史玲玲 王建中 劉玉軍 馬 超 李怡婧 代建蓉 曹 陽 滕婉昭

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

板栗殼乙酸乙酯提取物活性研究及其化合物結(jié)構(gòu)分析

史玲玲 王建中 劉玉軍 馬 超 李怡婧 代建蓉 曹 陽 滕婉昭

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

為了研究板栗殼乙酸乙酯提取物體外活性，并分析其活性成分，依次采用DPPH法、ABTS法測定板栗殼乙酸乙酯提取物的抗氧化活性；PNPG法測定其體外抑制α-葡萄糖苷酶活性；超高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC—MS/MS)對(duì)其成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明：板栗殼乙酸乙酯提取物具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基、ABTS自由基的能力且可顯著地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其有效成分主要為脂溶性黃酮類化合物。

板栗殼；乙酸乙酯提取物；抗氧化活性；α-葡萄糖苷酶；化合物結(jié)構(gòu)

板栗(CastaneamollissimaBlume)是殼斗科栗屬植物，原產(chǎn)、主產(chǎn)于中國，有“干果之王”的美稱[1]。板栗殼作為板栗加工業(yè)中的廢棄物，近年來也越來越引起人們的關(guān)注。研究[2-4]報(bào)道板栗殼可以作為水溶液中農(nóng)藥、銅、鉛、鎘以及其他重金屬的吸附劑。由于板栗殼中含有酚類、有機(jī)酸、多糖、內(nèi)酯、香豆素、鞣質(zhì)、甾體和黃酮等活性成分[5-6]，其水提取物具有多種功能，如抗氧化作用和保肝作用[7-8]，因此有必要對(duì)板栗殼進(jìn)行研究以考察其在食品、藥品或保健品等方面的應(yīng)用潛力。對(duì)板栗殼的研究雖有報(bào)道，但多集中于板栗殼中多酚的提取，色素的提取工藝及其抗氧化研究[9-12]；而研究板栗殼提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的報(bào)道僅限于板栗殼的正丁醇提取物[13]，未見對(duì)板栗殼乙酸乙酯提取物的體外抗氧化活性、抑制α-葡萄糖苷酶活性以及對(duì)活性成分進(jìn)行深入分析的系統(tǒng)研究，因此，本研究擬采用DPPH法和ABTS法，研究板栗殼乙酸乙酯提取物的抗氧化活性，采用PNPG法測定其對(duì)體外α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用；同時(shí)，應(yīng)用UPLC—MS/MS分析板栗殼乙酸乙酯提取物的活性成分，尋找其潛在的應(yīng)用價(jià)值，旨在為板栗殼的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

板栗殼：收集于河北省遷西縣(遷西板栗的主產(chǎn)區(qū))。

1.2 試劑

DPPH、ABTS、水溶性維生素E(Trolox)：≥98.0%，美國Sigma-Aldrich有限公司；

高硫酸鉀：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖苷(PNPG)：≥99.0%，美國Sigma-Aldrich有限公司；

α-葡萄糖苷酶：10 units/mg，美國Sigma-Aldrich有限公司；

阿卡波糖：≥99.0%，武漢遠(yuǎn)成醫(yī)藥有限公司；

甲醇：色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司；

甲酸：色譜純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

光吸收全波長酶標(biāo)儀：TECAN M200 PRO型，瑞士TECAN公司；

電子天平：ML104型，梅特勒-托利多公司；

串聯(lián)四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)：QTRAP 5500型，美國AB SCIEX公司；

液相色譜儀：Agilent 1260 型，美國安捷倫公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 提取物的制備 干燥的板栗殼經(jīng)除雜、粉碎后，以料液比1∶9(g/mL)的比例添加75%乙醇溶液對(duì)板栗殼粉末進(jìn)行加熱回流提取2 h，轉(zhuǎn)移提取液至另一容器內(nèi)，藥渣部分重復(fù)提取一次，合并提取液，過濾，對(duì)乙醇提取液進(jìn)行旋蒸，接著對(duì)乙醇蒸干后剩余的水相部分用蒸餾水以1∶1比例進(jìn)行稀釋，之后依次采用與稀釋液等體積的乙酸乙酯萃取兩次，得到板栗殼乙酸乙酯萃取溶液，經(jīng)旋蒸得到乙酸乙酯提取物的浸膏。

1.4.2 板栗殼乙酸乙酯提取物的抗氧化活性測定 精確稱取乙酸乙酯提取物浸膏0.05 g，用95%乙醇定容到25 mL，得到溶液質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，再將各溶液分別稀釋為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mg/mL的待測樣品溶液。

