亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        卵巢成熟期和退化期星斑川鰈腦垂體和下丘腦組織的轉(zhuǎn)錄組比較分析

        2017-04-12 09:49:30江王麗娟王波鄭鳳榮王長(zhǎng)海
        水生生物學(xué)報(bào) 2017年2期
        關(guān)鍵詞:成熟期測(cè)序卵巢

        周 江王麗娟王 波鄭鳳榮王長(zhǎng)海

        (1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210095; 2. 中華人民共和國(guó)鹽城出入境檢驗(yàn)檢疫局,鹽城 224002; 3. 國(guó)家海洋局第一海洋研究所, 青島 260061)

        卵巢成熟期和退化期星斑川鰈腦垂體和下丘腦組織的轉(zhuǎn)錄組比較分析

        周 江1王麗娟2王 波3鄭鳳榮3王長(zhǎng)海1

        (1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210095; 2. 中華人民共和國(guó)鹽城出入境檢驗(yàn)檢疫局,鹽城 224002; 3. 國(guó)家海洋局第一海洋研究所, 青島 260061)

        為了解星斑川鰈(Starry Flounder, Platichthys stellatus)腦組織基因表達(dá)與卵巢發(fā)育調(diào)控的關(guān)系, 發(fā)掘相關(guān)功能基因, 研究提取卵巢成熟期和退化期星斑川鰈雌魚腦垂體和下丘腦組織總RNA, 運(yùn)用HiSeq 2000高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果經(jīng)拼接組裝后共獲得30640條Unigenes, Blast同源性比對(duì)顯示, 其中24128條Unigenes獲得注釋; 經(jīng)eggNog功能注釋后29137條Unigenes序列分為26類, 分別涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯機(jī)制等生理生化過(guò)程。KEGG pathway數(shù)據(jù)比對(duì)顯示, 卵巢成熟期涉及98種代謝途徑, 135條序列表達(dá)上調(diào); 卵巢退化期涉及192種代謝途徑, 648條序列表達(dá)上調(diào)。Unigenes表達(dá)量及表達(dá)差異分析表明在卵巢成熟期334條序列表達(dá)上調(diào), 卵巢退化期987條序列表達(dá)上調(diào)。獲得功能注釋的Unigene中, 408條涉及生殖調(diào)控和內(nèi)分泌調(diào)控, 參與生殖調(diào)控的信號(hào)分子有1508條。試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量 PCR研究了涉及生殖調(diào)控和內(nèi)分泌調(diào)控基因促性腺激素釋放激素(GnRH)、神經(jīng)激肽B(NKB)、促性腺激素(GtH)、促濾泡激素(FSH)、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子(Kiss)以及催乳素釋放肽受體(PrRPR)在卵巢兩個(gè)不同發(fā)育時(shí)期腦垂體和下丘腦的表達(dá)情況, 結(jié)果表明除FSH外, 其余均在卵巢退化期時(shí)期腦組織中表達(dá)升高, 與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致。

        星斑川鰈; 腦組織; 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序; 實(shí)時(shí)定量PCR

        星斑川鰈(Starry Flounder, Platichthys stellatus)又稱星突江鰈, 隸屬鰈形目鰈科川鰈屬, 為廣鹽、冷水性種類, 在中國(guó)、朝鮮、韓國(guó)、日本、俄羅斯及美國(guó)太平洋沿岸海域均有分布, 具有廣溫廣鹽、耐受性強(qiáng)、易于馴化和營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn), 是理想的集約化養(yǎng)殖對(duì)象[1]。近年來(lái), 雖然星斑川鰈人工繁育技術(shù)有所突破[2], 但對(duì)于其卵巢發(fā)育的調(diào)控機(jī)制卻了解不多。目前, 國(guó)內(nèi)外有關(guān)星斑川鰈的研究報(bào)道多集中在其生長(zhǎng)[3], 生物學(xué)地位[4,5]、生態(tài)分布以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]等方面, 少數(shù)學(xué)者的研究涉及了星斑川鰈的種群遺傳結(jié)構(gòu)和生理、生化等方面[6—8], 我國(guó)于2004年開始對(duì)星斑川鰈親魚培育技術(shù)進(jìn)行研究[9]之后相繼對(duì)人工育苗和工廠化養(yǎng)殖技術(shù)[10,11]、胚胎發(fā)育[12]、幼魚形態(tài)發(fā)育與生長(zhǎng)[13]進(jìn)行了研究,對(duì)于星斑川鰈繁殖相關(guān)分子機(jī)制研究還未見報(bào)道。由于魚類配子發(fā)生和性腺成熟是通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)經(jīng)由腦-垂體-性腺軸調(diào)控得以實(shí)現(xiàn), 其結(jié)果表現(xiàn)為性腺發(fā)育周期性變化, 下丘腦分泌促性腺激素釋放激素, 垂體隨后分泌促性腺激素, 性腺接受調(diào)控分泌相應(yīng)的性激素和孕激素, 隨后性腺發(fā)育,成熟后進(jìn)入生殖階段, 完成繁殖后即退化。繁殖和退化過(guò)程的完成經(jīng)過(guò)了許多結(jié)構(gòu)和功能的轉(zhuǎn)變, 了解調(diào)控這些轉(zhuǎn)變的因子是研究星斑川鰈人工繁殖的關(guān)鍵。

