張盼盼王 麗 時(shí)志軍 杜美君

(1. 安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2. 鳳陽健民藍(lán)莓農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，安徽 鳳陽 233100)

藍(lán)莓果渣花青素的超聲輔助提取工藝優(yōu)化

張盼盼1王 麗1時(shí)志軍2杜美君1

(1. 安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2. 鳳陽健民藍(lán)莓農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，安徽 鳳陽 233100)

以藍(lán)莓果渣為原料，用酒石酸酸化乙醇提取花青素，同時(shí)應(yīng)用超聲波進(jìn)行輔助提取，采用雙波長pH示差法計(jì)算花青素提取率，利用響應(yīng)面分析法對(duì)藍(lán)莓果渣花青素的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：其最佳提取條件為提取溫度50 ℃，pH 3.0，酸化乙醇濃度65%，料液比1∶70(g/mL)，超聲波提取功率500 W，提取時(shí)間20 min，藍(lán)莓果渣花青素提取率實(shí)際值為83.638%，與預(yù)測值85.442%的偏差為2.111%。該試驗(yàn)設(shè)計(jì)操作簡便合理，得率高，可預(yù)測性較好，為藍(lán)莓果渣花青素提取提供了理論依據(jù)。

藍(lán)莓；果渣；花青素；超聲輔助提取

花青素屬于黃酮類化合物，是存在于植物中的水溶性天然食用色素，自然條件下的花青素極少見，常與糖形成糖苷稱為花色苷[1]?；ㄇ嗨貙?duì)人體具有多種保健功能[2]，如抗氧化、清除自由基、抗突變、抗癌、抗炎癥、防腦神經(jīng)老化、防護(hù)肝損傷和緩解視疲勞等，近年來作為天然色素應(yīng)用于食品、化妝品生產(chǎn)[3]。藍(lán)莓為杜鵑花科越橘屬多年生落葉或常綠灌木，也是越橘屬植物中營養(yǎng)成分最豐富的種類，市面上常見的藍(lán)莓產(chǎn)品通常有果汁飲料、藍(lán)莓果酒、藍(lán)莓果干、藍(lán)莓果醬等[4]。在藍(lán)莓產(chǎn)品生產(chǎn)加工過程中會(huì)產(chǎn)生的大量的藍(lán)莓廢棄果渣，其中富含多酚類和黃酮類化合物，尤其是花青素。據(jù)報(bào)道[5]僅有13%～23%的花青素存在于藍(lán)莓果汁中，而大約42%的花青素存留在廢棄果渣中，如果將藍(lán)莓廢棄果渣丟棄是極大的資源浪費(fèi)。前幾年關(guān)于藍(lán)莓的研究主要集中于藍(lán)莓果實(shí)營養(yǎng)成分及其花青素分離鑒定提取純化等，近幾年對(duì)藍(lán)莓果渣的研究逐漸成為熱門課題[6]，尤其對(duì)花青素的提取工藝進(jìn)行了廣泛研究，但大部分存在耗時(shí)較長[7]，得率低的不足[8]。本研究擬以藍(lán)莓果渣為原料，用酒石酸酸化乙醇提取花青素，同時(shí)應(yīng)用超聲波進(jìn)行輔助提取，采用雙波長pH示差法計(jì)算花青素提取率，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化藍(lán)莓果渣花青素的提取工藝條件，為提高花青素的提取效率提供理論依據(jù)從而使藍(lán)莓資源得到充分利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓果渣：安徽鳳陽健民藍(lán)莓農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。藍(lán)莓榨汁后的果渣，經(jīng)過解凍、干燥、粉碎，過60目篩備用；

無水乙醇、酒石酸、氯化鉀、醋酸鈉、冰醋酸、鹽酸等：分析純；

試驗(yàn)水為蒸餾水。

1.2 儀器

精密pH計(jì)：PHS-3B型，上海虹益儀器儀表有限公司；

超聲波提取機(jī)：BILON-2000CT型，上海比朗儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：754P型，上海光譜儀器有限公司；

