張飄逸李 偉朱新平洪孝友陳昆慈徐紅艷

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室, 廣州 510380; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

中華鱉vasa基因克隆及在卵母細胞中的表達分析

張飄逸1,2李 偉1朱新平1,2洪孝友1,2陳昆慈1,2徐紅艷1,2

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室, 廣州 510380; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

研究利用中華鱉為研究模型進行爬行類生殖細胞發(fā)育分化成熟等生物學(xué)研究, 克隆了中華鱉vasa基因的cDNA序列, 全長3865 bp, 包括5′端非編碼區(qū)90 bp, 3′端非編碼區(qū)1699 bp, 開放閱讀框長2076 bp, 共編碼691個氨基酸。中華鱉Vasa氨基酸序列包含DEAD-box家族蛋白8個保守保守功能域, 在N末端有4個RGG重復(fù)序列和2個GG富集區(qū), 與小鼠Vasa蛋白的同源性較高(72%)。熒光定量PCR的結(jié)果表明, 中華鱉vasa mRNA主要精巢和卵巢中表達, 其他體組織中均難檢測到表達。卵巢冰凍切片原位雜交結(jié)果顯示: 中華鱉vasa mRNA在生殖細胞中特異表達; 在卵子發(fā)生過程中的不同發(fā)育期卵母細胞中呈現(xiàn)動態(tài)的變化。即vasa mRNA在初級卵母細胞及生長期卵母細胞中表達最強, 且均勻分布在細胞質(zhì)中, 隨著卵母細胞的逐漸增大, 信號逐漸減弱, 直至在成熟的卵母細胞中幾乎檢測不到表達信號, 說明vasa可能在中華鱉早期卵母細胞發(fā)育中起重要作用。同時, vasa基因可作為中華鱉生殖細胞分子標(biāo)記物, 根據(jù)其mRNA的表達水平來鑒別不同發(fā)育時期的卵母細胞。研究結(jié)果為進一步開展中華鱉胚胎生殖細胞發(fā)育及配子生成, 特別是研究中華鱉, 乃至爬行類原始生殖細胞(Primordial Germ Cells, PGCs)的起源、遷移、分化等研究奠定了基礎(chǔ)。

vasa; 中華鱉; 生殖細胞; 卵子發(fā)生

Vasa蛋白是一種ATP依賴的RNA解旋酶, 屬于DEAD-box (Asp-Glu-Ala-Asp)家族。vasa基因最早發(fā)現(xiàn)于果蠅(Drosophila melanogaster)中, 是一個母源遺傳基因, 在生殖細胞分化中起重要作用[1]。vasa基因在動物中高度保守, 其同源基因在無脊椎動物和脊椎動物中得以廣泛研究, 包括果蠅(Drosophila melanogaster)[2]、家蠶(Bombyx mori)[3]、小鼠(Mus musculus)[4]、人(Homo sapiens)[5]、雞(Gallus gallus)[6]、斑馬魚(Danio rerio)[7]、青鳉(Oryzias latipes)[8]、異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)[9]、金目鱸(Lates calcarifer)[10]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[11]、紅耳龜(Trachemys scripta)[12]、蜥蜴(Podarcis sicula)[13]等。除線蟲等一些特例物種外, vasa基因僅限在生殖細胞中特異性表達, 因此被作為研究生殖細胞的分子標(biāo)記物, 廣泛應(yīng)用于生物的配子發(fā)生和原生殖細胞(Primordial Germ Cells, PGCs)起源、遷移、分化等方面的研究[14]。Vasa蛋白參與生殖系mRNA的翻譯調(diào)控[15], 是生殖細胞分化所必需的。在果蠅中, vasa基因突變造成雌性果蠅不育, 卵子發(fā)生過程中存在嚴重缺陷[16]。在老鼠中, vasa基因功能喪失會使雄性生殖細胞的增殖和分化受阻, 導(dǎo)致雄性老鼠不育, 而雌性仍然是可育的[17]。更重要的是, 研究表明vasa基因產(chǎn)物在動物卵母細胞中的表達及分布模式與動物胚胎PGCs的起源方式密切相關(guān)[18]。例如, 在一些模式生物中,包括果蠅、斑馬魚、爪蟾, vasa基因產(chǎn)物在卵子發(fā)生過程中的各期卵母細胞中均有表達, 并隨著卵母細胞的發(fā)育成熟, vasa基因產(chǎn)物逐漸集中分布到卵母細胞的特定區(qū)域-生殖質(zhì)區(qū), 與其他生殖質(zhì)因子相互作用形成生殖質(zhì)顆粒, 隨后在胚胎發(fā)育過程中,生殖質(zhì)顆粒決定PGCs的形成[15,16,19]。而在哺乳動物中, vasa基因產(chǎn)物只在早期卵母細胞中有表達,在晚期卵母細胞中檢測不到而且也沒有發(fā)現(xiàn)生殖質(zhì)顆粒的存在[20], 因此哺乳動物的PGCs起源方式完全不同于魚類的, 其PGCs是由胚外外胚層細胞分泌的信號分子誘導(dǎo)部分多能外胚層細胞發(fā)育形成的, 僅依靠細胞間的交互作用, 即細胞非自主的方式, 不受任何母源因子的調(diào)控[21]?？傊? 通過vasa等生殖細胞標(biāo)記基因, 各種低等無脊椎動物及哺乳類的生殖細胞的發(fā)育及分化都得以廣泛深入的研究。而爬行類, 特別是龜鱉類的生殖細胞發(fā)育模式還鮮有報道。爬行類是一支從古兩棲類分化出來的產(chǎn)羊膜卵的類群, 與鳥類哺乳類共稱為羊膜動物。而龜鱉類是現(xiàn)存于地球上的爬行動物中最古老的一類, 是產(chǎn)無羊膜卵動物演變成產(chǎn)羊膜卵動物實現(xiàn)進化飛躍的聯(lián)結(jié)點[22]。對其生殖細胞發(fā)育的研究, 不論在動物生殖生物學(xué)還是生殖進化領(lǐng)域都有很深遠的意義。

