陳凱麗，易劍峰，翟文靜，孫 蘭，孫 文（宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000）

雷公藤甲素在正常大鼠和佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究

陳凱麗＊，易劍峰#，翟文靜，孫 蘭，孫 文（宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000）

目的：研究雷公藤多苷片中活性成分雷公藤甲素在正常大鼠和佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，為其臨床合理用藥提供參考。方法：將12只SD大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組，每組6只。模型組大鼠sc完全弗氏佐劑0.1 mL復(fù)制佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，正常組大鼠sc等體積生理鹽水。造模14 d后，兩組大鼠均ig雷公藤多苷片混懸液96 mg/kg，分別于給藥前及給藥后10、30、45、60、90、120、150、180、240、300、420 min眼眶取血0.4 mL，采用高效液相色譜法測(cè)定雷公藤甲素的血藥濃度；采用DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并進(jìn)行比較。結(jié)果：雷公藤甲素在正常組、模型組大鼠體內(nèi)的cmax分別為（1.139±0.114）、（0.916± 0.103）μg/mL，tmax分別為（2.167±0.606）、（3.083±0.801）h，t1/2α分別為（5.500±3.610）、（5.593±1.795）h，AUC0-7h分別為（5.052± 0.371）、（4.707±0.347）μg·h/mL，MRT0-7h分別為（3.224±0.119）、（3.429±0.139）h，CL分別為（11.616±2.986）、（11.246±2.638）mL/h。與正常組比較，模型組大鼠cmax顯著減小，tmax和MRT0-7h顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。結(jié)論：佐劑性關(guān)節(jié)炎會(huì)影響大鼠體內(nèi)雷公藤甲素的藥動(dòng)學(xué)特征，其可促進(jìn)大鼠體內(nèi)雷公藤甲素的吸收與消除。

雷公藤多苷片；佐劑性關(guān)節(jié)炎；雷公藤甲素；藥動(dòng)學(xué)；大鼠

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）屬于慢性全身性自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)周圍組織和滑膜非感染性炎癥病變，臨床治療多采用口服給藥。雷公藤多苷片（Tripterygium glycosides tablets，TGPT）為傳統(tǒng)中成藥，是從衛(wèi)矛科植物雷公藤的根芯部分提取并精制而成的混合物，雷公藤甲素（Triptolide）為其最主要的活性成分，其抗炎作用顯著，治療RA和其他自身免疫性疾病療效較好，是常用的免疫抑制劑。臨床研究表明，雷公藤甲素能明顯緩解關(guān)節(jié)疼痛，但同時(shí)具有多器官毒性、安全范圍較小的特點(diǎn)，使其臨床使用受到一定限制[1-2]。因此，在本研究中筆者擬探討雷公藤甲素在正常大鼠和佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，以為其治療RA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1315D二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Angilent公司）；5415R高速低溫離心機(jī)（德國(guó)EPPENDORF公司）；FC204電子天平（上海精科天平儀器廠）。

1.2 藥材、藥品與試劑

雷公藤多苷片（湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20150301，規(guī)格：0.1 mg/片）；雷公藤甲素對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：38748-32-2，純度：98%）；完全弗氏佐劑（美國(guó)Sigma公司）；乙腈、甲醇為色譜純，乙酸乙酯為分析純。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，12只、♂，體質(zhì)量（280±15）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：43004700021623，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004。實(shí)驗(yàn)遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)指導(dǎo)原則，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。

2 方法

2.1 色譜條件

[3-5]改進(jìn)色譜條件。色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈-水（30∶70，V/V）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取雷公藤甲素對(duì)照品5 mg，置于5 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的雷公藤甲素對(duì)照品溶液。依次稀釋為質(zhì)量濃度為800、100、50、10、1 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃冰箱保存，備用。

2.3 分組、造模、給藥與取血

12只SD大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組，每組6只。模型組大鼠于右后足趾部sc完全弗氏佐劑0.1 mL以復(fù)制佐劑性關(guān)節(jié)炎模型；正常組大鼠sc等體積生理鹽水。14 d后，兩組大鼠分別ig雷公藤多苷片混懸液96 mg/kg（溶劑為0.5%羧甲基纖維素鈉，給藥劑量根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）。分別于給藥前及給藥后10、30、45、60、90、120、150、180、240、300、420 min從眼眶取血0.4 mL，置于含肝素鈉的EP管中，離心（離心半徑為8 cm、3 500 r/min）15 min，－80℃冰箱冷凍保存，備用。