        對(duì)魚類卵巢發(fā)育的調(diào)控及影響的早期研究多從內(nèi)分泌角度出發(fā), 但轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù)的應(yīng)用為研究硬骨魚類卵巢發(fā)育及排卵的分子調(diào)控機(jī)制提供了新的工具[14,15]。迄今為止, 有關(guān)卵巢發(fā)育轉(zhuǎn)錄表達(dá)的研究工作較多地集中在模式魚類, 如斑馬魚(Danio rerio)、鰷(Pimephales promelas)[16,17], 盡管近期在養(yǎng)殖魚類, 如花條鱸(Morone saxatilis)、橄欖比目魚(Paralichthys olivaceus)等也有關(guān)于卵巢轉(zhuǎn)錄組研究報(bào)道, 但這些研究或者采用的定量效率較弱:如基因芯片技術(shù)、抑或是各期卵巢的混合樣品, 其關(guān)注的依然是卵巢器官特異基因表達(dá)的特性分析, 而非對(duì)不同成熟期的卵巢轉(zhuǎn)錄特征進(jìn)行分析[18, 19]。

        轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以獲得特定細(xì)胞在某一狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA, 包括非編碼RNA和信使RNA (mRNA), 可高通量地獲得基因表達(dá)的RNA水平有關(guān)信息, 通過(guò)獲得研究對(duì)象基因組轉(zhuǎn)錄區(qū)域的信息, 鑒定轉(zhuǎn)錄發(fā)生位點(diǎn), 可變剪切等, 可對(duì)基因進(jìn)行精確的定量分析[20—22]。目前, 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已逐步取代基因芯片技術(shù), 成為從全基因組水平研究基因表達(dá)的主流方法。為了詳細(xì)了解星斑川鰈的繁殖機(jī)理和遺傳特點(diǎn), 本研究借助高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)卵巢成熟期和退化期星斑川鰈腦垂體和下丘腦組織進(jìn)行了分析, 為今后我國(guó)星斑川鰈人工繁殖技術(shù)水平提高以及雜交育種和品種改良研究提供技術(shù)支持。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料及總RNA提取

        試驗(yàn)用星斑川鰈取自日照海洋水產(chǎn)資源增殖站, 隨機(jī)取樣卵巢成熟期和退化期健康星斑川鰈3齡雌性親魚各10尾(1053.6±42.5) g, 分別取腦垂體和下丘腦組織后迅速投入液氮轉(zhuǎn)入-80℃保存待用??俁NA提取方法參照Trizol Reagent (Invitrogen)說(shuō)明書進(jìn)行, 以1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)總RNA質(zhì)量。

        1.2 樣品前處理及測(cè)序

        將卵巢成熟期和退化期親魚腦垂體和下丘腦組織RNA檢測(cè)濃度和純度后, 各選取5條質(zhì)量最佳的親魚RNA作為混合測(cè)序樣品。根據(jù)測(cè)得的RNA濃度, 將符合要求的RNA樣品等量混合至新離心管中, 再次檢測(cè)混合后RNA樣品的濃度和純度?;旌虾驲NA樣品置于1.5 mL離心管中送上海派森諾公司測(cè)序。

        將提取的卵巢成熟期和退化期的星斑川鰈腦垂體和下丘腦總RNA用帶有Oligo (dt)的磁珠富集mRNA, 由反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物將片段化的mRNA合成cDNA第一鏈, 第二鏈合成使用緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase Ⅰ, 經(jīng)核酸外切酶和聚合酶進(jìn)行末端修復(fù), 連接接頭, 分離純化, 擴(kuò)增DNA文庫(kù)。采用Picogreen和熒光分光光度計(jì)定量文庫(kù), Agilent 2100控制PCR富集片段質(zhì)量, 驗(yàn)證DNA文庫(kù)質(zhì)量, 樣品稀釋至4—5 pmol/L后上機(jī)測(cè)序。

        利用HiSeq 2000平臺(tái)獲得星斑川鰈卵巢成熟期和退化期腦垂體和下丘腦組織圖像序列信息, 然后轉(zhuǎn)化為相應(yīng)核苷酸序列, 進(jìn)行可信度分析及質(zhì)量評(píng)估。去除低質(zhì)量序列, 運(yùn)用Velvet和Oases軟件進(jìn)行組裝拼接, blast聚類得到Unigene(http://www.ebi.ac. uk/~zerbino/velvet; http://www.ebi.ac.uk/~zerbino/ oases)[23,24]。

        1.3 序列比對(duì)、eggNOG功能注釋、KEGG代謝通路分析及表達(dá)差異分析

        將所得序列與SwissProt、nr、Non Redudant數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì), 統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄基因具有高度相似性的序列, 獲取最佳注釋(E-value<10-5); 將所有序列在eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)(E-value<10-5), 獲得表達(dá)序列的NOG功能注釋及分類,收集建立基因同源組群, 包括COG和KOG數(shù)據(jù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG; http://eggnog. embl.de/)[25]。

