楊 輝，周遠(yuǎn)大，何海霞，范 開(kāi)（.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 40006；.重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司，重慶 400054）

重組水蛭素腸溶膠囊單次和多次給藥在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究

楊 輝1＊，周遠(yuǎn)大1，何海霞1，范 開(kāi)2（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400016；2.重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司，重慶 400054）

目的：研究重組水蛭素腸溶膠囊單次和多次給藥在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征。方法：取12只Beagle犬按隨機(jī)對(duì)照法分為單次ig組和單次iv組，每組6只，按0.2 mg/kg ig或iv重組水蛭素，收集血樣；清洗2周后12只犬按0.2 mg/kg ig重組水蛭素，連續(xù)給藥7 d，收集血樣，作為多次ig組。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血漿中重組水蛭素濃度，以DAS 2.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：?jiǎn)未蝘g和單次iv重組水蛭素在Beagle犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征均符合二室模型，ig重組水蛭素腸溶膠囊的絕對(duì)生物利用度為（14.908±1.868）%；單次ig組和多次ig組犬體內(nèi)重組水蛭素的tpeak分別為（2.105±0.243）、（3.000±0.000）h，t1/2β分別為（8.660± 2.965）、（14.870±2.710）h，cmax分別為（10.700±0.872）、（12.05±1.587）ng/mL，AUC0-1440min分別為（55.250±4.386）、（58.978±6.002）ng·h/mL，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：ig重組水蛭素腸溶膠囊可一定程度被吸收入血；連續(xù)多天ig重組水蛭素腸溶膠囊在犬體內(nèi)不產(chǎn)生蓄積，不改變其藥動(dòng)學(xué)特征。

重組水蛭素；腸溶膠囊；注射液；單次給藥；多次給藥；藥動(dòng)學(xué)；Beagle犬

水蛭（Hinudo nipponica whitman）學(xué)名為日本醫(yī)蛭，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代本草對(duì)其均有記錄。藥用水蛭為水蛭的干燥全體，具有破血逐瘀的作用。天然的水蛭素（Hirudin）是由65～66個(gè)氨基酸組成的多肽，是迄今為止最強(qiáng)的凝血酶特異性抑制劑[1-2]。由于天然水蛭素的來(lái)源匱乏，提取步驟煩瑣，難以得到足夠量的純品以滿足臨床用藥的需求。20世紀(jì)80年代末，國(guó)外應(yīng)用基因工程技術(shù)，研制出與天然水蛭素結(jié)構(gòu)相似、作用相同的重組水蛭素（Recombinant hirudin，rH），并在臨床上得到廣泛應(yīng)用。重組水蛭素注射劑和脂質(zhì)體鼻腔給藥的藥動(dòng)學(xué)已有文獻(xiàn)報(bào)道[3-5]，但重組水蛭素口服制劑的藥動(dòng)學(xué)研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法，測(cè)定Beagle犬單次iv重組水蛭素注射液和單次ig、多次ig重組水蛭素腸溶膠囊后的血藥濃度，研究重組水蛭素腸溶膠囊在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，以期為水蛭素口服制劑的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

MR-250型酶標(biāo)儀（天津科器高新技術(shù)公司）；B160A型醫(yī)用低速離心機(jī)（河北省安新縣白洋離心機(jī)廠）；BP61型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 藥品

重組水蛭素腸溶膠囊[批號(hào)：030301，規(guī)格：含重組水蛭素0.25 mg/粒（抗凝血酶活力單位為3 000 ATU/粒）]和重組水蛭素注射液（批號(hào)：031101，規(guī)格：1.0 mg/mL）均由重慶富進(jìn)生物制藥公司提供。

1.3 動(dòng)物

健康合格一級(jí)Beagle犬24只，體質(zhì)量（7.0±0.8）kg，6月齡，♀♂各半，由四川養(yǎng)麝研究所提供，質(zhì)量合格證號(hào)和環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)分別為“川實(shí)動(dòng)管第63、64號(hào)”。

2 方法

2.1 給藥方案與血樣采集

2.1.1 單次給藥方案 參照文獻(xiàn)[6-8]，采用隨機(jī)對(duì)照設(shè)計(jì)，取12只Beagle犬，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按隨機(jī)數(shù)字表分為單次ig組和單次iv組，每組6只犬，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h后，根據(jù)人用劑量換算，于次日早晨8：00分別單次ig或單次iv 0.2 mg/kg重組水蛭素腸溶膠囊或注射液。單次iv組犬分別于給藥前和給藥后2、5、10、20、40、60、120、240、480 min經(jīng)前肢靜脈取血2 mL；單次ig組犬分別于給藥前和給藥后60、120、180、240、360、480、840、1 440 min經(jīng)前肢靜脈取血2 mL。血樣用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，分離血漿，－20℃保存，待測(cè)。