2.4 血漿樣品處理

吸取“2.3”項(xiàng)下血漿100 μL，置于EP管1中，加入乙酸乙酯300 μL，渦旋2 min，靜止1 min分層后離心（離心半徑為8 cm、8 000 r/min）10 min，取上清液于EP管2中；向EP管1中再加入乙酸乙酯300 μL，同上法取上清液，與EP管2中的上清液混勻；以55～60℃水浴蒸干，加入100 μL甲醇復(fù)溶，旋渦混勻，離心（離心半徑為8 cm、12 000 r/min）10 min后，吸取20 μL進(jìn)樣測(cè)定[6-7]。

2.5 雷公藤甲素血藥濃度測(cè)定的方法學(xué)考察

按照相關(guān)規(guī)定考察雷公藤甲素血藥濃度測(cè)定方法的專屬性、回歸方程與線性范圍、日內(nèi)和日間精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率和穩(wěn)定性。

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究

取“2.4”項(xiàng)下處理血漿后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，繪制藥-時(shí)曲線，并采用DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2.7 數(shù)據(jù)處理

采用DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)軟件對(duì)大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線進(jìn)行非房室模型擬合，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)兩組藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算。數(shù)據(jù)以±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1 專屬性考察 按相關(guān)要求進(jìn)行操作，結(jié)果雷公藤甲素在該色譜條件下分離度好、峰形良好、樣品峰附近無(wú)內(nèi)源雜峰干擾，表明本方法專屬性良好。

3.1.2 回歸方程、精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率與穩(wěn)定性考察 按相關(guān)要求進(jìn)行操作，以雷公藤甲素質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果雷公藤甲素的回歸方程為y＝77.723x－33.224（r＝0.998 2），檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.29～36.48 μg/mL；日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)的RSD均不大于4.53%（n＝5），準(zhǔn)確度在81.23%～93.46%之間（RSD均不大于5.0%，n＝5）；提取回收率在77.20%～88.16%之間（RSD均不大于2.04%，n＝3）；室溫放置4 h、－80℃凍存20 d、反復(fù)凍融3次后穩(wěn)定性的RSD≤4.95%（n＝5）?？疾旖Y(jié)果表明，精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率與穩(wěn)定性符合相關(guān)要求。

3.2 藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果

兩組大鼠ig雷公藤多苷片混懸液后藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖1。采用DAS 2.0軟件，按照非房室模型進(jìn)行處理，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 雷公藤甲素在正常大鼠和佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線Fig 1 Plasma concentration-time curves of triptolide in normal rats and adjuvant arthritis rats

由表1可知，與正常組比較，模型組大鼠體內(nèi)雷公藤甲素的cmax顯著減小，tmax、MRT0-7h顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。

4 討論

參考預(yù)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道[8]，TGPT主要成分雷公藤甲素在甲醇、乙腈等溶劑中較穩(wěn)定，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品提取方法進(jìn)行了考察，經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn)采用乙酸乙酯萃取結(jié)果較好。本研究建立的HPLC法專屬性較好、靈敏度較高，且方法簡(jiǎn)單可靠，可滿足雷公藤甲素血漿藥物濃度分析的需要。

大鼠右后足趾部sc完全弗氏佐劑0.1 mL可成功復(fù)制佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，與RA的臨床表現(xiàn)、病理生理以及免疫學(xué)變化等方面有相似特征[9-10]。此外，由于TGPT成分復(fù)雜，雷公藤甲素含量較低，在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)TGPT中所含雷公藤甲素吸收入血后含量較低，按照臨床常用劑量折算后給藥，其血藥濃度不在線性范圍內(nèi)，無(wú)法估計(jì)正常和病理狀態(tài)下的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。參考相關(guān)毒性研究文獻(xiàn)對(duì)給藥劑量進(jìn)行優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，選用稍高于臨床劑量連續(xù)給藥1個(gè)月后可進(jìn)行正常狀態(tài)和病理狀態(tài)下的藥動(dòng)學(xué)研究[11-12]，因此本實(shí)驗(yàn)選用稍高于臨床劑量（約9倍）換算后進(jìn)行研究。