千分之一天平：ME403E型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

高速粉碎機(jī)：RT-02A小型，北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司；

數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱：101c-3B型，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藍(lán)莓果渣花青素提取工藝流程

藍(lán)莓果渣粉末→酸性乙醇溶解→超聲波提取→藍(lán)莓果渣花色苷提取液

1.3.2 藍(lán)莓果渣花青素的測定方法 采用雙波長pH示差法，取待測液1 mL，分別加入pH 4.5緩沖溶液(0.4 mol/L醋酸鈉)和pH 1.0緩沖溶液(0.25 mol/L氯化鉀)9 mL，搖勻，靜置15 min，轉(zhuǎn)入光路長為1 cm的比色皿中，以蒸餾水代替樣品溶液做空白對(duì)照，分別在520 nm和700 nm波長處測定吸光度。

Y=(A/εL)×Mw×DF×V/Wt，

(1)

式中：

Y——花青素提取率，%；

A——吸光度，A=(A520 nm pH 1.0-A700 nm pH 1.0)-(A520 nm pH 4.5-A700 nm pH 4.5)；

ε——矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；

L——光程，1 cm；

Mw——矢車菊花素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2 g/mol；

DF——稀釋因子；

V——最終體積，mL；

Wt——產(chǎn)品重量，mg。

1.3.3 提取工藝單因素試驗(yàn)

(1) 在料液比為1∶60(g/mL)，pH 3.0，超聲波功率500 W，提取時(shí)間20 min，提取溫度50 ℃的條件下，分別考查乙醇濃度(40%，50%，60%，70%，80%)對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響，重復(fù)測定3次，取平均值。

(2) 在料液比為1∶60(g/mL)，乙醇濃度60%，超聲波功率500 W，提取時(shí)間20 min，提取溫度50 ℃的條件下，分別考查pH(2.0，2.5，3.0，3.5，4.0)對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響，重復(fù)測定3次，取平均值。

(3) 在料液比為1∶60(g/mL)，乙醇濃度60%，pH 3.0，提取時(shí)間20 min，提取溫度50 ℃的條件下，分別考查超聲波功率(300，400，500，600，700 W)對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響，重復(fù)測定3次，取平均值。

(4) 在乙醇濃度60%，pH 3.0，超聲波功率500 W，提取時(shí)間20 min，提取溫度50 ℃的條件下，分別考查料液比 [1∶100，1∶80，1∶60，1∶40，1∶20(g/mL)]對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響，重復(fù)測定3次，取平均值。

(5) 在料液比為1∶80(g/mL)，乙醇濃度60%，pH 3.0，超聲波功率500 W，提取時(shí)間20 min的條件下，分別考查提取溫度(40，45，50，55，60 ℃)對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響，重復(fù)測定3次，取平均值。