        使用RPKM值(Reads per kb per million reads),計(jì)算基因表達(dá)量, 2-fold法統(tǒng)計(jì)成熟期和退化期序列RPKM值差異(定義: 一條序列的RPKM值在成熟期大于或等于退化期的2倍, 則為成熟期表達(dá)上調(diào),反之則為退化期表達(dá)上調(diào)。若兩時(shí)期RPKM值差異不超過(guò)2倍, 則為表達(dá)無(wú)差異) 。全部序列在KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì), 獲得相關(guān)序列代謝通路注釋及在代謝通路中的具體位置信息(http://www. genome.jp/kegg/)[26,27]。

        1.4 GnRH、NKB、GtH、Kiss、FSH及PrRPR在不同卵巢發(fā)育時(shí)期實(shí)時(shí)定量PCR分析

        為驗(yàn)證RNA測(cè)序結(jié)果, 將進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序時(shí)提取的卵巢成熟期和退化期星斑川鰈腦垂體和下丘腦組織總RNA各取3個(gè)樣本, 使用Prime ScriptTMII 1st strand cDNA synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。按照Real-time PCR說(shuō)明書FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng), 所用引物如表 1, 目的基因Ct值取3個(gè)平行均值, 管家基因β-actin為內(nèi)參, 目的基因Ct值與內(nèi)參基因的Ct值之間差異稱為ΔΔCt, 2-ΔΔCt值即為樣品的該基因的相對(duì)表達(dá)水平[28], 設(shè)成熟期為對(duì)照,即成熟期樣品的值均設(shè)為1倍, PCR反應(yīng)條件為: 95℃, 10min; 95℃, 15s; 60℃, 60s; 72℃, 1min, 40個(gè)循環(huán)。

        2 結(jié)果

        2.1 序列注釋及分析

        拼接組裝得到的30640條Unigenes經(jīng)Blast同源比對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù), 其中24128條獲得同源序列注釋,占總數(shù)的78.75% (E-value<10-5)。將全部Unigenes進(jìn)行eggNOG注釋后, 歸入適當(dāng)?shù)膃ggNOG簇。在功能已知的29137條Unigenes中, 按功能不同將其分為26大類, 其中涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的Unigenes所占比例最大, 為21.20%, 其次是涉及基本功能和轉(zhuǎn)錄機(jī)制的Unigenes各占9.29%和8.84% (圖 1)。利用RPKA值差異顯著性(P<0.05)計(jì)算兩個(gè)卵巢發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)量, 并用2-fold法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析差異表達(dá)基因分析(圖 2)。在獲得的轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)中, 成熟期表達(dá)上調(diào)的序列有334條, 退化期表達(dá)上調(diào)的序列有987條。

        表 1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Tab. 1 Sequences of Real-time PCR primers

        2.2 差異表達(dá)unigene的GO富集分析

        在兩期表達(dá)上調(diào)的1321條Unigenes與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)的結(jié)果顯示如圖 3所示, 三大功能分類分別包含了6、9和37個(gè)功能分類。在細(xì)胞組分分組中, 兩時(shí)期腦組織差異表達(dá)基因在細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞組分類型比例最高, 分別為22.60%、19.21%、19.21%和21.69%、18.81%和17.08%。在分子功能分組中, 兩時(shí)期腦組織差異表達(dá)基因在分子功能、離子結(jié)合所占比例較高, 為50.43%、27.35%和44.95%和29.62%。在生物學(xué)過(guò)程分組中, 兩時(shí)期腦組織差異表達(dá)基因在生物學(xué)過(guò)程、生物合成過(guò)程和細(xì)胞氮代謝過(guò)程所占比例較高, 分別為16.13%、8.06%、7.66%和17.69%、7.85%和6.62%。差異表達(dá)基因的GO功能富集分析表明, 在星斑川鰈卵巢發(fā)育過(guò)程中, 蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累, 包括鈣磷等微量元素在體內(nèi)的變化以及因此導(dǎo)致的胞內(nèi)胞外一系列信號(hào)應(yīng)答機(jī)制和相關(guān)激素的合成、釋放、調(diào)控生殖發(fā)育作用為此期間主要的神經(jīng)內(nèi)分泌行為。

        圖 1 Unigenes eggNOG功能分類Fig. 1 eggNOG function classification of unigenesA. RNA加工與修飾RNA processing and modification; B. 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與變化Chromatin structure and dynamics; C. 能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化Energy production and conversion; D. 細(xì)胞周期調(diào)控與分裂,染色體重排Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; E. 氨基酸運(yùn)輸與代謝Amino acid transport andmetabolism; F. 核苷酸運(yùn)輸與代謝Nucleotide transport and metabolism; G. 碳水化合物運(yùn)輸與代謝Carbohydrate transport and metabolism; H. 輔酶運(yùn)輸與代謝Coenzyme transport and metabolism; I. 脂類運(yùn)輸與代謝Lipid transport and metabolism; J.翻譯, 核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成Translation, ribosomal structure and biogenesis; K. 轉(zhuǎn)錄Transcription; L. 復(fù)制、重組與修復(fù)Replication, recombination and repair; M. 胞壁/膜生物發(fā)生Cell wall/memberance/envelope biogenesis; N. 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)Cell motility; O. 蛋白質(zhì)翻譯后修飾與轉(zhuǎn)運(yùn), 分子伴侶Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; P. 無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸與代謝Inorganic ion transport and metabolism; Q. 次生產(chǎn)物合成, 運(yùn)輸及代謝Secondary metabolites biosynthesis, transport andcatabolism; R. 一般功能基因General function prediction only; S. 功能未知Function unknown; T. 信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制Signal transduction mechanisms; U. 胞內(nèi)分泌與膜泡運(yùn)輸Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V. 防御機(jī)制Defense mechanisms; W. 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)Extracellular; X. 未確定Undetermined; Y.核酸結(jié)構(gòu)Nuclear structure; Z. 細(xì)胞骨架Cytoskeleton

