感受器和電感受器都來(lái)自側(cè)線基板, 兩者的分化是否也受到Hh信號(hào)調(diào)控？本文以西伯利亞鱘(Acipenser baerii Brandt)胚胎為實(shí)驗(yàn)材料, 經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析神經(jīng)丘和壺腹器官再生過(guò)程中Hh信號(hào)的表達(dá), 通過(guò)掃描電鏡和FM1-43熒光染色觀察環(huán)巴胺對(duì)西伯利亞鱘仔魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)的影響, 并結(jié)合整體原位雜交技術(shù), 初步探討Hh信號(hào)在西伯利亞鱘側(cè)線系統(tǒng)機(jī)械和電感受器發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1.1 西伯利亞鱘胚胎和仔魚(yú)

西伯利亞鱘受精卵購(gòu)自大連永新鱘魚(yú)開(kāi)發(fā)有限公司, 在實(shí)驗(yàn)室條件下, 養(yǎng)在盛有滅菌胚胎水(63 mg/L CaSO4、10 mg/L MgSO4、4 mg/L KCl、1.1 mg/L NaH2PO4、0.01 mg/L亞甲基藍(lán))的燒杯中, 每500 mL胚胎水1000顆受精卵, 維持水溫18℃左右, 氣泵供氧[12]。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

st44期西伯利亞鱘經(jīng)200 μmol/L新霉素處理2h,胚胎水漂洗3次, 每次5min, 之后于胚胎水中培養(yǎng)。分別于處理后0、12h和24h取神經(jīng)丘、壺腹器官和表皮于Trizol中保存。每次取樣前用0.1% DASPEI熒光染色2min, 胚胎水漂洗3次, 0.05%MS-222麻醉,然后用Stemi-2000立體顯微鏡在熒光下取樣。Trizol法提RNA, 分析RNA的濃度、完整度、質(zhì)量后用Hiseq-1500測(cè)序儀進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 環(huán)巴胺處理胚胎

致畸劑環(huán)巴胺對(duì)Hh信號(hào)的抑制非常特異, 直接抑制Smo信號(hào)活性[13]。將西伯利亞鱘胚胎從st29期(此時(shí)基板開(kāi)始形成)開(kāi)始經(jīng)20 μmol/L環(huán)巴胺(Merck millipore, 用DMSO溶解)處理到st37期, 即出膜后1d (環(huán)巴胺共處理4d)。用胚胎水清洗2遍, 之后繼續(xù)用胚胎水培養(yǎng)。每300 mL胚胎水500顆受精卵,維持水溫18℃左右, 氣泵供氧。同時(shí), 以等量DMSO處理的胚胎作為對(duì)照組, 取樣的時(shí)間點(diǎn)根據(jù)對(duì)照組的發(fā)育階段進(jìn)行確定。部分樣品用新鮮的4%多聚甲醛(4%PFA, 4 g多聚甲醛固體溶于100 mL PBS中) 4℃固定過(guò)夜后, 經(jīng)甲醇脫水, 保存于-80℃, 用于整體原位雜交。

1.4 掃描電鏡

環(huán)巴胺處理的st43期的西伯利亞鱘仔魚(yú)和相應(yīng)發(fā)育時(shí)期的對(duì)照組用混合固定液(4%PFA和2.5%戊二醛, 用0.1 M PBS稀釋) 4℃固定過(guò)夜, 再用0.1 mol/L PB于4℃清洗樣品6次, 每次15min。梯度酒精(30%—50%—70%—95%)脫水, 每個(gè)酒精濃度脫水各5min,最后無(wú)水酒精10min。接著CO2臨界點(diǎn)干燥, 噴金。最后用S-3400NⅡ掃描電鏡觀察并拍照。

1.5 FM1-43染色

將st44期西伯利亞鱘仔魚(yú)用PBS沖洗3次, 放入用胚胎水配制的0.1% FM1-43中染色2—5min, 再用胚胎水漂洗3次, 0.05% MS-222 (間氨基苯甲酸酯甲磺酸鹽)麻醉, 最后用SMZ-16體視顯微鏡觀察并拍照。