中華鱉(Pelodiscus sinensis), 隸屬于爬行綱(Repitlia)、龜鱉目(Testudinata)、鱉科(Tironychidae)、鱉屬(Peodiscus)。中華鱉具有很高的藥用、營養(yǎng)及觀賞價值, 因此受到廣大養(yǎng)殖戶和消費者的青睞, 是淡水養(yǎng)殖的重要組成部分。但是近幾十年來, 受環(huán)境破壞、濫捕等影響中華鱉野生資源相當(dāng)匱乏, 加上養(yǎng)殖場育種不規(guī)范, 養(yǎng)殖品種的種質(zhì)也日趨退化[23,24]。然而, 僅僅通過傳統(tǒng)選育技術(shù)進行種質(zhì)資源保護及改良已無法跟上日漸加劇的種質(zhì)退化速度, 因此結(jié)合傳統(tǒng)選育和現(xiàn)代細胞基因工程等育種新技術(shù), 進行龜鱉類種質(zhì)資源的保護與良種培育顯得十分迫切。迄今為止, 研究者們利用組織學(xué)、細胞學(xué)等方法對龜鱉類生殖細胞的發(fā)育和分化做了大量的結(jié)構(gòu)學(xué)及形態(tài)學(xué)研究[25—27], 而對其生殖細胞發(fā)育分化的分子機制尚未有清楚的了解, 導(dǎo)致龜鱉類動物生殖細胞工程育種、保種等的相關(guān)研究在國內(nèi)外的開展都極其有限。

本研究主要進行了中華鱉vasa基因cDNA全序列的克隆分析, 并初步分析了vasa轉(zhuǎn)錄本在中華鱉卵子發(fā)生過程中的表達及分布模式, 研究結(jié)果為將來進一步探討中華鱉, 乃至爬行類生殖細胞的起源及遷移以及理清動物生殖細胞發(fā)育方式在物種進化過程中的演變等奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用的中華鱉均采自廣州省惠州市財興實業(yè)有限公司中華鱉養(yǎng)殖場, 取1、2、3冬齡生長良好的中華鱉雌雄各3只。將實驗用中華鱉頸動脈放血, 掀開腹甲, 采集卵巢、精巢、心臟、肝臟、脾、腎、腦、血液, 用1xPBS (DEPC水配)稍稍清洗, 快速投入液氮中冷凍, 并放于-80℃冰箱中保存,用于總RNA提取。另取一部分精巢和卵巢組織, 用4%多聚甲醛(PFA)固定及甲醇脫水保存?zhèn)溆谩?/p>