        2.3 KEGG pathway注釋及富集分析

        KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)記錄細(xì)胞中基因產(chǎn)物的功能以及基因產(chǎn)物的相互作用網(wǎng)絡(luò), 基于KEGG通路的分析有助于我們進(jìn)一步了解基因的生物學(xué)功能以及所有可能的代謝途徑, 而且可以對(duì)催化各步反應(yīng)的酶進(jìn)行全面的注解。對(duì)全部序列進(jìn)行KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)和注釋, 結(jié)果表明成熟期涉及98種代謝途徑, 表達(dá)上調(diào)的序列有135條; 退化期涉及192種代謝途徑, 表達(dá)上調(diào)的序列有648條(圖 4)。結(jié)合差異表達(dá)基因的KEGG功能注釋結(jié)果, 進(jìn)行Pathway顯著性富集分析。共得到顯著富集的Pathway包括免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、信號(hào)分子相互作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、細(xì)胞通訊等代謝通路。此外,一些參與生殖、生長(zhǎng)和發(fā)育的功能基因分入卵母細(xì)胞減數(shù)分裂(Oocyte meiosis)和促性腺激素釋放激素信號(hào)通路(GnRH signaling pathway)(表 2)。通過(guò)對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析, 查找到與生殖發(fā)育調(diào)控以及內(nèi)分泌相關(guān)的基因有408條, 不同分類的生殖發(fā)育調(diào)控以及內(nèi)分泌相關(guān)的基因及數(shù)目如表3所示。參與生殖調(diào)控與內(nèi)分泌相關(guān)的信號(hào)分子及基因數(shù)目主要有鈣調(diào)蛋白98條、磷酸酯酶534條、蛋白激酶798條及環(huán)腺苷酸 87條, 共計(jì)1508條。

        圖 2 卵巢發(fā)育不同時(shí)期序列表達(dá)差異Fig. 2 Unigenes different expression in different ovary deve-lopment stages

        2.4 GnRH、NKB、GtH、Kiss、FSH及Pr-RPR在不同卵巢發(fā)育時(shí)期的腦組織中的表達(dá)驗(yàn)證

        圖 5所示, 生長(zhǎng)激素釋放激素GnRH、促性腺激素GtH、促濾泡激素FSH、PrRPR、神經(jīng)激肽BneurokininB及Kisspeptin基因在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)不同, GnRH、NKB、GtH、Kis和PrRPR在卵巢退化期的表達(dá)水平高, PrRPR的表達(dá)水平在退化期超過(guò)了成熟期的5倍, 而FSH則在卵巢成熟期的表達(dá)水平較高, 與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致, 盡管表達(dá)量存在一定差異。

        3 討論

        目前, RNA測(cè)序技術(shù)在魚類的研究中已經(jīng)發(fā)揮了重要作用, 郭威[29]利用該技術(shù)進(jìn)行了黃鱔腦及性腺轉(zhuǎn)錄組分析及差異基因篩選, 發(fā)現(xiàn)在3種不同性腺發(fā)育時(shí)期黃鱔間, 差異表達(dá)基因多集中在性腺中;程云英[30]對(duì)6月齡奧里亞羅非魚雌雄性腺經(jīng)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 發(fā)現(xiàn)二者中大部分基因表達(dá)模式相一致; Zucchi等[31]使用微陣列雜交的方法研究了雌性斑馬魚孕酮誘導(dǎo)后腦和卵巢中基因變化情況。星斑川鰈為我國(guó)新興的經(jīng)濟(jì)海水魚類, 具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 但該魚分子遺傳基礎(chǔ)研究較為薄弱, 基因組序列信息缺乏, 本研究采用HiSeq 2000高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)卵巢發(fā)育不同時(shí)期的星斑川鰈的腦組織進(jìn)行測(cè)序分析, 有望充實(shí)星斑川鰈的公共EST數(shù)據(jù)資源, 挖掘更多具有潛在價(jià)值的基因并更好地理解星斑川鰈生殖和發(fā)育的分子生物學(xué)機(jī)制。

        3.1 卵巢差異表達(dá)基因的分析

        本次測(cè)序共獲得30640條Unigenes, 24128Uni-genes能獲得生物信息學(xué)注釋。其中408條與生殖調(diào)控相關(guān), 而參與生殖調(diào)控的信號(hào)分子則有1508條。Unigenes的KEGG pathway數(shù)據(jù)比對(duì)分析,卵巢成熟期涉及98種代謝途徑, 表達(dá)上調(diào)的序列有135條; 卵巢退化期涉及192種代謝途徑, 表達(dá)上調(diào)的序列有648條。Unigenes表達(dá)量及表達(dá)差異分析表明在卵巢成熟期基因表達(dá)上調(diào)的334條Unigenes,在卵巢退化期表達(dá)上調(diào)987條Unigenes。

        圖 3 Unigenes的GO分類Fig. 3 GO classification of unigenes

        圖 4 KEGG信號(hào)通路中的unigenes數(shù)量分布Fig. 4 The distribution of unigenes in KEGG pathway