(6) 在料液比為1∶80(g/mL)，乙醇濃度60%，pH 3.0，超聲波功率500 W，提取溫度50 ℃的條件下，分別考查提取時(shí)間(10，15，20，25，30 min)對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響，重復(fù)測定3次，取平均值。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝 采用Central Composite Design響應(yīng)面優(yōu)化分析法，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定溶劑pH 3.0，提取溫度50 ℃，觀察乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、超聲波功率對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定最佳提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1～6可知，藍(lán)莓果渣花青素提取率隨乙醇濃度的增大先增加后減小，乙醇濃度為60%時(shí)提取率最大?；ㄇ嗨厥屈S酮類物質(zhì)，溶于水、乙醇等極性溶劑。乙醇溶液隨著濃度的升高其極性會(huì)減小，當(dāng)溶劑極性最接近花青素極性時(shí)，其溶解性最好，溶出率最高。當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增大與花青素的極性有所偏離，不利于花青素的溶出[9]。藍(lán)莓果渣花青素提取率隨pH值的增大先增加后減小，pH 3.0時(shí)提取率最大?；ㄇ嗨卦谒嵝匀芤河?種存在形式，pH<2.0，主要是紅色黃烊陽離子(AH+)，隨pH值升高，紅色黃烊陽離子(AH+)轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色醌氏堿(A)，當(dāng)pH值升高到3.0～5.0時(shí)，生成無色的甲醇假堿，并進(jìn)一步形成查爾酮，花色苷的顏色會(huì)逐漸退至無色[10]。藍(lán)莓果渣花青素提取率隨超聲波功率的增大逐漸增加后趨于穩(wěn)定，超聲波功率較高時(shí)，會(huì)破壞花青素的穩(wěn)定性，因此取500 W為最適功率。超聲波的物理剪切作用不僅可以破壞藍(lán)莓果渣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，同時(shí)使乙醇分子快速運(yùn)動(dòng)，加速花青素和乙醇的融合。當(dāng)功率較低時(shí)，由于破碎力度小，花青素與乙醇不能快速融合，但當(dāng)超聲波功率較高時(shí)，會(huì)破壞花青素的穩(wěn)定性且環(huán)境噪音過大[11]。藍(lán)莓果渣花青素提取率隨料液比的減小先增加后穩(wěn)定，料液比為1∶80(g/mL)時(shí)花青素溶出幾乎達(dá)到飽和狀態(tài)。藍(lán)莓果渣花青素提取率隨提取溫度的增大先增加后減小，提取溫度為50 ℃時(shí)提取率最大?；ㄇ嗨氐哪蜔嵝暂^差，溫度過高會(huì)使花青素降解[12]。隨提取時(shí)間的延長，藍(lán)莓果渣花青素提取率先增大后減小，當(dāng)時(shí)間達(dá)到25 min時(shí)藍(lán)莓果渣中花青素基本完全釋放，長時(shí)間的超聲作用，會(huì)導(dǎo)致花青素降解。

圖1 乙醇濃度對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響Figure 1 Effect of Ethanol concentration on extraction of anthocyanin

圖2 pH對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響Figure 2 Effect of pH on extraction of anthocyanin

圖3 超聲波功率對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic power on extraction of anthocyanin

圖4 料液比對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響Figure 4 Effect of liquid-to-solid ratio on extraction of anthocyanin

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 試驗(yàn)因素水平表見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

圖5 提取溫度對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響Figure 5 Effect of exteraction temperature on extraction of anthocyanin

圖6 提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響Figure 6 Effect of exteraction time on extraction of anthocyanin

表1 因素水平表Table 1 Table of factors and levels

2.2.2 二次回歸方程和方差分析 用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到藍(lán)莓果渣花青素提取率與乙醇濃度、料液比、超聲波功率、提取時(shí)間之間的二次回歸方程為：

Y=84.74+1.11A+1.99B+0.69C+0.99D+0.52AB-0.41AC+0.35AD-1.48BC-1.91BD+0.53CD-1.65A2-2.34B2-3.27C2-3.65D2。

(2)

回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析結(jié)果見表3，回歸方程的可信度分析見表4。

由表3可知，該回歸模型極顯著(P<0.01)，表明該二次回歸方程的因變量與自變量的相關(guān)關(guān)系顯著，A、B、D、BC、BD、A2、B2、C2、D2對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響顯著或極顯著，各因素對(duì)響應(yīng)值是二次拋物線關(guān)系。失擬項(xiàng)不顯著，表明該方程對(duì)試驗(yàn)的擬合程度高，誤差小。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results

2.2.3 兩因子間交互作用的響應(yīng)面分析 以藍(lán)莓果渣花青素提取率為考察量，從4個(gè)因素中選擇兩個(gè)為不變量與另外兩個(gè)因素?cái)M合為三維曲面圖，繪制響應(yīng)曲面和等高線圖，見圖7～12。

由圖7可知，響應(yīng)面變化明顯，當(dāng)料液比固定在零水平時(shí)，隨著酸性乙醇濃度的增加花青素提取率變化顯著，先升高后降低；當(dāng)乙醇濃度處于零水平時(shí)，改變料液比，花青素提取率呈先上升后下降的趨勢。等高線圖表明，沿乙醇濃度和