本實驗所用的PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。RNA保存及提取試劑TriPure isolation Reagent、合成探針及雜交所用的digoxigenin (DIG) RNA Labeling Kit、Blocking Reagent、Anti-Digoxigenin-AP、Anti-Digoxigenin-POD、NBT/ BCIP Stock均購自羅氏(Roche)公司, RNase-free DNase Ⅰ、pGEM-T Easy載體購自Promega公司, M-MLV Frist Strand cDNA Synthesis Kit, Gel Extraction Kit為OMEGA公司產(chǎn)品, TransStart Tip Green qPCR SuperMix購自全式金公司, Taq酶、限制性內(nèi)切酶、pMD19-T載體購自TaKaRa公司產(chǎn)品,熒光染料及抗淬滅封片劑來自Life公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

總RNA提取和單鏈cDNA合成采集的體組織和性腺組織樣品用HiPure Total RNA Kit (Magen)試劑盒提取總RNA, 使用Nano Q分光光度計檢測總RNA的濃度和純度, 并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性, -80℃保存。取1 μg總RNA用M-MLV Frist Strand cDNA Synthesis Kit (OMEGA)合成第一條鏈cDNA, 操作按照試劑盒說明書進行。

中華鱉vasa基因全長cDNA克隆根據(jù)NCBI (XM_006139555.1)上預(yù)測的中華鱉vasa基因序列,設(shè)計特異性引物Ps vasaF和Ps vasaR (表 1)進行PCR擴增反應(yīng), 克隆獲得中華鱉vasa cDNA序列。PCR反應(yīng)條件為: 94℃ 3min; 98℃ 10s, 66℃ 40s, 72℃4min共38個循環(huán), 72℃ 5min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳, 確定目的片段后用Gel Extraction Kit (OMEGA)膠回收, 克隆到pMD19-T (TaKaRa)載體中, 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中, 經(jīng)藍白篩選挑取陽性克隆測序。根據(jù)獲得的Ps vasa cDNA序列, 使用Vector NTI Advance 11軟件預(yù)測氨基酸序列。使用NCBI數(shù)據(jù)庫上的BLASTN進行核苷酸序列比對, BLASTP進行氨基酸序列比對并同多種脊椎動物進行序列對比分析。采用MEGA 6軟件,按鄰近法(Neighbour-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,用自展法(Bootstrap)進行1000次檢驗。

熒光定量PCR根據(jù)測序所得的中華鱉vasa cDNA序列, 設(shè)計一對特異的定量引物PSvas1PS-vas2 (表 1), 以中華鱉ef1α為內(nèi)參基因, 設(shè)計引物ef1αF和ef1αR (表 1)。取1冬齡個體的精巢、卵巢、心、肝臟、脾、腎、腦、血液的總RNA, 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA, 用該cDNA作為模板, 進行PCR擴增, 每組設(shè)3個重復(fù)。擴增反應(yīng)在Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR Systems儀器上進行, 采用2-ΔΔCt法來計算相對表達量, 反應(yīng)程序: 50℃2min, 95℃預(yù)變性2min; 95℃ 15s, 60℃ 30s, 72℃30s, 40個循環(huán)。溶解曲線程序: 95℃ 15s, 60℃ 30s, 95℃ 15s。

表 1 中華鱉vasa基因克隆和mRNA表達引物Tab. 1 Primers used for vasa gene cloning and expression analysis of Chinese Soft-shell Turtle

原位雜交RNA探針制備選取中華鱉vasa cDNA序列3′端非編碼區(qū)(3′UTR)中的一段約1.3 kb的序列, 設(shè)計引物3′vasaF和3′vasaR (表 1)。將這段序列連接到pGEM-T載體中, 篩選陽性克隆提取質(zhì)粒。使用限制性內(nèi)切酶將載體質(zhì)粒線性化, 加入乙醇和醋酸鈉沉淀過夜。沉淀經(jīng)75%乙醇洗滌干燥后溶于DEPC水中。采用digoxigenin (DIG) RNA Labeling Kit, Roche體外轉(zhuǎn)錄正反義探針, 操作步驟按照說明書進行。