1.6 Hh信號(hào)通路相關(guān)基因的克隆

我們根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的序列信息, 利用IDT網(wǎng)站上設(shè)計(jì)引物工具設(shè)計(jì)了用以擴(kuò)增Shh、Patched1 (Ptch1)、Smoothened (Smo)和Gli2四個(gè)基因部分編碼序列(CDS)的引物(表 1)。我們以西伯利亞鱘胚胎cDNA為模板, 加入設(shè)計(jì)好的引物, PCR擴(kuò)增得到這4個(gè)基因的cDNA片段, 純化并連接pBSK載體, 轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài), 將陽(yáng)性克隆送至上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。

表 1 實(shí)驗(yàn)所使用的引物序列Tab. 1 Primer sequences used in the current study

1.7 整體原位雜交

以連有目的基因片段的線性化重組質(zhì)粒為模板, 用T7或T3 RNA聚合酶合成地高辛(DIG)標(biāo)記的反義RNA探針。實(shí)驗(yàn)前將玻璃容器于180℃高溫烘烤6h以上, 溶液用0.1%焦炭酸二乙酯(DEPC)處理過(guò)夜。首先將保存于-80℃甲醇中的西伯利亞鱘仔魚(yú)用3% H2O2溶液強(qiáng)光下脫色30min左右, 梯度甲醇(75%—50%—30%)復(fù)水, PBST洗滌3次, 每次各5min。再用蛋白酶K(1 μg/mL, sigma)于室溫消化10—30min, 新鮮4% PFA固定20min, PBST清洗4次,每次5min。然后將仔魚(yú)轉(zhuǎn)至預(yù)雜交液[50%去離子甲酰胺; 5×SSC (pH 7.0); 0.1% Tween20; 500 μg/mL酵母tRNA; 100 μg/mL肝素; 9.2×10-5mol/L檸檬酸]中于65℃孵育3h, 之后換為含探針(0.5 ng/μL)的雜交液65℃孵育過(guò)夜。次日依次經(jīng)梯度2×SSC (25%—50%—75%—100%)稀釋的雜交液于65℃輕搖洗滌,各10min; 然后用0.2×SCC洗滌2次, 每次30min; 再經(jīng)梯度0.2×SSC (75%—50%—25%)輕搖洗滌, 各10min; PBST洗滌1次, 10min。接著用封閉緩沖液[2%羊血清; 2 mg/mL小牛血清白蛋白(BSA)(用PBST配制)]室溫封閉仔魚(yú)3h, 再經(jīng)抗DIG堿性磷酸酶聯(lián)抗體(按1∶5000用封閉緩沖液稀釋)于4℃下輕搖孵育過(guò)夜; PBST輕搖洗滌4次, 每次15min; 顯色緩沖液[100 mmol/L NaCl; 100 mmol/L Tris-HCl (pH 9.5); 50 mmol/L MgCl2; 0.1% Tween-20]洗滌3次, 每次5min; 于現(xiàn)配的NBT/BCIP顯色液中暗處染色30—60min; PBS洗滌3次, 每次15min; 甲醇洗滌30min; PBS洗滌3次, 每次5min; 新鮮4% PFA室溫固定20min; PBS洗滌3次, 每次5min; 最后將仔魚(yú)浸于100%甘油中待SMZ-16體視顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)丘和壺腹器官轉(zhuǎn)錄組中Hh信號(hào)通路基因的表達(dá)分析

我們的前期工作通過(guò)200 μmol/L新霉素破壞st44期西伯利亞鱘仔魚(yú)機(jī)械和電感覺(jué)毛細(xì)胞, 分別建立了0、12h和24h的cDNA文庫(kù)。我們發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)通路相關(guān)基因Shh、Smoothened、Patched1、Gli2在壺腹器官和神經(jīng)丘的不同再生階段中都有表達(dá),我們通過(guò)FPKM (Fragment Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)對(duì)這幾個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行了比較分析(圖 1)。Shh和Patched1的表達(dá)均隨感覺(jué)毛細(xì)胞的再生逐漸提高, 24 hpt時(shí), Shh和Patched1在壺腹器官和神經(jīng)丘的表達(dá)量最高, 且 0和24 hpt時(shí)在壺腹器官的表達(dá)量明顯高于神經(jīng)丘,表達(dá)差異顯著(圖 1a、b)。Gli2和Smoothened的表達(dá)在感覺(jué)毛細(xì)胞再生的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)未明顯改變, 僅12 hpt時(shí)Gli2基因在神經(jīng)丘的表達(dá)上升, 且在神經(jīng)丘的表達(dá)量明顯高于壺腹器官, 表達(dá)差異顯著(圖1c、d)。