        表 2 星斑川鰈卵巢發(fā)育相關(guān)基因Tab. 2 The Genes involved in ovary development of Platichthys stellatus

        表 3 生殖調(diào)控相關(guān)的基因Tab. 3 The genes involved in procreation regulation

        圖 5 GnRH、FSH、NKB、GtH、Kis、PrRPR在卵巢成熟期和退化期腦組織中的表達(dá)Fig. 5 The expression of GnRH, NKB, FSH, GtH, Kiss and PrRPR during the stage of ovary maturation and stage of ovary degeneration

        星斑川鰈的卵巢發(fā)育是屬于非同步型, 繁殖期分批成熟多次產(chǎn)卵, 即卵巢內(nèi)含有至少兩種處于不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞群, 在第一次排卵結(jié)束后卵巢中還存留相當(dāng)部分的待成熟卵母細(xì)胞。據(jù)本研究結(jié)果顯示, 在第一次排卵前, 差異表達(dá)基因中包括促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蛋白磷酸酶、微管蛋白、過(guò)氧化物酶、果糖-二磷酸醛縮酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、鐵傳遞蛋白、二氫蝶啶還原酶等基因, 涉及的信號(hào)通路包括蛋白質(zhì)、脂肪代謝、鈣磷代謝, 而有關(guān)促性腺激素釋放激素、促性腺激素的調(diào)控基因等只是常態(tài)表達(dá), 這說(shuō)明了在此期間, 卵巢發(fā)育需要大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及微量元素的支持而相關(guān)的性激素只是緩慢平穩(wěn)的上升; 排卵行為產(chǎn)生是以促性腺激素分泌到峰值為先導(dǎo), 與此相對(duì)應(yīng), 在本研究中,星斑川鰈雌魚排卵過(guò)程中差異表達(dá)基因包括促性腺激素釋放激素受體、神經(jīng)肽Y、胰島素樣生長(zhǎng)因子、電壓門控鈣離子通道、孕激素受體等一批配合排卵過(guò)程調(diào)控的基因表達(dá)都變?yōu)樯险{(diào)狀態(tài), 據(jù)對(duì)金魚、鯉等的研究表明, 促性腺激素釋放激素刺激促性腺激素釋放依賴于細(xì)胞外鈣離子的有效性, 白細(xì)胞介素等免疫因子參與排卵過(guò)程的調(diào)控[32—35]。

        采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法對(duì)與生殖調(diào)控相關(guān)的基因進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn), FSH基因在星斑川鰈性腺成熟期時(shí)的腦組織中表達(dá)較高, 而GtH、PrRPR、NKB、GnRH以及Kiss則在退化期的表達(dá)水平較高。Levavi等[36]在鮭科魚中的研究表明, FSH主要在性腺發(fā)育早期起調(diào)控作用, 并不參與排卵的調(diào)控,而LH主要參與配子成熟和排出, Rocha等[37]在舌齒鱸中的研究發(fā)現(xiàn), FSHR強(qiáng)烈表達(dá)于卵黃生成期和早期卵黃生成階段, 但并不表達(dá)于成熟卵細(xì)胞, 真鯛(Pagrus major) LHβ轉(zhuǎn)錄本在兩性配子發(fā)生到排出始終保持較高水平[38]。這些結(jié)果表明GtHs在硬骨魚生殖調(diào)控中的功能存在一定的種屬特異性。

        3.2 與卵巢發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路

        從本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中, 胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin Dependent Kinase, CDK)、細(xì)胞分裂周期因子(cell division cycle, cdc)、p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase)、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 (ERK1/2)等一系列關(guān)鍵酶和受體調(diào)節(jié)因子蛋白激酶A (PKA)都被發(fā)現(xiàn)。其中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extra-cellular signal-regulated kinase, ERK)信號(hào)通路、p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38)信號(hào)通路、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase, JNK)信號(hào)通路和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5 (extracellular-regulated kinase 5, ERK5)信號(hào)通路[39]是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的子通路, 各子途徑相互交錯(cuò)聯(lián)系并作用, 形成一個(gè)巨大的信息傳遞網(wǎng)。據(jù)研究, MAPK信號(hào)通路在海星(Asterina miniata)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程發(fā)揮重要作用, 即MAPK途徑維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂MI期的穩(wěn)定, 但也人有認(rèn)為MI期停滯與MAPK途徑無(wú)關(guān), 但MAPK會(huì)影響排卵后的MI期的長(zhǎng)短[40]。Roux等[41]發(fā)現(xiàn)MAPK通路會(huì)影響紫海膽(Strongylocentrotus purpuratus)精子和卵子的結(jié)合, 由此可見, MAPK信號(hào)通路對(duì)卵子發(fā)生、精子形成和性腺發(fā)育都有著顯著的功能。

        [1]Liu S L, Wang B, Liu Z H, et al. Analysis and evaluation of the nutrition of platichthys stellatus [J]. Progress in Fishery Sciences, 2009, 30(6): 18—24 [劉世祿, 王波, 劉振華, 等. 星斑川鰈的營(yíng)養(yǎng)分析與評(píng)價(jià). 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2009, 30(6): 18—24]

