馬晉，張蜀瀾，胡朝軍，柳樂，李慶春，李夢濤，曾小峰

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科 風濕免疫病學教育部重點實驗室， 北京 100730)

ChinJAllergyClinImmunol，2017，11(2)：112- 118

抗中性粒細胞胞漿抗體(anti-neutrophil cytoplas-mic autoantibodies, ANCA)是最早由Davies及其同事在研究節(jié)段性壞死性腎小球腎炎患者抗核抗體時所發(fā)現(xiàn)的一種自身抗體[1]。現(xiàn)有研究結(jié)果表明ANCA是包括壞死性肉芽腫性血管炎、顯微鏡下多脈管炎和Churg-Strauss綜合征等疾病在內(nèi)的系統(tǒng)性小血管炎(systemic small vasculitis, SSV)臨床診斷的重要血清學指標[2- 4]。大約85%～90%的壞死性肉芽腫性血管炎、顯微鏡下多脈管炎和Churg-Strauss綜合征等疾病患者的體內(nèi)都能夠檢測到ANCA。其中，抗蛋白酶3(proteinase 3, PR3)抗體和抗髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)抗體對SSV具有良好的診斷特異性，而且抗體的滴度與疾病的活動度具有相關(guān)性[5]。因此，在臨床實踐中作為重要的ANCA靶抗原確認實驗而廣泛開展。

目前臨床實驗室檢測抗MPO抗體和抗PR3抗體多采用基于20世紀70年代的傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技術(shù)[6- 8]。近年來，新的免疫學技術(shù)已經(jīng)逐步應用到臨床自身抗體檢測實踐中[9- 11]。具有全自動、定量、隨機上樣以及檢測線性范圍更寬等優(yōu)勢的全自動化學發(fā)光(chemiluminescent immunoassay, CLIA)檢測技術(shù)廣泛應用于臨床樣本檢測。本研究采用CLIA方法對臨床常規(guī)樣本開展抗MPO和抗PR3抗體檢測，探討其在抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測中的臨床應用價值。

對象與方法

對象

收集北京協(xié)和醫(yī)院門診和住院申請ANCA檢測項目的常規(guī)臨床樣本242例，其中住院患者29例，門診患者213例；男性97例，年齡7～87歲，平均(52.0±18.5)歲，女性145例，年齡10～87歲，平均(48.1±17.1)歲。所有入組樣本中，119例具有明確疾病診斷信息(表1)，其中包括47例SSV患者和72例非SSV患者(含29例風濕炎癥疾病和43例非自身免疫疾病)。待檢測患者清晨空腹靜脈采血，離心分離血清后，應用免疫熒光法(immunofluorescent assay，

表1　具有明確疾病診斷信息的入組樣本臨床特點Table 1　Demographic and clinical characteristics of subjects with disease diagnosis

SSV:系統(tǒng)性小血管炎; 風濕炎癥疾病組包括6例系統(tǒng)性紅斑狼瘡、9例結(jié)締組織病、12例類風濕關(guān)節(jié)炎及2例系統(tǒng)性硬化癥

IFA)開展ANCA篩查檢測的同時，平行采用CLIA和ELISA開展抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測。

試劑和儀器

CLIA自身抗體檢測系統(tǒng)，包括全自動化學發(fā)光分析儀(LumiRay 1260)及抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測試劑(蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司)。IFA檢測試劑盒：同時包被HEp- 2細胞、靈長類肝組織片、甲醛固定中性粒細胞和乙醇固定中性粒細胞等基質(zhì)的粒細胞馬賽克檢測試劑盒(德國歐蒙醫(yī)學診斷股份公司)。對比ELISA試劑盒：抗MPO抗體和抗PR3抗體ELISA檢測試劑盒(德國歐蒙醫(yī)學診斷股份公司)。第三方ELISA驗證試劑盒：由于抗MPO抗體和抗PR3抗體缺乏公認的標準參考方法，本研究針對CLIA與ELISA檢測結(jié)果不一致樣本選擇第三方驗證ELISA檢測試劑盒(德國AESKU Diagnostic公司)開展復測。SUNRISE酶標儀(瑞士TECAN公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus)。

方法

CLIA檢測抗MPO抗體和抗PR3抗體：檢測流程嚴格按照說明書開展檢測，所有檢測均在配套的全自動化學發(fā)光分析儀(LumiRay 1260)上全自動開展檢測?？筆R3抗體和抗MPO抗體的檢測臨界值均為20 RU/ml。