2.2 環(huán)巴胺處理后神經(jīng)丘和壺腹器官形態(tài)學(xué)觀察和表面結(jié)構(gòu)變化

將st29期西伯利亞鱘胚胎經(jīng)20 μmol/L環(huán)巴胺處理4d, 在st44期利用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察, 對(duì)照組發(fā)育正常而處理組仔魚(yú)較對(duì)照組發(fā)育遲緩, 眼中晶狀體缺失且黑色素沉著較少, 觸須缺或變短,上下唇缺失, 卵黃囊較大, 背鰭、尾鰭發(fā)育不完整,軀干后部呈彎曲狀(圖 2)。

為具體闡明環(huán)巴胺對(duì)西伯利亞鱘仔魚(yú)神經(jīng)丘和壺腹器官的影響, 我們利用掃描電鏡, 觀察st43期西伯利亞鱘頭部腹面形態(tài)結(jié)構(gòu)。與對(duì)照組相比, 處理組仔魚(yú)頭部腹面受環(huán)巴胺影響較大, 口部?jī)H有開(kāi)口未見(jiàn)唇發(fā)育, 觸須短到幾乎沒(méi)有(圖 3a、b), 這與光鏡觀察到的結(jié)果相似。處理組頭部腹面?zhèn)染€區(qū)域神經(jīng)丘和壺腹器官分布與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯異常, 也主要分為眶下管和眶下管背腹兩側(cè)的壺腹區(qū)(圖 3c、d)。但神經(jīng)丘開(kāi)口明顯比對(duì)照組小, 且形狀不規(guī)則(圖 3e、f)。處理組頭部腹面?zhèn)染€區(qū)域壺腹器官數(shù)量明顯少于對(duì)照組(圖 3c、d), 且壺腹器官明顯小于對(duì)照組, 形狀不規(guī)則(圖 3g、h)。經(jīng)t test統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示, 處理組頭部腹面壺腹器官數(shù)量與對(duì)照組相比, 差異及其顯著, 而處理組神經(jīng)丘數(shù)量無(wú)明顯變化(圖 3i)。以上結(jié)果反映了環(huán)巴胺對(duì)西伯利亞鱘仔魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)表面結(jié)構(gòu)的影響, 我們還利用FM1-43熒光染料標(biāo)記st44期功能性神經(jīng)丘, 分析了環(huán)巴胺對(duì)神經(jīng)丘的影響。結(jié)果表明: 與對(duì)照組相比, 環(huán)巴胺處理組功能性神經(jīng)丘數(shù)量也無(wú)明顯差異(圖 4a、b)。

圖 1 神經(jīng)丘和壺腹器官再生過(guò)程中Hh信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)Fig. 1 Gene expression of Hh signaling during hair cell regeneration in neuromasts and ampullary organShh、Patched1、Smoothened、Gli2是與Hh信號(hào)通路關(guān)鍵基因; hpt為新霉素處理后時(shí)間; FPKM. 每1百萬(wàn)個(gè)map上的reads中映射到外顯子的每1千個(gè)堿基上的片段個(gè)數(shù); NM: 神經(jīng)丘; AO. 壺腹器官; *: P＜0.05; **: P＜0.01Shh, patched1, smoothened and Gli2 is key genes of Hh signaling pathway; hpt for hours post neomycin treatment; FPKM. Fragment Per Kilobase of exon model per Million mapped reads; NM. neuromast; AO. ampullary organ; *: P＜0.05; **: P＜0.01

圖 2 環(huán)巴胺對(duì)西伯利亞鱘仔魚(yú)(44期)形態(tài)的影響Fig. 2 The effect of cyclopamine on the morphology of Siberian sturgeon larva (st44)a. 對(duì)照組; b. 環(huán)巴胺處理組; e. 眼睛; v. 觸須; l. 唇; ys. 卵黃囊; df. 背鰭; tf. 尾鰭; 標(biāo)尺為1 mma. control group; b. cyclopamine treatment group. e. eye; v. vibrissa; l. lip; ys. yolk sac; df. dorsal fin; tf. tail fin. The scale bar, 1 mm