(1) 對(duì)DPPH自由基清除能力測定：量取0.01 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，加入0.2 mL甲醇，以及0.025 mL 1 mmol/L的DPPH乙醇溶液于96微孔板中，混勻后室溫避光放置30 min。分別測定其在517 nm處的吸光度值。以甲醇為空白對(duì)照，以0.025 mL甲醇替代抗氧化劑溶液做空白試驗(yàn)。以Trolox(水溶性維生素E)作為陽性對(duì)照，根據(jù)文獻(xiàn)[14]按式(1)計(jì)算板栗殼乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力。

(1)

式中：

k——DPPH自由基清除率，%；

Ac——未加樣品溶液的DPPH自由基吸光度值；

Ai——加入樣品溶液反應(yīng)后的DPPH自由基吸光度值。

(2) 對(duì)ABTS自由基清除能力測定：將7 mmol/L的ABTS溶液和140 mmol/L的高硫酸鉀溶液以62.5∶1的比例混合，室溫避光靜置16 h，形成ABTS自由基儲(chǔ)備液。用無水甲醇稀釋該儲(chǔ)備液，使其在734 nm下吸光度為0.70±0.02。分別取0.015 mL不同質(zhì)量濃度的樣品甲醇溶液與0.285 mL ABTS+工作液于96微孔板中混合10 s，30 ℃下靜置6～10 min，以無水甲醇為空白在734 nm波長下測吸光度。板栗殼乙酸乙酯提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力按式(2)計(jì)算：

(2)

式中：

c——ABTS自由基清除率，%；

Ao——未加樣品溶液的ABTS自由基吸光度值；

As——加入樣品溶液反應(yīng)后的ABTS自由基吸光度值。

半數(shù)抑制率(IC50)的計(jì)算：以樣品的濃度對(duì)自由基清除率作圖并進(jìn)行線性擬合，并計(jì)算(IC50)值。其中，IC50值定義為清除率為50%時(shí)所需抗氧化劑的濃度。

1.4.3 板栗殼乙酸乙酯提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定 采用PNPG法，根據(jù)文獻(xiàn)[15]，反應(yīng)體系改進(jìn)如下：量取50 μL不同質(zhì)量濃度的板栗殼乙酸乙酯提取物溶液于96微孔板中，加入1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，混勻，37 ℃ 恒溫 10 min 后，加入2 mmol/L PNPG溶液30 μL，用0.1 mmol/L 磷酸鈉緩沖液(pH 6.8)定容至250 μL。反應(yīng)過程在37 ℃下進(jìn)行，每隔15 min測定一次405 nm處的吸光度值，直至反應(yīng)完全。以阿卡波糖為陽性對(duì)照，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照組(緩沖液+酶液+底物)，空白對(duì)照組(緩沖液)。酶抑制活性按式(3)計(jì)算：

(3)

式中：

I——酶抑制活性，%；

AX——樣品OD值-樣品空白OD值；

An——陰性對(duì)照OD值。

半數(shù)抑制濃度(IC50)的計(jì)算：以樣品的濃度對(duì)酶抑制活性作圖并進(jìn)行線性擬合，并計(jì)算IC50值。其中，IC50值定義為抑制率為50%時(shí)所需酶抑制劑的濃度。

1.4.4 板栗殼乙酸乙酯提取物成分分析 精密稱取乙酸乙酯提取物浸膏5 mg，用色譜甲醇溶解，定容至10 mL；超聲輔助溶解完全后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后備用。

分析條件：根據(jù)文獻(xiàn)[16]修改如下：Diamonsil C18(2)色譜柱，(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為超純水(用甲酸調(diào)pH為2.05)；梯度洗脫，采樣時(shí)間80 min；流速0.6 mL/min；自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣量：20 μL；二極管陣列檢測器(DAD)全掃描波長：190～400 nm。紫外檢測波長280 nm。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式離子掃描范圍：100～1 000m/z；離子原溫度(TEM)：550 ℃；離子原電壓：-4 500 V；裂解電壓(DP)：-60 V；碰撞能量(CE)：-35 eV；碰撞能量擴(kuò)展(CES)：15 eV。霧化氣體：氮?dú)?，輔助氣1為379.225 kPa，輔助氣2為344.75 kPa；數(shù)據(jù)采集所用軟件：Analyst 1.5 software。流動(dòng)相由pH 2.05的甲酸溶液(A)和甲醇溶液(B)組成，梯度洗脫以15%的甲醇開始15 min，之后的25 min內(nèi)增長到25%甲醇，65 min時(shí)增長至75%甲醇，之后在70 min時(shí)減少至15%甲醇，以此濃度再持續(xù)洗脫10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗殼乙酸乙酯提取物的抗氧化活性