原位雜交操作剪刀剪取小塊的性腺組織,放入4%PFA中4℃固定過夜。用DEPC水配置的甲醇溶液梯度脫水(25%、50%、75%和100%), 保存在100%甲醇中-20℃保存。取一小塊組織用DEPC水配置的甲醇溶液梯度復(fù)水(75%、50%、25%), 然后用1×PBS洗滌2次, 最后放入30%蔗糖溶液中4℃過夜。用OCT包埋組織塊, 冷凍切片機切成6—8 μm厚的切片貼于防脫載玻片上。雜交具體過程依照已有報道進行[9]。化學(xué)顯色采用BCIP/NBT顯色液進行顯色, 熒光顯色則用TSATMPlus Fluorescence Systems (NEN Life Science)顯色, 碘化丙啶(PI)染核, 抗淬滅封固劑(Gold Antifade reagent, Invitrogen)封片, 顯微觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 中華鱉vasa cDNA克隆及序列分析

實驗克隆得到中華鱉vasa cDNA全序列與NCBI GenBank預(yù)測的DDX4序列的一致性達～99% (XM_006139555.1), cDNA全長3865 bp, 5′端非編碼區(qū)(5′UTR)90 bp, 3′端非編碼區(qū)(3′UTR)1699 bp, 開放閱讀框(Open reading frame, ORF)長2076 bp, 編碼691個氨基酸。氨基酸序列包含DEAD-box家族蛋白8個保守功能域, 分別是AQTGSGKT (motifⅠ)、PTRELI (motifⅠa)、TPGR (motifⅠb)、DEAD (motifⅡ)、SAT (motif Ⅲ)、RGLD (motif Ⅴ)、HRIGRTG (motif Ⅵ)、GYSKLTPVQ (motif Q); 在N末端有4個RGG重復(fù)序列和2個GG(甘氨酸)富集區(qū)。因此將克隆得到的中華鱉cDNA序列命名為Psvasa , 并提交NCBI GenBank (登錄號: KT934805)。將推導(dǎo)出的中華鱉Vasa氨基酸序列與幾種代表性脊椎動物相應(yīng)的序列進行同源性比對, 結(jié)果顯示中華鱉Vasa氨基酸序列與小鼠(Mus musculus)同源性較高為72%, 與鴨嘴獸(Ornithorhynchus anatinus)、安樂蜥(Anolis carolinensis)的同源性均為69%, 與雞(Gallus gallus)、熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)、金目鱸(Lates calcarifer)、斑馬魚(Danio rerio)、果蠅(Drosophila melanogaster)的同源性分別在59%至42%之間(未發(fā)表數(shù)據(jù))。運用MEGA 6軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹(圖 1), 結(jié)果表明中華鱉PsVasa序列屬于Vasa家族, 處于爬行類與哺乳類之間, 并與哺乳類Vasa同源性更高。

2.2 中華鱉vasa mRNA組織表達特征

以中華鱉ef1α基因作為內(nèi)參基因, 以Psvasa基因特異性引物作為擴增引物, 利用qRT-PCR檢測Psvasa轉(zhuǎn)錄本在不同組織中的表達水平。結(jié)果顯示: Psvasa mRNA在精巢和卵巢中均有較高水平的表達, 但在心、肝臟、脾、腎、腦、血液中幾乎檢測不到表達信號(圖 2)。這說明中華鱉vasa基因和其他很多動物一樣, 僅在性腺中表達。

2.3 中華鱉vasa mRNA在卵子發(fā)生過程中的表達分布

通過對中華鱉不同發(fā)育期卵巢的冰凍切片進行化學(xué)原位雜交分析, 發(fā)現(xiàn)Psvasa mRNA僅在生殖細胞的細胞質(zhì)中有表達, 在體細胞中未檢測到表達信號。而且在卵子發(fā)生過程中的早期卵母細胞中可檢測到很強的Psvasa mRNA信號: 在卵原細胞中具有較強的表達, 在初級卵母細胞期表達最強, 且信號在整個細胞質(zhì)中均勻分布, 生長期卵母細胞信號主要集中在核周區(qū)域且隨著卵母細胞逐漸發(fā)育,卵母細胞核周區(qū)域信號也逐漸減弱(圖 3A、B), 在成熟期卵母細胞中幾乎檢測不到信號(圖 3C)。