2.3 Shh、Patched1、Smoothened、Gli2基因在西伯利亞鱘頭部的表達(dá)

圖 3 st43西伯利亞鱘頭部腹面觀掃描電鏡圖Fig. 3 The scanning electron micrographs of the ventral view of the head of Siberian sturgeon of stage 43a. 對(duì)照組頭部腹面觀; b. 環(huán)巴胺處理組頭部腹面觀; c, d. 頭部腹面左側(cè)放大圖(長(zhǎng)箭頭. 神經(jīng)丘; 小箭頭. 壺腹器官); e, f. 神經(jīng)丘放大圖(長(zhǎng)箭頭. 神經(jīng)丘毛細(xì)胞); g, h. 壺腹器官放大圖(小箭頭. 壺腹器官感覺(jué)細(xì)胞); i. 神經(jīng)丘和壺腹器官數(shù)量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析圖; NM. 神經(jīng)丘; AO. 壺腹器官a. head ventral view of control group; b. head ventral view of cyclopamine treatment group; c, d. higher magnification of the ventral part of the head on the left side (the long arrows refer to neuromasts; head arrows refer to ampullary organs); e, f. higher magnification of the neuromast (the long arrows refer to the hair cells of neuromasts); g, h. higher magnification of the ampullary organ (head arrows refer to the sensory cells of ampullary organs); i. statistical analysis chart of the number of neuromasts and ampullary organs; NM. neuromast; AO. ampullary organ

為了說(shuō)明環(huán)巴胺對(duì)西伯利亞鱘仔魚(yú)發(fā)育的一系列影響是其作用于Hh信號(hào)的結(jié)果, 我們通過(guò)整體原位雜交分析了Shh、Patched1、Smoothened、Gli2基因在西伯利亞鱘環(huán)巴胺處理組和對(duì)照組中的表達(dá)。結(jié)果顯示在st32和st36期的西伯利亞鱘中, Shh、Patched1、Smoothened、Gli2基因的表達(dá)較為廣泛,都在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、聽(tīng)囊、鰓弓和脊索中表達(dá), 與對(duì)照組相比, 環(huán)巴胺處理組Patched1和Gli2的表達(dá)減弱, 而Shh和Smoothened表達(dá)未發(fā)生變化(圖 5 st32, st36)。從st41期開(kāi)始, 這幾個(gè)基因的表達(dá)量明顯下降, 表達(dá)范圍縮小, 主要集中于眼眶下和上下唇區(qū)域。環(huán)巴胺處理的西伯利亞鱘Shh基因在腹側(cè)眼眶下區(qū)域有微弱表達(dá), 且在上下唇區(qū)域強(qiáng)烈表達(dá); Smoothened基因在腹側(cè)眼眶下區(qū)域和上下唇區(qū)域均有微弱表達(dá)。相對(duì)對(duì)照組, Shh和Smoothened的表達(dá)均有所減弱。在環(huán)巴胺處理后的仔魚(yú)中, Patched1、Gli2基因在腹側(cè)眼眶下區(qū)域和上下唇區(qū)域幾乎不表達(dá), 均與對(duì)照組的表達(dá)差異明顯(圖 5 st41)。

圖 4 st44西伯利亞鱘頭部腹面觀FM1-43熒光染色Fig. 4 Ventral view of the head of Siberian sturgeon by FM1-43 fluorescent staining of stage 44a. 對(duì)照組頭部腹面觀; b. 環(huán)巴胺處理組頭部腹面觀; 箭頭表示神經(jīng)丘; 標(biāo)尺為0.2 mma. head ventral view of control group; b. head ventral view of cyclopamine treatment group. The arrows label the neuromasts. The scale bar. 0.2 mm

3 討論

電感受器是一類低等水生脊椎動(dòng)物特有的感覺(jué)器官, 且在系統(tǒng)進(jìn)化中出現(xiàn)-消失-再出現(xiàn)。本研究以西伯利亞鱘仔魚(yú)為模型, 發(fā)現(xiàn)了Hh信號(hào)通路基因在兩類感受器間的差異表達(dá), 且Hh抑制劑處理特異性降低了壺腹器官的數(shù)量, 首次揭示了Hh信號(hào)通路與神經(jīng)丘和壺腹電感受器分化之間的相關(guān)性。研究表明: Hh信號(hào)可誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元, 動(dòng)-靜脈血管, 內(nèi)耳-側(cè)線感覺(jué)細(xì)胞的分化[9,14,15]。