2.1.2 多次給藥方案 參照文獻(xiàn)[9-10]，單次給藥方案結(jié)束后，12只Beagle犬清洗2周后開(kāi)始多次ig重組水蛭素腸溶膠囊，給藥劑量為0.2 mg/kg，于每天早晨8：00時(shí)ig 1次，連續(xù)給藥7 d，記為多次ig組。于每次給藥前經(jīng)前肢靜脈取血2 mL用于測(cè)定谷濃度，分別于給藥前和給藥7 d后60、120、180、240、360、480、840、1 440 min經(jīng)前肢靜脈取血2 mL，同“2.1.1”項(xiàng)下方法處理后保存。

2.2 血藥濃度的測(cè)定

按照筆者前期研究方法——ELISA法[11]測(cè)定各組犬各時(shí)間點(diǎn)重組水蛭素的血藥濃度。

2.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用DAS 2.0軟件進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)房室模型擬合，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)以±s表示，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 單次給藥的藥-時(shí)曲線

單次iv、單次ig組犬給藥后體內(nèi)重組水蛭素的藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，單次ig組犬體內(nèi)重組水蛭素的tpeak為

圖1 單次給藥組犬體內(nèi)重組水蛭素的藥-時(shí)曲線Fig 1 Concentration-time curve in vivo of recombinant hirudin in dogs of single administration groups

（2.105±0.243）h；單次ig組和單次iv組犬體內(nèi)重組水蛭素的t1/2β分別為（8.660±2.965）、（2.642±0.920）h；AUC0-1440min分別為（55.250±4.386）、（372.980±27.872）ng·h/ mL。重組水蛭素腸溶膠囊的絕對(duì)生物利用度（F）為

（14.908±1.868）%，表明重組水蛭素腸溶膠囊可在一定程度被吸收入血。

3.2 多次給藥的藥-時(shí)曲線

3.2.1 第1～6天谷濃度 犬給藥第1～6天的重組水蛭素谷濃度均低于檢測(cè)下限（0.250 ng/mL），個(gè)別可測(cè)到濃度者也未表現(xiàn)出累積趨勢(shì)。

3.2.2 第7天血藥濃度 多次ig組犬體內(nèi)重組水蛭素的藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 多次ig組犬體內(nèi)重組水蛭素的藥-時(shí)曲線Fig 2 Concentration-time curve in vivo of recombinant hirudin in dogs of multiple ig group

3.3 藥動(dòng)學(xué)房室模型

3種給藥方式下，犬體內(nèi)重組水蛭素的藥動(dòng)學(xué)房室模型擬合結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，當(dāng)房室模型為二室模型，權(quán)重因子為1/C2時(shí)，其AIC最小，R2越接近1，表明Beagle犬體內(nèi)藥物濃度隨時(shí)間的變化符合二室模型，權(quán)重系數(shù)1/C2擬合較佳。

3.4 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

單次和多次ig組犬體內(nèi)重組水蛭素的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

表1 3種給藥方式下犬體內(nèi)重組水蛭素的藥動(dòng)學(xué)房室模型擬合結(jié)果Tab 1 Pharmacokinetic compartment model fitting results of dogs in vivo by 3 administration ways

表2 單次和多次ig組犬體內(nèi)重組水蛭素的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s）Tab 2 Pharmacokinetic parameters in vivo of recombinant hirudin in dogs of single and multiple ig groups（±s）

表2 單次和多次ig組犬體內(nèi)重組水蛭素的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s）Tab 2 Pharmacokinetic parameters in vivo of recombinant hirudin in dogs of single and multiple ig groups（±s）

參數(shù)t1/2α，h t1/2β，h K21，L/h K10，L/h K12，L/h AUC0-∞，ng·h/mL AUC0-1440min，ng·h/mL cmax，ng/mL tpeak，h CLs，L/（kg·h）單次ig組（n=6）1.399±0.146 8.660±2.965 0.249±0.189 0.217±0.046 0.128±0.070 59.489±5.780 55.250±4.386 10.700±0.872 2.105±0.243 4.042±0.533多次ig組（n=12）1.359±0.346 14.870±2.710 0.121±0.174 0.288±0.179 0.053±0.119 60.269±5.344 58.978±6.002 12.050±1.587 3.000±0.000 3.339±0.290

4 討論

本研究前期建立了ELISA法測(cè)定Beagle犬血漿中重組水蛭素的濃度，且經(jīng)驗(yàn)證，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾重組水蛭素的測(cè)定。該方法特異性高，回收率、精密度和定量下限以及樣品稀釋后再測(cè)定結(jié)果均符合新藥藥動(dòng)學(xué)的實(shí)驗(yàn)要求。

本實(shí)驗(yàn)比較了單次iv重組水蛭素注射液和單次ig重組水蛭素腸溶膠囊在犬體內(nèi)的藥物動(dòng)學(xué)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組水蛭素?zé)o論ig還是iv，在犬體內(nèi)均符合二室模型，單次ig的tpeak為（2.105±0.243）h，表明藥物吸收迅速。重組水蛭素腸溶膠囊的F為（14.908±1.868）%，表明重組水蛭素腸溶膠囊可一定程度被吸收入血。本實(shí)驗(yàn)還比較了單次ig和多次ig重組水蛭素腸溶膠囊在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單次ig和多次ig后犬體內(nèi)重組水蛭素的cmax差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；雖多次ig后的AUC0-1440min和AUC0-∞與單次ig相比略有提高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明重組水蛭素腸溶膠囊每天服藥1次，在體內(nèi)不產(chǎn)生蓄積，連續(xù)服藥也不會(huì)改變重組水蛭素腸溶膠囊的藥動(dòng)學(xué)特征。