表3 響應(yīng)面方差分析表?Table 3 Variance analysis of RSM table

? **表示極顯著(P<0.01)；*表示顯著(0.01

表4 二次回歸方程的可信度分析Table 4 Reliability analysis of regression equation

料液比的軸向等高線分布均勻，等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用較強(qiáng)，但由方差分析可知，其交互作用對(duì)花青素提取率的影響不顯著。

由圖8可知，響應(yīng)面變化明顯，當(dāng)超聲波功率固定在零水平時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，花青素提取率先增大后趨于平穩(wěn)；當(dāng)乙醇濃度處于零水平時(shí)，隨著超聲波功率的增加，花青素提取率呈先上升后下降的趨勢。等高線圖表明，沿酸性乙醇濃度軸向的等高線變化比較密集，而超聲波功率的軸向等高線變化較稀疏，說明乙醇濃度對(duì)花青素提取率的影響比超聲波功率大，等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用較強(qiáng)，但由方差分析可知，其交互作用的影響不顯著。

由圖9可知，響應(yīng)面變化明顯，當(dāng)提取時(shí)間固定在零水平時(shí)，乙醇濃度越大花青素提取率先增大后逐漸趨于穩(wěn)定；當(dāng)乙醇濃度在零水平時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，花青素提取率呈先上升后下降的趨勢。由等高線圖可知，提取時(shí)間的軸向等高線變化較稀疏，酸性乙醇濃度變化密集，說明乙醇濃度對(duì)花青素提取率的影響比提取時(shí)間大，等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用較強(qiáng)，但由方差分析可知，其交互作用對(duì)花青素提取率的影響并不顯著。

圖7 酸性乙醇濃度和料液比對(duì)花青素提取率的交互作用Figure 7 Interaction effects of ethanol concentration and iquid-to-solid ratio on extraction of anthocyanin

圖8 酸性乙醇濃度和超聲波功率對(duì)花青素提取率的交互作用Figure 8 Interaction effects of ethanol concentration and ultrasonic power on extraction of anthocyanin

圖9 提取時(shí)間與乙醇濃度對(duì)花青素提取率的交互作用Figure 9 Interaction effects of ethanol concentration and time on extraction of anthocyanin

圖10 料液比和超聲波功率對(duì)花青素提取率的交互作用Figure 10 Interaction effects of iquid-to-solid ratio and ultrasonic power on extraction of anthocyanin

圖11 料液比與提取時(shí)間對(duì)花青素提取率的交互作用Figure 11 Interaction effects of iquid-to-solid ratio and time on extraction of anthocyanin

圖12 超聲波功率和提取時(shí)間對(duì)花青素提取率的交互作用Figure 12 Interaction effects of ultrasonic power and time on extraction of anthocyanin

由圖10可知，響應(yīng)面較陡，當(dāng)超聲波功率固定在零水平時(shí)，隨著料液比的增加，花青素提取率呈先增大后減小的趨勢；當(dāng)料液比處于零水平時(shí)，隨著超聲波功率的增加，花青素提取率呈先上升后下降的趨勢。等高線圖表明，沿料液比的軸向等高線變化較密集，而超聲波功率變化稀疏，說明料液比對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響比超聲波功率大，等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用較強(qiáng)，由方差分析可知，其交互作用影響較顯著。

由圖11可知，響應(yīng)面變化明顯，當(dāng)提取時(shí)間固定在零水平時(shí)，隨著料液比的增加，花青素提取率呈先增大后減小的趨勢；當(dāng)料液比處于零水平時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，花青素提取率呈先上升后下降的趨勢。等高線圖表明，沿料液比的軸向等高線變化密集，而超聲提取時(shí)間較稀疏，說明料液比對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率的影響比超聲提取時(shí)間的影響大，等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用較強(qiáng)，由方差分析可知，其交互作用對(duì)花青素提取率的影響極顯著。