2.1.1 清除DPPH自由基能力 由圖1可知，板栗殼乙酸乙酯提取物在一定濃度范圍內(nèi)(0.1～0.8 mg/mL)，自由基的清除率與樣品濃度呈正相關(guān)，隨著樣品溶液濃度的升高，其對(duì)自由基的清除率也越來越高。其中當(dāng)溶液濃度為0.6 mg/mL時(shí)，板栗殼乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到70%以上。但其對(duì)DPPH自由基的清除能力弱于陽性對(duì)照品Trolox，當(dāng)Trolox達(dá)到一定濃度(0.4 mg/mL)后對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)到90%以上，之后趨于平緩。板栗殼乙酸乙酯提取物以及Trolox對(duì)DPPH自由基的抑制中濃度(IC50)分別為(0.326±0.050)，(0.160±0.250) mg/mL。

圖1 板栗殼乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

Figure 1 Scavenging capacity of DPPH free radical from ethyl acetate extracts of Chestnut shell

2.1.2 板栗殼乙酸乙酯提取物清除ABTS自由基能力 由圖2可知，板栗殼乙酸乙酯提取物具有清除ABTS自由基的能力，在一定濃度范圍內(nèi)(0.1～0.5 mg/mL)，自由基的清除率與樣品濃度呈正相關(guān)。其中當(dāng)溶液濃度為0.5 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯提取物對(duì)ABTS自由基的清除率達(dá)到90%以上。但在一定濃度范圍內(nèi)(0.1～0.4 mg/mL)，板栗殼乙酸乙酯提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力弱于陽性對(duì)照Trolox，但當(dāng)樣品溶液濃度高于0.5 mg/mL時(shí)，二者清除ABTS自由基能力相當(dāng)。板栗殼乙酸乙酯提取物以及Trolox對(duì)ABTS自由基的抑制中濃度(IC50)分別為(0.164±0.050)，(0.099±0.150) mg/mL。

圖2 板栗殼乙酸乙酯提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力

Figure 2 Scavenging capacity of ABTS free radical from ethyl acetate extracts of Chestnut shell

2.2 板栗殼乙酸乙酯提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性能力

對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖苷(PNPG)經(jīng)α-葡萄糖苷酶水解可產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚，其在水溶液中顯黃色，于405 nm處呈特異性吸收。因此可以通過檢測對(duì)硝基苯酚的生成量而檢測α-葡萄糖苷酶的活性[17]。

由圖3、4可知，在反應(yīng)時(shí)間165 min內(nèi)，酶反應(yīng)完全。板栗殼乙酸乙酯提取物在2.5～12.5 μg/mL時(shí)，隨樣品濃度的增加，其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用也不斷增加。當(dāng)樣品濃度高于10 μg/mL時(shí)，其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)80%以上，遠(yuǎn)高于對(duì)照品阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率；板栗殼乙酸乙酯提取物的IC50為 2.536 μg/mL，而市售阿卡波糖的IC50為200 μg/mL，表明板栗殼乙酸乙酯提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性明顯高于阿卡波糖。本研究表明板栗殼乙酸乙酯提取物可顯著地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，但目前還僅限于體外試驗(yàn)，板栗殼乙酸乙酯提取物活性成分較為復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究。