圖 1 NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree generated with the neighbor-joining method所用氨基酸序列包括All amino acid sequences including: 中華鱉(Pelodiscus Sinensis) Vasa, ALK02502; 人(Humo spaties) Vasa, AAF86585; 小鼠(Mus musculus) Vasa, AAI37602.1; 鴨嘴獸(Ornithorhynchus anatinus) Vasa, NP_001233782; 蜥蜴(Anolis carolinensis) Vasa, ENSACAT00000015036; 雞(Gallus gallus) Vasa, NP_990039.2; 蛙(Rana rugosa) Vasa, AB372211; 爪蟾(Xenopus tropicalis) Vasa, NP_001016823; 斑馬魚(Danio rerio) Vasa, AAI29276.1; 銀鯽(Carassius auratus gibelio) Vasa, AAV70960; 金目鱸(Lates calcarifer) Vasa, AHG95980.1; 虹鱒(Oncorhynchus mykiss) Vasa, BAA88059; 果蠅(Drosophila melanogaster) Vasa, CAA31405.1; 鼠(Mus musculus) PL10, NP_149068; 斑馬魚(Danio rerio) PL10(NP571016); 人(Humo spaties) P68, NP_004387; 斑馬魚(Danio rerio) P68(AAI59199);人(Humo spaties) Efl4A(NP_001407); 斑馬魚(Danio rerio) Efl4A (AAI53508)虛線框內(nèi)為Vasa蛋白家族

圖 2 中華鱉vasa基因轉(zhuǎn)錄本的組織特異性表達分析Fig. 2 The mRNA level of vasa in multiple tissuesHeart: 心臟, Liver: 肝臟, Spleen: 脾, Kidney: 腎, Brain: 腦, Blood: 血液, Testis: 精巢, Ovary: 卵巢; ** P＜0.01

通過高靈敏度熒光原位雜交進行進一步驗證,結(jié)果顯示: Psvasa mRNA的熒光雜交信號與化學(xué)雜交法的基本一致。在卵原細胞、初級卵母細胞、生長期卵母細胞中均有表達, 卵原細胞中信號較強,在初級卵母細胞及生長期卵母細胞最開始階段信號最強, 且均勻分布在細胞質(zhì)中, 之后主要集中分布在生長期卵母細胞的核周區(qū)域(圖 4)。

3 討論

3.1 中華鱉vasa cDNA的鑒定

本研究在中華鱉中擴增得到了一個編碼DEAD-box家族蛋白的cDNA序列, 比對結(jié)果表明, 擴增獲得的cDNA序列比GenBank (XM_006139555.1)中序列極為一致, 達99%相似性。然而, 本研究擴增獲得的cDNA序列編碼的蛋白序列與DEAD-box家族蛋白具有更高的同源性(未發(fā)表數(shù)據(jù)), 其編碼的蛋白與很多已知的其他物種的Vasa蛋白一樣包含DEAD-box家族特有的8個功能域[28,29], 而且其N末端具有多個RGG重復(fù)序列和GG (甘氨酸)富集區(qū),推測與RNA的結(jié)合有關(guān)[30], 并與DEAD-box家族中的其他蛋白有相互作用[31,32]。因此本研究獲得的cDNA序列, 編碼的蛋白命名為PsVasa。同時, 通過DEAD家族基因蛋白同源性比對及系統(tǒng)進化樹分析, 結(jié)果表明PsVasa歸屬于Vasa蛋白一支(圖 1), 而非DEAD-box家族的其他蛋白如PL10、PL68等。在系統(tǒng)進化樹上, PsVasa居于蜥蜴與哺乳類之間,與哺乳動物(小鼠、鴨嘴獸)的同源性更高, 預(yù)示著中華鱉PsVasa在生殖細胞中的調(diào)控作用更接近哺乳類, 其生殖細胞的發(fā)育方式也可能更類似于哺乳類的。