由圖12可知，響應(yīng)面變化明顯，當(dāng)提取時(shí)間固定在零水平時(shí)，花青素提取率隨著超聲波功率的增加先增大后減小；當(dāng)超聲波功率處于零水平時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，花青素提取率呈先上升后下降的趨勢。等高線圖表明，沿提取時(shí)間的軸向等高線變化密集，超聲波提取功率的軸向等高線變化較為稀疏，說明超聲提取時(shí)間對(duì)花青素提取率的影響比超聲波功率大，等高線呈橢圓形，但其交互作用對(duì)花青素提取率的影響不顯著。

2.2.4 最佳提取工藝的驗(yàn)證 由研究結(jié)果可知，對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取率影響程度大小為：料液比>酸性乙醇濃度>提取時(shí)間>超聲波功率，最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度64.170%，料液比1∶69.320(g/mL)，超聲波提取功率497.610 W，提取時(shí)間20.160 min，藍(lán)莓果渣花青素理論最大提取率為85.442%?？紤]到實(shí)際操作問題，將結(jié)果修正為乙醇濃度65%，料液比1∶70(g/mL)，超聲波提取功率為500 W，提取時(shí)間為20 min， 3次平行實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)際平均值83.638%，與預(yù)測值的偏差為2.111%，說明該模型能較好地分析和預(yù)測藍(lán)莓果渣花青素的提取條件，試驗(yàn)方法可行、可靠。

3 結(jié)論

(1) 本試驗(yàn)采用超聲波輔助酸性乙醇法提取藍(lán)莓果渣中的花青素，結(jié)果表明超聲波可以有效縮短提取時(shí)間，提高提取效率，彌補(bǔ)了溶劑法提取的不足。

(2) 利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化藍(lán)莓果渣花青素提取工藝，試驗(yàn)表明藍(lán)莓果渣花青素的最佳提取工藝為酸性乙醇濃度65%，料液比1∶70(g/mL)， pH 3.0，超聲波提取功率為500 W，提取時(shí)間為20 min，提取溫度50 ℃，在此條件下得到的藍(lán)莓果渣花青素提取率為83.638%。

(3) 本試驗(yàn)只對(duì)藍(lán)莓果渣進(jìn)行了粗提取，提取物中含有大量的可溶性糖、蛋白質(zhì)、果膠等大分子物質(zhì)，對(duì)粗提物的純化有待進(jìn)一步研究。

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Optimization of extraction process for anthocyanins from blueberry pomace by response surface methodology

ZHANG Pan-pan1WANGLi1SHIZhi-jun2DUMei-jun1

(1.SchoolofFoodandDrug,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang,Anhui233100,China; 2.JianminBlueberryAgriculturalDevelopmentCo.,Ltd,Fengyang,Anhui233100,China)

The optimization of the ultrasonic extraction of anthocyanins in blueberry pomace by the response surface method was investigated in this study. With tartaric acid acidification ethanol extracting anthocyanins from blueberry pomace, with appling ultrasonic assisted extraction, anthocyanin extraction rate was determined by using the double wavelength pH differential method. Through the single factor experiment, to determine the best conditions were determined, and then the extraction process conditions of anthocyanins in blueberry pomace were optimized using the response surface analysis. The results showed that the extraction conditions on the influence of the anthocyanins blueberry pomace extraction yield order was as follows. i.e. material liquid ratio > ethanol concentration > extraction time > ultrasonic power. Moreover, the best extraction condition was extracting it by using acidic ethanol concentration 65% (pH 3.0), with material liquid than 1∶70, and 500 W ultrasonic, at 50 ℃for 20 min. It was found that the anthocyanins in blueberry pomace extraction yield the actual value was 83.638%, only showing a 2.111% deviation to the forecasting one (85.442%). In conclusion, the reasonable design of experiments was easy to handle, with high acquirement rate and good predictability, and this provided for the extraction of anthocyanins blueberry pomace a theoretical basis.

blueberry; pomace; anthocyanins; ultrasonic-assisted extraction

安徽省科技重大專項(xiàng)(編號(hào)：15CZZ03105)

張盼盼，女，安徽科技學(xué)院在讀碩士研究生。

王麗(1977-)，女，安徽科技學(xué)院副教授，博士。 E-mail: wangli@ahstu.edu.cn

2016—12—27

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.02.033