我們比較了再生過(guò)程中壺腹器官和神經(jīng)丘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中Hh信號(hào)相關(guān)基因的差異。其中Shh和Patched1在再生不同階段動(dòng)態(tài)性表達(dá), 同時(shí)在神經(jīng)丘和壺腹器官兩類感覺(jué)器官中呈現(xiàn)顯著的表達(dá)差異(再生中的壺腹器官表達(dá)顯著高于神經(jīng)丘)。研究已發(fā)現(xiàn)大量的再生調(diào)控基因是胚胎發(fā)育關(guān)鍵基因的重新激活[16—18], 與之類似, 我們發(fā)現(xiàn)Shh信號(hào)相關(guān)基因同時(shí)也在西伯利亞鱘胚胎發(fā)育的頭部腹面口前區(qū)(壺腹集中的一個(gè)區(qū)域)表達(dá)。由于神經(jīng)丘和壺腹器官緊密相鄰, Shh信號(hào)在兩類感受器發(fā)育過(guò)程中是否存在差異還有待進(jìn)一步研究。由于側(cè)線系統(tǒng)中神經(jīng)丘和壺腹器官在發(fā)育過(guò)程中難以分辨和解剖, 無(wú)法直接分析兩類感受器的轉(zhuǎn)錄組差異,進(jìn)而找到它們的分化機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)再生的壺腹器官和神經(jīng)丘中表達(dá)的基因是鑒定發(fā)育調(diào)控基因的一條有效途徑。

為了進(jìn)一步印證Hh信號(hào)途徑與壺腹器官發(fā)育的關(guān)系, 我們利用20 μmol/L環(huán)巴胺處理側(cè)線系統(tǒng)發(fā)育前(st29)的西伯利亞鱘胚胎。我們發(fā)現(xiàn)環(huán)巴胺處理導(dǎo)致Hh信號(hào)相關(guān)基因在st41表達(dá)下降, 表明我們所選用的環(huán)巴胺處理?xiàng)l件在西伯利亞鱘胚胎中特異的抑制了Hh信號(hào)。環(huán)巴胺處理后的胚胎表型主要包括晶狀體、觸須和唇缺失, 背鰭、尾鰭發(fā)育不完整, 這與其他研究發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)參與脊椎動(dòng)物的晶狀體和附肢發(fā)育相一致[19,20]。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上利用掃描電鏡和熒光染料染色, 發(fā)現(xiàn)環(huán)巴胺還抑制了西伯利亞鱘仔魚(yú)中神經(jīng)丘的發(fā)育, 且對(duì)壺腹器官發(fā)育的作用更顯著。

我們通過(guò)整體原位雜交, 在分子水平上分析了Shh、Patched1、Smoothened、Gli2基因在西伯利亞鱘中的表達(dá), 結(jié)果表明在st32和st36期的西伯利亞鱘中, Shh、Patched1、Smoothened、Gli2基因的表達(dá)較為廣泛, 環(huán)巴胺處理組Patched1和Gli2的表達(dá)減弱, 而Shh和Smoothened表達(dá)未發(fā)生變化。環(huán)巴胺是通過(guò)影響Smoothened蛋白的活化而特異性抑制Hedgehog信號(hào), 且環(huán)巴胺的直接效應(yīng)是抑制Hedgehog信號(hào)靶基因Patched1和Gli2的表達(dá)[13,21]。而從st41期開(kāi)始, 這幾個(gè)基因的表達(dá)范圍縮小, 主要集中于眼眶下和上下唇區(qū)域。環(huán)巴胺處理的西伯利亞鱘Shh基因在腹側(cè)眼眶下區(qū)域有微弱表達(dá), 且在上下唇區(qū)域強(qiáng)烈表達(dá); Smoothened基因在腹側(cè)眼眶下區(qū)域和上下唇區(qū)域均有微弱表達(dá)。相對(duì)對(duì)照組, Shh和Smoothened的表達(dá)有稍微減弱, 但差異不明顯, 這是由于環(huán)巴胺只是抑制smoothened蛋白從而阻斷Hh信號(hào)通路[13], 而對(duì)Shh和Smoothened基因的表達(dá)沒(méi)有太大影響。在環(huán)巴胺處理后的仔魚(yú)中, Patched1、Gli2基因在腹側(cè)眼眶下區(qū)域和上下唇區(qū)域幾乎不表達(dá), 均與對(duì)照組的表達(dá)差異明顯, 可能是因?yàn)榄h(huán)巴胺直接與smoothened蛋白緊密結(jié)合抑制smoothened的活性, 從而抑制下游通路, 這時(shí)下游的Gli蛋白在蛋白酶體內(nèi)被截?cái)? 并以羧基端被截?cái)嗟男问竭M(jìn)入細(xì)胞核內(nèi), 變成轉(zhuǎn)錄阻遏因子, 抑制下游靶基因Patched1、Gli2的轉(zhuǎn)錄[13,21]。