3.2 中華鱉vasa 基因轉(zhuǎn)錄本在卵母細胞中的表達定位分析

迄今為止, 關(guān)于vasa基因的組織特異性表達及功能在研究界仍有許多爭議。在已報道的絕大多數(shù)物種中, vasa基因主要作用于生殖細胞的發(fā)育,在性腺組織中特異表達[9,33]。與此相似, 在本研究的中華鱉中, 熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示, Psvasa mRNA在性腺(卵巢和精巢)中高表達, 在體組織中表達很低甚至難以檢測到。而在某些物種中的研究顯示, vasa基因在性腺外的體組織中也有少量表達, 如非洲爪蟾[34]和線蟲[35]的體細胞, 虹鱒的腦和心臟[11], 黑斑蛙的腦、肌肉、腎臟和心臟[36]均檢測到了vasa基因的表達。據(jù)分析vasa可能不僅調(diào)控生殖細胞的發(fā)育, 還通過調(diào)節(jié)有關(guān)mRNAs的轉(zhuǎn)錄表達, 來維持細胞的全能性[34,35]?？傊? vasa基因的功能, 特別是隨著脊椎動物的進化而發(fā)生的演變, 還需要大量的研究工作加以驗證及闡明。

圖 3 化學(xué)原位雜交法分析卵巢中vasa轉(zhuǎn)錄本的表達Fig. 3 The vasa mRNA level in adult ovary by chemical in situ hybridization (CISH)卵巢切片組織RNA探針雜交, 包括反義探針(A-C)和正義探針(D)。陰性對照沒有信號。在卵原細胞、初級卵母細胞、生長期卵母細胞中均有表達, 卵原細胞中信號較強, 在初級卵母細胞及生長期卵母細胞最開始階段中信號最強, 且均勻分布在細胞質(zhì)中, 之后在生長期卵母細胞的核周區(qū)域表達較強, 而卵周區(qū)域的信號較弱, 且隨著卵母細胞逐漸發(fā)育, 卵母核周區(qū)域信號也逐漸減弱, 在成熟期卵母細胞中幾乎檢測不到信號。Ⅲ-Ⅴ為初級卵母細胞期; Ⅵ-Ⅸ為生長期卵母細胞; Ⅹ為成熟期卵母細胞Adult ovary cryosections were hybridized withantisense (A-C) and sense (D) RNA probes. The signals were developed by alkaline phosphatase (AP) staining (purple). No signal is detected by sense probe. The Psvasa mRNA signals strongly appeared in oogonia and increased to peak from primary oocyte to early growing oocyte stage and displayed a uniform distribution. As oocyte grown into larger size, the signal in the perinuclear cytoplasm became much stronger, however, the signal in oocyte became weak when vitellogenesis further develop. Primary oocytes are stageⅢ-Ⅴ; Growing oocytes are stageⅥ-Ⅸ; Mature oocytes are stage Ⅹ

脊椎動物的配子發(fā)生是一個復(fù)雜的過程, 包括生殖干細胞的自我更新和分化, 減數(shù)分裂以及減數(shù)分裂后形態(tài)上的變化。RT-PCR結(jié)果已表明vasa基因在中華鱉性腺中特異表達, 且卵巢組織冰凍切片原位雜交分析結(jié)果顯示vasa mRNA只在生殖細胞中表達, 因此vasa基因也可以作為生殖細胞特異性標(biāo)記分子來研究中華鱉卵子發(fā)生過程及卵母細胞分化成熟機制。中華鱉的卵子發(fā)生主要分為4個時期: 卵原細胞期、初級卵泡期、生長卵泡期、成熟卵泡期, 其中生長卵泡期又分為小生長期和大生長期, 卵黃積累開始于大生長期[25]; 也有研究人員將其劃分為卵黃發(fā)生前期和卵黃發(fā)生期, 又根據(jù)透明帶、濾泡細胞等結(jié)構(gòu)特點將整個過程細分為10個期[37]。本實驗參照這后一種方法對卵子進行分期, Psvasa在卵子發(fā)生中的生殖細胞中呈現(xiàn)動態(tài)的變化: 在卵原細胞中起始表達, 在初級卵母細胞及生長期卵母細胞最早期中表達量升高且在整個細胞質(zhì)內(nèi)均分分布, 之后Psvasa在生長期卵母細胞的核周區(qū)域信號聚集, 隨著卵母細胞逐漸增長, 核周區(qū)域的信號也慢慢減弱, 直至在接近成熟的卵母細胞中幾乎檢測不到Psvasa表達信號(圖 3)。