2.3 板栗殼醇提物乙酸乙酯提取物成分的UPLC—MS/MS分析

板栗殼乙酸乙酯提取物的色譜圖見圖5。

在ESI負(fù)離子模式下，通過對(duì)板栗殼乙酸乙酯提取物樣品的總離子色譜圖進(jìn)行離子色譜圖提取，根據(jù)主要化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)[M-H]-m/z和[M-H]-2m/z值與化合物的相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)比，并結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)照，對(duì)化合物進(jìn)行分析鑒別，初步推測出板栗殼中10種化合物?；衔?的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z為179，說明該化合物的分子量為180，與咖啡酸的分子量相同。且有碎片離子m/z147.1，與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的咖啡酸一致。因此可以推斷該化合物是咖啡酸；化合物2的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z為353，所以得出其分子量為354。并且有m/z147.1的碎片離子，與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的綠原酸一致，可推測該化合物為綠原酸；化合物3的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z285，分子量為286，二級(jí)質(zhì)譜圖中碎片有m/z284.8，與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的山奈酚的特征峰一致，因此該化合物可能是山奈酚；化合物4的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z為169，說明其分子量為170，與沒食子酸的分子量一致，且有m/z79.0的碎片離子，符合文獻(xiàn)[20]報(bào)道的沒食子酸的裂解峰，因此化合物可能是沒食子酸；化合物5的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z是317，故分子量是318。且有碎片離子m/z137.0，與文獻(xiàn)[21]報(bào)道的楊梅素一致，由此可以初步假設(shè)該化合物是楊梅素；化合物6的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z301，故分子量為302，符合槲皮素的分子量。且產(chǎn)生的二級(jí)質(zhì)譜圖中有m/z255.0，與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的槲皮素裂解特征一致，因此初步推斷該化合物為槲皮素；化合物7的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z是 163，說明該化合物的分子量為164，與4-香豆酸的分子量相同。MS2有m/z93碎片，與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的4-香豆酸一致。由此可初推測該化合物是4-香豆酸；化合物8的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z是283，故分子量為284，與大黃酸的分子量一致。且有碎片離子m/z為211.3，與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的大黃酸較一致。所以該化合物可能是大黃酸；化合物9的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z是137，故分子量為138，且有碎片離子92.2，符合文獻(xiàn)[25]報(bào)道的4-羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品的裂解峰。故可以推斷該化合物是4-羥基苯甲酸；化合物10的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z為165，故分子量為166。且有m/z121.0的碎片，與文獻(xiàn)[26]報(bào)道的鄰苯二甲酸一致，可推測該化合物為鄰苯二甲酸。具體見表1。

圖3 不同濃度板栗殼乙酸乙酯提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

Figure 3 Inhibitory activity ofα-glucosidase by ethyl acetate extracts of Chestnut shell at different concentrations

圖4 不同濃度板栗殼乙酸乙酯提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率

Figure 4 The inhibition rate ofα-glucosidase by ethyl acetate extracts of chestnut shell at different concentrations

圖5 板栗殼樣品UPLC圖Figure 5 UPLC chromatogram of chestnut shell

3 結(jié)論

本試驗(yàn)系統(tǒng)地研究了板栗殼中乙酸乙酯提取物的體外抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，結(jié)果表明板栗殼乙酸乙酯提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性和顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性。進(jìn)一步推測了這些活性成分主要為脂溶性黃酮類化合物，為板栗殼作為天然產(chǎn)物的開發(fā)與利用提供了理論和試驗(yàn)依據(jù)。板栗殼提取物具有較強(qiáng)的天然產(chǎn)物活性，有著廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。近年來，板栗殼中有效成分的提取工藝已成為研究熱點(diǎn)，但是對(duì)于板栗殼中成分的研究和純化以及體內(nèi)試驗(yàn)等還有待于進(jìn)一步研究，這也將成為相關(guān)研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

表1 板栗殼乙酸乙酯提取物中化合物結(jié)構(gòu)推斷Table 1 Constructions in Ethyl acetate extracts of chestnut shell

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Study on acivity and structure analysis of ectracts from Chinese chestnut shell by ethyl acetate

SHI Ling-lingWANGJian-zhongLIUYu-junMAChaoLIYi-jingDAIJian-rongCAOYangTENGWan-zhao

(CollegeofBiologicalScienceandBiotechnology,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China)

Investigated and analyzed the activity of ethyl acetate extract of chestnut shell and the components by UPLC—MS/MS. Antioxidant activities were carried out by DPPH radical scavenging assays and ABTS radical scavenging assays. The inhibitory activity of alpha glycosidase enzymes was measured by PNPG method. Qualitative analysis was performed by UPLC—MS/MS for analysis of major active components in ethyl acetate extracts. It determined that ethyl acetate extracts of Chestnut shell possessed remarkable DPPH radical scavenging activity, ABTS radical scavenging activity and high inhibitory activity of alpha glycosidase enzymes owing to the fat-soluble flavonoids are the main active components.

Chestnut shell； ethyl acetate extracts; antioxidant activity; alpha glycosidase enzymes inhibitory activity; UPLC—MS/MS

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(編號(hào)：201204401)

史玲玲，女，北京林業(yè)大學(xué)中級(jí)實(shí)驗(yàn)師，在讀博士研究生。

王建中(1951—)，男，北京林業(yè)大學(xué)教授，碩士。 E-mail：w62338221@163.com

2016—12—15

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.02.028