采用DAS 2.0軟件擬合藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的結(jié)果顯示，模型組大鼠體內(nèi)雷公藤甲素cmax顯著低于正常組，tmax、MRT0-7h顯著高于正常組，這表明雷公藤甲素在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)的吸收速度減慢、血藥濃度顯著降低，與正常組大鼠藥動(dòng)學(xué)行為相比存在顯著差異。這可能是受到模型大鼠體內(nèi)的炎癥介質(zhì)、滑膜成纖維細(xì)胞的表達(dá)及T細(xì)胞和細(xì)胞因子分泌等的影響[13-15]，從而使藥物的藥動(dòng)學(xué)行為發(fā)生改變，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，佐劑性關(guān)節(jié)炎會(huì)影響大鼠體內(nèi)雷公藤甲素的藥動(dòng)學(xué)特征，其可促進(jìn)大鼠體內(nèi)雷公藤甲素的吸收與消除。但不同病理狀態(tài)對(duì)雷公藤甲素藥動(dòng)學(xué)的影響程度尚需進(jìn)一步研究確定。本研究結(jié)果可為TGPT在臨床上對(duì)不同機(jī)體狀態(tài)的患者制訂合理給藥方案提供參考，以進(jìn)一步提高其臨床用藥的療效和安全性。

表1 雷公藤甲素在正常和佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab 1 Main pharmacokinetic parameters of triptolide in normal and adjuvant arthritis rats in vivo（±s，n＝6）

表1 雷公藤甲素在正常和佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab 1 Main pharmacokinetic parameters of triptolide in normal and adjuvant arthritis rats in vivo（±s，n＝6）

注：與正常組比較，＊P＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)tmax，h cmax，μg/mL AUC0-7h，μg·h/mL AUC0-∞，μg·h/mL AUMC0-7hAUMC0-∞MRT0-7h，h MRT0-∞，h t1/2α，h CL，mL/h V，mL模型組3.083±0.801＊0.916±0.103＊4.707±0.347 8.954±2.174 16.169±1.733 84.059±42.437 3.429±0.139＊8.927±2.402 5.593±1.795 11.246±2.638 85.719±13.111正常組2.167±0.606 1.139±0.114 5.052±0.371 8.934±3.209 16.294±1.455 87.971±91.381 3.224±0.119 8.446±4.774 5.500±3.610 11.616±2.986 80.137±21.690

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（編輯：劉明偉）

Pharmacokinetic Study on the Triptolide in Normal Rats and Adjuvant Arthritis Model Rats in vivo

CHEN Kaili，YI Jianfeng，ZHAI Wenjing，SUN Lan，SUN Wen（School of Chemistry and Bioengineering，the College of Yichun，Jiangxi Yichun，336000 China）

OBJECTIVE：To study the pharmacokinetics of triptolide in Tripterygium glycosides tablet in normal rats and adjuvant arthritis model rats in vivo，and provide reference for clinical rational drug use.METHODS：12 SD rats were randomly divided into normal group and model group，6 in each group.Model group was subcutaneously injected complete Freund’s adjuvant 0.1 mL to induce adjuvant arthritis model，normal group was subcutaneously injected the same volume of saline.After 14 d modeling，2 groups were given Tripterygium glycosides tablet suspension 96 mg/kg intragastrically，the blood sample of eyes 0.4 mL were respectively taken before and 10，30，45，60，90，120，150，180，240，300，420 min after administration.The plasma concentration of triptolide was determined by HPLC，the pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software，and the parameters were compared.RESULTS：The pharmacokinetic parameters of triptolide in normal group were cmaxof（1.139±0.114）μg/mL，tmaxof（2.167±0.606）h，t1/2αof（5.500±3.610）h，AUC0-7hof（5.052±0.371）μg·h/mL，MRT0-7hof（3.224±0.119）h，and CL of（11.616±2.986）mL/h；and those in model group were cmaxof（0.916±0.103）μg/mL，tmaxof（3.083±0.801）h，t1/2αof（5.593±1.795）h，AUC0-7hof（4.707±0.347）μg·h/mL，MRT0-7hof（3.429±0.139）h，and CL of（11.246±2.638） mL/h. Compared with normal group，cmaxin model group was significantly decreased，tmaxand MRT0-7hwere significantly prolonged（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Adjuvant arthritis can affect the pharmacokinetics of triptolide in rats in vivo，and promote its absorption and removal.

Tripterygium glycosides tablet；Adjuvant arthritis；Triptolide；Pharmacokinetics；Rats

R969.1；R284.1

A

1001-0408（2017）07-0923-03

2016-08-07

2016-12-31）

＊碩士研究生。研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail：1043160721@qq. com

#通信作者：教授，博士。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0795-3200633。E-mail：rainbowyjf@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.17