Psvasa在初級卵母細胞及生長期卵母細胞最早期中表達量最高可能與這時期卵母細胞中RNA,蛋白質(zhì)等物質(zhì)大量積累有關(guān)。而在生長期卵母細胞中Psvasa表達逐漸減弱可能和該時期卵母細胞體積不斷變大, Psvasa mRNA相對密度減少或者是Psvasa mRNA表達水平下降等因素有關(guān)。Psvasa mRNA在雌性生殖細胞中的表達譜與巴西紅耳龜中的表達較為相似。巴西紅耳龜vasa mRNA在初級卵母細胞中表達最強且信號均勻分布在細胞質(zhì)中, 卵黃生成進行中的卵母細胞里, 其信號也有體現(xiàn)出核周的信號要稍強于胞質(zhì)的其他區(qū)域的現(xiàn)象,而且隨著生長期卵母細胞的增大, 細胞質(zhì)中的信號也逐漸減弱[12]。但與魚類vasa基因表達分布模式存在很大的不同, 例如在銀鯽中vasa mRNA在整個卵子發(fā)生過程中均有表達, 表達水平呈現(xiàn)先升高后降低的模式[9], 銀鯽vasa mRNA表達最強是在卵黃生成前和卵黃生成早期卵母細胞中并且同樣也是均勻分布在胞質(zhì)中, 而中華鱉中表達水平最高是在初級卵母細胞以及生長期卵母細胞的最早期。中華鱉從生長期開始信號就主要集中在核周圍區(qū)域,但銀鯽中信號集中在核周圍是在卵黃生成中期的卵母細胞中。隨著卵黃發(fā)生的繼續(xù)進行, 兩者在胞質(zhì)中的信號都慢慢減弱, 在成熟的銀鯽卵母細胞中, vasa信號定位于卵母細胞特定區(qū)域, 特別是在金目鱸生長期卵母細胞中發(fā)現(xiàn)vasa基因主要集中分布于巴氏小體(Balbiani body, BB)[10], 而中華鱉卵母細胞中沒有發(fā)現(xiàn)BB結(jié)構(gòu), 而且其成熟期卵母細胞中甚至沒有檢測到Psvasa信號。Psvasa mRNA在卵母細胞中的表達模式與哺乳類卵母細胞vasa基因產(chǎn)物的表達方式接近, 小鼠vasa 基因產(chǎn)物在卵母細胞中均勻分布且無生殖質(zhì)結(jié)構(gòu)的存在[20], 從而決定了小鼠PGCs的起源方式與魚類的不同[18]: 小鼠PGCs不受任何母源因子的調(diào)控, 是依靠細胞間的交互作用, 即細胞非自主的方式形成的, 屬后成論模式。而魚類PGCs是有vasa等生殖質(zhì)因子調(diào)控形成的, 屬先成論模式。本研究發(fā)現(xiàn)中華鱉vasa轉(zhuǎn)錄本在其卵母細胞中的表達模式不同于魚類, 而類似于哺乳類的, 暗示中華鱉PGCs的形成不是由生殖質(zhì)調(diào)控的先成模式, 至于是否行駛哺乳類的后成模式, 還需要進一步研究證明。

圖 4 熒光原位雜交法分析卵巢中vasa轉(zhuǎn)錄本的表達分布Fig. 4 The expression of vasa mRNA level in adult ovary by fluorescence in situ hybridization (FISH)卵巢切片組織RNA探針雜交。Psvasa mRNA僅在生殖細胞中表達, 在體細胞中未見表達。而且在卵子發(fā)生過程中的早期卵母細胞中可檢測到很強Psvasa mRNA信號, 在卵原細胞中具有較強的表達, 在初級卵母細胞期表達最強, 且信號在整個細胞質(zhì)中均勻分布, 生長期卵母細胞中信號主要集中在核周區(qū)域。Ⅲ-Ⅴ為初級卵母細胞期; Ⅵ-Ⅸ為生長卵母細胞期; Ⅹ為成熟期卵母細胞。vasa信號(綠色); PI染核(紅色); 比例尺, 100 μmAdult ovary cryosections were hybridized with RNA probes. The vasa signals were developed by TSA kit (Green) and the nuclear was stained with PI (Red). The Psvasa mRNA signals were strong in oogonia and reached to peak level from primary oocyte to early growing oocyte stage and displayed a uniform distribution. As growing oocytes grown into larger sizes, the signals in the perinuclear cytoplasm became much stronger, while the signals in oocytes became weak with the vitellogenesis fruther develop. Primary oocytes are stage Ⅲ-Ⅴ; Growing oocytes are stage Ⅵ-Ⅸ; Mature oocytes are stage Ⅹ; Scale bar, 100 μm