        [2]Wang B, Wang Z L, Sun P X, et al. The development prospect of the breeding conditions of Platichthys stellatus [J]. Fishery Modernization, 2006, 5: 16—18 [王波, 王宗靈, 孫丕喜, 等. 星斑川鰈的養(yǎng)殖條件及發(fā)展前景. 漁業(yè)現(xiàn)代化, 2006, 5: 16—18]

        [3]Campana S E, Neilson J D. Daily growth increments in otoliths of starry flounder (Platichthys stellatus) and the influence of some environmental variables in their production [J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 2011, 39(7): 937—942

        [4]Ma A J, Zhuang Z M, Li C, et al. The biologic characteristics of starry flounder (Platichthy stelltus Pallas) [J]. Marine Fisheries Rresearch, 2006, 27(5): 91—95 [馬愛軍, 莊志猛, 李晨, 等. 星突江鰈生物學(xué)特性及養(yǎng)殖前景.海洋水產(chǎn)研究, 2006, 27(5): 91—95]

        [5]Qi G S, Li D, Chen S Q, et al. Morphological characteristics and internal structure of Platichthys stellatus Pallas [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2008, 15(1): 1—11 [齊國(guó)山, 李迪, 陳四清, 等. 星突江鰈的形態(tài)特征及內(nèi)部結(jié)構(gòu)研究. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2008, 15(1): 1—11]

        [6]You F, Wu Z H, Li J, et al. RAPD analysis of genetic diversity in cultured stock of Platichthys stellatus [J]. Advances in Marine Science, 2007, 25(1): 73—78 [尤鋒, 吳志昊, 李軍, 等. 星斑川鰈(Platichthys stellatus)養(yǎng)殖群體的RAPD分析. 海洋科學(xué)進(jìn)展, 2007, 25(1): 73—78]

        [7]Park J Y, Kijima A. Genetic variability and differentiation within and between the stone flounder (Kareius bicoloratus) and the starry flounder (Platichthys stellatus) [J]. Tohoku Journal of Agricultural Research, 1991, 41(3—4): 69—82

        [8]Borsa P, Blanquer A, Berrebi P. Genetic structure of the flounders Platichthys flesus and P. stellatus at different geographic scales [J]. Marine Biology, 1997, 129(2): 233—246

        [9]Liu Z H, Wang S X, Wang B, et al. Study on the propagation controlling techniques of Platichthys stellatus [J]. Shandong Fisheries, 2007, 24(12): 1—2 [劉振華, 王森勛, 王波, 等. 星斑川鰈親魚生殖調(diào)控技術(shù)研究. 齊魯漁業(yè), 2007, 24(12): 1—2]

        [10]Zheng C B, Jiang Q P. Essential of artificial of platichthys stellatus (Pallas) [J]. Moedern Fisheries Information, 2006, 21(12): 31—33 [鄭春波, 姜啟平. 星斑川鰈Platichthys stellatus (Pallas)人工育苗技術(shù)要點(diǎn). 現(xiàn)代漁業(yè)信息, 2006, 21(12): 31—33]

        [11]Zheng C B, Jiang Q P. Industrial aquaculture technology of Starry Flounder Platichthys stellatus [J]. Fisheries Science and Technology Information, 2007, 34(3): 34—35 [鄭春波, 姜啟平. 星斑川鰈工廠化養(yǎng)殖技術(shù). 水產(chǎn)科技情報(bào), 2007, 34(3): 34—35]

        [12]Wang B, Liu Z H, Sun P X, et al. The morphological observation on the embryonic development of Starry Flounder, Platichthys stellatus [J]. Haiyang Xuebao, 2008, 30(2): 130—136 [王波, 劉振華, 孫丕喜, 等. 星斑川鰈胚胎發(fā)育的形態(tài)觀察. 海洋學(xué)報(bào), 2008, 30(2): 130—136]

        [13]Liu Z H, Wang B, Yao Z G, et al. Morphological development and growth of larval and juvenile fish of Starry Flounder, Platichthys stellatus [J]. Advances in Marine Science, 2008, 26(1): 90—97 [劉振華, 王波, 姚振剛, 等.星斑川鰈仔、稚、幼魚的形態(tài)發(fā)育與生長(zhǎng). 海洋科學(xué)進(jìn)展, 2008, 26(1): 90—97]

        [14]Clelland E, Peng C. Endocrine/paracrine control of zebrafish ovary development [J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2009, 312(1-2): 42—52

        [15]Lubzens E, Young G, Bobe J, et al. Oogenesis in teleosts: how fish eggs are formed [J]. General and Comparative Endocrinology, 2010, 165(3): 367—389

        [16]Li Y, Chia J M, Bartfai R, et al. Comparative analysis of the testis and ovary transcriptomes in zebrafish by combining experimental and computational tools [J]. Com Parative and Fuctional Genomics, 2004, 5(5): 403—418

        [17]Wang R L, Bencic D C, Garcia-Reyero N, et al. Natural variation in fish transcriptomes: comparative analysis of the fathead minnow (Pimephales promelas) and zebrafish (Danio rerio) [J]. Plos One, 2014, 9(9): e114178

        [18]Chapman R W, Reading B J, Sullivan C V. Ovary transcriptome profiling via artificial intelligence reveals a transcriptomic fingerprint predicting egg quality in striped bass, Morone saxatilis [J]. Plos One, 2014, 9(5): e96818