我們運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析、整體原位雜交等實(shí)驗(yàn)技術(shù), 在分子水平上初步表明了Hedgehog可能參與西伯利亞鱘側(cè)線機(jī)械和電感受器的分化。隨著近年來(lái)CRISPR/Cas9特異基因敲除技術(shù)的不斷進(jìn)步, 在西伯利亞鱘中Hedgehog信號(hào)通路基因的特異性敲除將為我們提供更有利的證據(jù)。

圖 5 Shh、Patched1、Smoothened、Gli2基因在西伯利亞鱘頭部的表達(dá)Fig. 5 The expression of Shh, Patched1, Smoothened and Gli2 in head of Siberian sturgeon st32, st36頭部背面觀; st41. 頭部腹面觀或側(cè)面觀; cns: 中樞神經(jīng)系統(tǒng); ac: 聽(tīng)囊; ba: 鰓弓; n: 脊索; vi: 腹側(cè)眼眶下區(qū)域; l: 上下唇區(qū)域; 標(biāo)尺為0.2 mmst32, st36. dorsal view; st41. ventral view or lateral view; cns: central nervous system; ac: auditory capsule; ba: branchial arch; n: notochord; vi: ventral infraorbital field; l: lip. The scale bar. 0.2 mm

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THE INITIAL EVIDENCE FOR HEDGEHOG SIGNALING INVOLVED IN THE DIFFERENTIATION OF MECHANORECEPTORS AND ELECTRORECEPTORS IN THE LATERAL LINE SYSTEM IN SIBERIAN STURGEON

TANG Zhi-Jiao1,2,3, FAN Chun-Xin1,2,3, WANG Jian1,3and SONG Jia-Kun1,2,3
(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Institute for Marine Biosystem and Neurosciences, Institute for Marine Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The lateral line system of some amphibians, all chondrichthyan and non-neopterygian fish is consisted of mechanoreceptors and electroreceptors that are originated from lateral line placodes. However, the molecular mechanism of mechanoreceptor and electroreceptor differentiation remains unclear. Hedgehog is a critical morphogen for pattern formation and stem cell differentiation of multiple organs. In this study, we investigated the relationship between hedgehog signaling and the differentiation of neuromast and ampullary organ in Siberian sturgeon. We found dynamic expression of Shh and Patched1 via the transcriptome analysis in regenerating neuromast and ampullary organ. Furthermore, inhibiting hedgehog signaling by cyclopamine from stage 29 to stage 37 reduced the number of ampullary organs specifically. In addition, cyclopamine repressed the expression of Shh, Patched1, Smoothened, and Gli2 in the ventral region of head. These results indicated that hedgehog signaling was related with the development ampullary organ in Siberian sturgeon.

Siberian sturgeon; Neuromast; Ampullary organ; Hedgehog signaling; Cyclopamine

Q344+.1

A

1000-3207(2017)02-0363-08

10.7541/2017.44

2016-03-15;

2016-06-24

上海海洋大學(xué)國(guó)際海洋研究中心(A-0209-15-0802); 上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(A2-2019-14-0001-4); 上海市教委創(chuàng)新項(xiàng)目(12YZ129); 上海海洋大學(xué)博士啟動(dòng)基金(A2-0203-00-100314)資助 [Supported by the International Center for Marine Studies, Shanghai Ocean University (Sensory Neurobiology A-0209-15-0802); Shanghai Universities First-class Disciplines Project of Fisheries (A2-2019-14-0001-4); Innovation Program of Shanghai Municipal Education Commission (12YZ129); Shanghai Ocean University Doctoral Scientific Research Foundation]

唐智嬌(1990—), 女, 江西贛州人; 碩士研究生; 主要研究方向?yàn)樯窠?jīng)發(fā)育生物學(xué)。E-mail: zjtang2016@163.com

范純新, E-mail: cxfan@shou.edu.cn