Psvasa mRNA特異于生殖細胞的表達模式及在卵子發(fā)生過程中呈現(xiàn)的時間和空間上的動態(tài)變化, 預(yù)示Psvasa對中華鱉的卵子發(fā)生過程起重要的調(diào)控作用, 同時可作為可靠的分子標(biāo)記物來區(qū)分不同發(fā)育時期的卵母細胞。更為重要的是本研究結(jié)果為將來通過Psvasa標(biāo)記分子進行中華鱉PGCs的起源、遷移、分化等方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

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CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF VASA IN CHINESE SOFT-SHELL TURTLE OOCYTES

ZHANG Piao-Yi1,2, LI Wei1, ZHU Xin-Ping1,2, HONG Xiao-You1,2, CHEN Kun-Ci1,2and XU Hong-Yan1,2
(1. Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation of Ministry of Agriculture, Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

vasa encodes a DEAD-box RNA helicase and is a highly conserved germ cell marker across animal phyla. vasa is necessary for germ cell development during embryogenesis and gametogenesis. The Chinese soft-shell turtle (Pelidiscus sinensis) was used as a model to study germ cell development and differentiation in reptiles. Here a full vasa cDNA was cloned, 3865 bp in total, containing a 5′-UTR of 90 bp, a 3′-UTR of 1699 bp and an open reading frame (ORF) of 2076 bp, encoding a protein of 691 aa. The deduced amino acid sequence contains 8 conserved motifs of DEAD-box family protein, and possesses 4 RGG repeats and 2 GG repeats. The predicted protein is 72% identical in sequence to its homologs from mouse. The vasa mRNA was detected exclusively in the gonads of both sexes in softshell turtle. Chromogenic and fluorescent RNA in situ hybridization revealed that the vasa mRNA was restricted to germ cells: It was highly expressed from primary oocyte to early growing oocyte and uniformly distributed in oocyte cytoplasm. In oocytes at the late stage, the vasa mRNA was perinuclear distributed and decreased in oocytes with the vitellogenesis proceeding. The vasa mRNA signal was undetectable in the mature oocytes. The findings indicated that vasa gene also played an important role in oogenesis in the Chinese soft-shell turtle. Hence turtle vasa is a reliable germ cell marker to identify female germ cells at different stages during oogenesis. These results provide a theoretical basis to study the germ cell development and differentiation during embryogenesis and /or gametogenesis, especially to investigate the initiation and migration of primordial germ cells (PGCs) in Chinese soft-shell turtle and reptiles.

vasa gene; Chinese soft-shell turtle; Germ cell; Oogenesis

Q786

A

1000-3207(2017)02-0306-08

10.7541/2017.37

2016-04-18;

2016-07-18

廣東省科技計劃項目-國際科技合作領(lǐng)域(2016A050502029); 廣東省科技計劃項目(2014A020208037); 引進國際先進農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)‘948’項目(2015-Z019)資助 [Supported by Science and Technology Projects of Guangdong Province (2016A050502029); Science and Technology Projects of Guangdong Province (2014A020208037); 948 Foundation of Ministry of Agriculture (2015-Z019)]

張飄逸(1991—), 女, 浙江東陽人; 碩士研究生; 主要研究方向為水產(chǎn)種質(zhì)資源與遺傳育種。E-mail: zhangpiaoyi00000 @126.com

朱新平, 博士, 研究員; E-mail: zhuxinping_1964@163.com; 徐紅艷, 博士, 研究員; E-mail: xuhyzqh@163.com