        [19]Fan Z, You F, Wang L, et al. Gonadal transcriptome analysis of male and female olive flounder (Paralichthys oli-vaceus) [J]. Biomed Research International, 2014, 2014(10): 1153—1166

        [20]Hua W P, Zhang Y, Song J, et al. Denovo transcriptome sequencing in Salvia miltiorrhiza to identify genes involved in the biosynthesis of active ingredients [J]. Genomics, 2011, 98(4): 272—279

        [21]Zheng M G, Tian J H, Yang G P, et al. Transcriptome sequencing, annotation and expression analysis of Nannochloropsis sp. at different growth phases [J]. Gene, 2013, 523(2): 117—121

        [22]Zhang Z, Li B, Wang Y G, et al. The microflora structure in digestive tract of half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis Gunther) cultured in outdoor pond basing on high-through sequencing technique [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2015, 39(1): 38—45 [張正, 李彬, 王印庚,等. 基于高通量測(cè)序的池塘養(yǎng)殖半滑舌鰨消化道菌群的結(jié)構(gòu)特征分析. 水生生物學(xué)報(bào), 2015, 39(1): 38—45]

        [23]Grabherr M G, Haas B J, Yassour M, et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome [J]. Nature Biotechnology, 2011, 29(7): 644—652

        [24]Radakovits R, Jinkerson R E, Fuerstenberg S I, et al. Draft genome sequence and genetic transformation of the oleaginous alga: Nannochloropsis gaditana [J]. Nature Communications, 2012, 3(2): 686

        [25]Tatusov R L, Fedorova N D, Jackson J D, et al. The COG database: an updated version includes eukaryotes [J]. BMC Bioinformatics, 2003, 4(1): 41

        [26]Mortazavi A, Williams B A, Mccue K, et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq [J]. Nature Methods, 2008, 5(7): 621—628

        [27]Kanehisa M, Araki M, Goto S, et al. KEGG for linking genomes to life and the environment [J]. Nucleic Acids Research, 2008, 36: D480—D484

        [28]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod [J]. Methods, 2001, 25(4): 402—408.

        [29]Guo W. Screening of Different Express Sex-related Genes and Changes of Serum Hormones Level in Monopterus albus [D]. Thesis for Master of Science. Huazhong Agricultural University, Wuhan. 2014 [郭威. 黃鱔性別差異表達(dá)基因的篩選及血清激素水平的變化. 碩士學(xué)位論文, 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 武漢. 2014]

        [30]Cheng Y Y. Comparative analyses of gonadal transcriptomes from two closely related tilapiines at 180 dah and bioinfonnatic analyses of NR super family [D]. Thesis for Master of Science. Southwest University, Chongqing. 2015 [程云英. 兩種羅非魚6月齡性腺轉(zhuǎn)錄組比較及NR超家族生物信息學(xué)分析. 碩士學(xué)位論文, 西南大學(xué),重慶. 2015]

        [31]Zucchi S, Castiglioni S, Fent K. Progesterone alters global transcription profiles at environmental concentrations in brain and ovary of female zebrafish (Danio rerio) [J]. Environmental Science & Technology, 2013, 47(21): 12548—12556

        [32]Richards J S, Liu Z L, Shimada M. Immune-like mechanisms in ovulation [J]. Trends in Endocrinology & Metabolism, 2008, 19(6): 191—196

        [33]Liu Z L, Shimada M, Richards J S. The involvement of the toll-like receptor family in ovulation [J]. Journal of Assisted Reproduction Genetics, 2008, 25(6): 223—228

        [34]Bobe J, Goetz F W. A tumor necrosis factor decoy receptor homologue is up-regulated in the brook trout (Salvelinus fontinalis) ovary at the completion of ovulation [J]. Biology of Reproduction, 2000, 62(2): 420—426

        [35]Bobe J, Goetz F W. Molecular cloning and expression of a TNF receptor and two TNF ligands in the fish ovary [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2001, 129(2—3): 475—481

        [36]Levavi S B, Bogerd J, Mananos E L, et al. Perspectives on fish gonadotropins and their receptors [J]. General and Comparative Endocrinology, 2010, 165(3): 412—437

        [37]Rocha A, Gomez A, Zanuy S, et al. Molecular characterization of two sea bass gonadotropin receptors: cDNA cloning, expression analysis, and functional activity[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2007, 272(1—2): 63—76

        [38]Gen K, Yamaguchi S, Okuzawa K, et al. Physiological roles of FSH and LH in red seabream, Pagrus major [J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2003, 28(1): 77—80

        [39]Junttila M R, Li S P, Westermarck J. Phosphatase-mediated crosstalk between MAPK signaling pathways in the regulation of cell survival [J]. Faseb Journal, 2008, 22(4): 954—965

        [40]Usui K, Hirohashi N, Chiba K. Involvement of mitogenactivating protein kinase and intracellular pH in the duration of the metaphase I (MI) pause of starfish oocytes after spawning [J]. Development Growth & Regeneration, 2008, 50(5): 357—364

        [41]Roux M M, Townley I K, Raisch M, et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation [J]. Developmental Biology, 2007, 300(1): 416—433

        COMPARISON ANALYSIS ON TRANSCRIPTOME IN THE PITUITARY GLAND AND HYPOTHALAMUS OF STARRY FLOUNDER (PLATICHTHYS STELLATUS) AT THE OVARY MATURATION AND DEGRADATION STAGES