本研究采用ELISA法測(cè)定了Beagle犬血漿中的重組水蛭素，首次報(bào)道了單次、多次口服重組水蛭素腸溶膠囊在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)情況，并計(jì)算獲得重組水蛭素腸溶膠囊的絕對(duì)生物利用度，為重組水蛭素的臨床研究提供了參考。

[1] Kaiser B，Callas D，Walenga JM，et al.Synthetic and recombinant antithrombin drugs[J].Expert Opin Investig Drugs，1998，doi：10.1517/13543784.7.6.963.

[2] MoW，Song HY.Research advance on clinical application of recombinant hirudin[J].Foreign Med Sci：Sect Pharm，2004，31（2）：82-86.

[3] Liu XW，Song HF，Tang ZM，et al.Pharmacokineties and partial thrombo plastin time after intravenous recombinant hirudin variant-2 in rhesus monkeys[J].Acta Pharmacol Sin，2002，23（9）：842-846.

[4] 黃玉榮，李全勝，劉昌孝.重組水蛭素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究[J].中草藥，2005，36（9）：1352-1356.

[5] 張玉杰，王筱亮，吳建梅，等.重組水蛭素-2脂質(zhì)體的制備及大鼠鼻腔給藥藥代動(dòng)力學(xué)[J].中國(guó)中藥雜志，2007，32（9）：801-804.

[6] 陳萬(wàn)一，周遠(yuǎn)大，康紀(jì)平，等.青藤堿在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和絕對(duì)生物利用度研究[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34（2）：468-471.

[7] 龔小紅，趙夢(mèng)杰，袁岸，等.尼奧寧在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及其生物利用度研究[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40（13）：2656-2660.

[8] 張建明，吳江，方曉玲.吡羅昔康環(huán)糊精包合物在Beagle犬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（12）：1240-1243.

[9] 況扶華，華潞，田蕾，等.托拉塞米片多次給藥藥動(dòng)學(xué)研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40（9）：693-695.

[10] 陳偉，孟令闊，樊冬嬌，等.鹽酸小檗堿單次和多次給藥在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（7）：512-516.

[11] 楊輝，周遠(yuǎn)大，何海霞.ELISA法研究重組水蛭素在比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，7（10）：941-945.

（編輯：鄒麗娟）

Study on the Pharmacokinetics of Recombinant Hirudin Enteric-coated Capsule by Single and Multiple Administration in Beagle Dogs

YANG Hui1，ZHOU Yuanda1，HE Haixia1，F(xiàn)AN Kai2（1.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Chongqing Fagen Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.，Chong-qing 400054，China）

OBJECTIVE：To study the pharmacokinetic characteristics of Recombinant hirudin enteric-coated capsule by single and multiple administration in Beagle dogs.METHODS：12 Beagle dogs were divided into single ig group and single iv group by random control method，6 in each group.Recombinant hirudin 0.2 mg/kg was intragastrically administrated or intravenously injected，blood sample was collected；after 2 weeks of cleaning，12 dogs were intragastrically administrated recombinant hirudin 0.2 mg/kg，for 7 d.Sample blood was collected，referred to multiple ig group.Recombinant hirudin concentration in plasma was determined by enzyme-linked immunosorbent assay，and pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software.RESULTS：The results showed that pharmacokinetics by ig and iv recombinant hirudin in Beagle dogs fitted to two-compartment model，absolute bioavailability of ig Recombinant hirudin enteric-coated capsule was（14.908±1.868）%；the pharmacokinetic parameters in single ig group and multiple ig group were tpeakof（2.105±0.243），（3.000±0.000）h，t1/2βof（8.660±2.965），（14.870±2.710）h，cmaxof（10.700±0.872），（12.05±1.587）ng/mL，AUC0-1440minof（55.250±4.386），（58.978±6.002）ng·h/mL，without statistical significances in two groups（P＞0.05）.CONCLUSIONS：The ig Recombinant hirudin enteric-coated capsule can be absorbed into the blood to a certain extent.There is no accumulation for ig Recombinant hirudin enteric-coated capsule for several days，and it dose not change the pharmacokinetic characteristics.

Recombinant hirudin；Enteric-coated capsule；Injection；Single administration；Multiple administration；Pharmacokinetics；Beagle dogs

R965

A

1001-0408（2017）07-0916-03

2016-11-03

2016-12-29）

＊主管藥師，博士。研究方向：新藥研發(fā)、醫(yī)院藥學(xué)。電話：023-89012224。E-mail：yanghui_023@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.15