        ZHOU Jiang1, WANG Li-Juan2, WANG Bo3, ZHENG Feng-Rong3and WANG Chang-Hai1
        (1. Jiangsu Provincial Key Laboratory of Marine Biology, College of Resources and Environmental Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Yancheng Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau of the People’s Republic of China, Yancheng 224002, China; 3. The First Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Qingdao 260061, China)

        To investigate the relationship of genes expression between brain tissue and ovary development, and explore more functional genes of Platichthys stellatus, total RNA from the mixed sample of pituitary gland and hypothalamus at the ovary maturation and degradation stages were isolated and sequenced by HiSeq 2000 high throughput sequencing technology. After assembly and splicing, 24128 unigenes from a total of 30640 unigenes were annotated based on the blast homology alignment. All 29137 unigenes with eggNog annotations were divided into 26 categories that were involved in physiological processes, such as signaling transduction, translation mechanism, etc. The results from KEGG pathway analysis showed that all unigenes at the ovary maturation stage were involved in metabolic pathways with 135 up-regulated sequences, while the unigenes at the ovary degradation stage were associated with 192 metabolic pathways with 648 up-regulated sequences. Moreover, 334 differentially expressed genes (DEGs) were up-regulated at the ovary maturation stage, while 987 up-regulated DEGs were observed at the ovary degradation stage. Total 408 unigenes were involved in reproductive and endocrine regulation, and 1508 unigenes were involved in signaling molecules. The expression of some reproduction-associated DEGs including growth hormone releasing hormone (GnRH), neurokinin B (NKB), gonadotropin (GtH), follicle stimulating hormone (FSH), kisspeptin (Kiss), and prolactin-releasing peptide receptor (PrRPR) were verified by qRT-PCR. All genes except FSH were consistent with the results of the transcriptome sequencing.

        Platichthys stellatus; Brain tissue; Transcriptome sequencing; qRT-PCR

        S961.6

        A

        1000-3207(2017)02-0346-10

        10.7541/2017.42

        2016-05-26;

        2016-07-11

        國(guó)家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃“863項(xiàng)目”(2012AA10A413、2012AA10A408); 國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201305005)資助[Supported by the National High-tech R&D Program “863 Program” (2012AA10A413, 2012AA10A408); Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean (201305005)]

        周江(1979—), 男, 湖北荊州人; 博士研究生; 主要從事海洋生物學(xué)研究。E-mail: zhoujiang768@126.com

        王長(zhǎng)海(1962—), 男, 山東煙臺(tái)人; 教授、博士生導(dǎo)師; 主要從事海洋生化工程研究。E-mail: chwang@njau.edu.cn

        猜你喜歡
        成熟期測(cè)序卵巢
        杰 Sir 帶你認(rèn)識(shí)宏基因二代測(cè)序(mNGS)
        新民周刊(2022年27期)2022-08-01 07:04:49
        保養(yǎng)卵巢吃這些
        二代測(cè)序協(xié)助診斷AIDS合并馬爾尼菲籃狀菌腦膜炎1例
        傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:58
        卵巢多囊表現(xiàn)不一定是疾病
        陳曉明 進(jìn)入加速期和成熟期,未來(lái)十五年是花都濱水新城黃金時(shí)代
        果實(shí)成熟期土壤含水量對(duì)‘北紅’葡萄花色苷和果實(shí)品質(zhì)的影響
        如果卵巢、子宮可以說(shuō)話,會(huì)說(shuō)什么
        不同成熟期桃品種在衢州市的引種試驗(yàn)
        浙江柑橘(2016年4期)2016-03-11 20:13:01
        基因捕獲測(cè)序診斷血癌
        單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)研究進(jìn)展
        五月天无码| 男人的天堂无码动漫av| 白天躁晚上躁麻豆视频| 日韩另类在线| 亚洲高清在线观看免费视频| 人妻在线有码中文字幕| 亚洲av无码一区二区三区网址| 人人狠狠综合久久亚洲| 精品一精品国产一级毛片| 日本一区二区高清视频在线| 国产一区二区三区四色av| 在线播放免费播放av片| 中文字幕av永久免费在线| 97人人模人人爽人人喊网| 日韩a毛片免费观看| 精品一区二区三区在线观看l| 我揉搓少妇好久没做高潮| 亚洲精品久久7777777| 一本色道久久综合狠狠躁| 亚洲综合网一区二区三区| 人妻久久一区二区三区| 我爱我色成人网| 国产亚洲欧美日韩综合综合二区| 亚洲大片一区二区三区四区| 亚洲av高清一区二区三| 纯爱无遮挡h肉动漫在线播放| 国产高清国内精品福利99久久| 亚洲精品国产av成拍色拍| 亚洲av永久无码精品漫画| 巨熟乳波霸若妻在线播放| 伊人不卡中文字幕在线一区二区 | 国产激情一区二区三区在线| 国产真实强被迫伦姧女在线观看| 亚洲自拍另类欧美综合| 亚洲大尺度动作在线观看一区 | 国产精品无码翘臀在线观看| 久久精品人人爽人人爽| 亚洲无线码一区在线观看| 五月激情在线视频观看| 蜜桃久久精品成人无码av| 亚洲无码a∨在线视频|