IFA開展ANCA篩查檢測：采用包括乙醇固定粒細胞、甲醛固定粒細胞、靈長類肝組織片和HEp- 2細胞抗原片等四個基質(zhì)組合檢測。血清1∶10稀釋后與抗原基質(zhì)片反應30 min(同時設(shè)立陽性和陰性對照)，在PBS緩沖液中浸泡5 min，加入熒光素標記的抗人IgG抗體避光溫育30 min，再次在PBS緩沖液中浸泡5 min，加甘油基質(zhì)封片并在熒光顯微鏡下觀察和判讀結(jié)果。以抗體滴度≥1∶10為陽性。

ELISA檢測抗MPO和PR3抗體：血清樣本1∶100稀釋，加入包被MPO和PR3抗原的微孔板中，室溫反應30 min，用清洗緩沖液清洗3次，每孔加入100 μl酶標記的抗人IgG抗體，室溫反應30 min，用清洗緩沖液清洗3次，每孔加入100 μl TMB底物液，室溫反應15 min，最后加入100 μl終止液，在酶標儀中按照450 nm和620 nm的雙波長進行光密度測量。根據(jù)光密度值計算抗體濃度并判讀陰陽性結(jié)果。其中對比ELISA試劑盒和第三方驗證ELISA試劑盒的檢測臨界值分別為20 RU/ml和18 U/ml。

統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。不同方法檢測結(jié)果差異的比較，采用四格表的χ2檢驗，兩種方法檢測結(jié)果一致性的分析采用Kappa檢驗，一致性強度的判斷：當Kappa<0.4，一致性強度較差；0.4≤Kappa<0.75，兩者一致性一般；Kappa≥0.75兩者一致性較好。同時以ELISA作為對比方法繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC曲線)，借助曲線以下面積(area under the curve, AUC)分析CLIA與ELISA比較的準確性，判斷標準：當0.50.9時，具有較高的準確性。當兩種方法學檢測結(jié)果一致性強度較差時，差異樣本經(jīng)第三方試劑復測的結(jié)果與CLIA和ELISA檢測結(jié)果分別采用單因素ANOVA分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

CLIA與ELISA檢測抗MPO抗體的符合率

應用CLIA和ELISA同時對入組樣本開展抗MPO抗體平行檢測，分別對兩種方法學檢測結(jié)果進行符合率分析。結(jié)果顯示，CLIA和ELISA在檢測抗MPO抗體時表現(xiàn)出良好的一致性，其中陽性符合率、陰性符合率及總符合率分別為81.9%、98.8%和93.8%(表2)。以ELISA作為對比方法繪制ROC曲線，結(jié)果顯示與ELISA比較，CLIA檢測抗MPO抗體時具有良好的準確性，AUC為0.966 (95%置信區(qū)間為0.946～0.986)(圖1)。兩種方法檢測結(jié)果差異樣本僅為15例，針對差異樣本采用第三方試劑開展復測的結(jié)果見表3。

表2　CLIA與ELISA檢測抗MPO抗體符合率分析Table 2　Qualitative agreement between CLIA and ELISA for the detection of anti-MPO

MPO：髓過氧化物酶；CLIA：化學發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法

圖1兩種方法檢測抗MPO和PR3抗體ROC曲線圖

Fig1Receiver operating characteristic (ROC) curves of anti-MPO and anti-PR3 for the comparison between CLIA and ELISA

MPO：髓過氧化物酶；PR3：蛋白酶3；ROC：受試者工作特征；AUC：曲線下面積

表3　CLIA與ELISA檢測抗MPO抗體差異樣本的第三方試劑復測結(jié)果Table 3　Retest of discrepant samples between CLIA and ELISA with the validation reagent for anti-MPO

MPO：髓過氧化物酶；CLIA：化學發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法

CLIA與ELISA檢測抗PR3抗體的符合率

應用CLIA和ELISA同時對入組樣本開展抗PR3抗體平行檢測，對兩種方法學檢測結(jié)果進行符合率分析。結(jié)果顯示，CLIA與ELISA在檢測抗PR3抗體時符合率和一致性較低，其中陽性符合率、陰性符合率和總符合率分別為35.1%、96.1%和86.8%(表4)。兩種方法檢測結(jié)果差異樣本合計為32例，針對差異樣本采用第三方試劑開展復測，結(jié)果顯示，CLIA結(jié)果與第三方試劑復測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而ELISA結(jié)果與第三方試劑復測結(jié)果差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.01)(表5)。以ELISA作為對照方法繪制ROC曲線，結(jié)果顯示與ELISA比較時，CLIA在檢測抗PR3抗體時具有一定的準確性， AUC為0.839 (95%置信區(qū)間為0.773～0.905)(圖1)。

CLIA和ELISA分別與IFA篩查ANCA檢測結(jié)果的符合率

臨床實踐中，首先以包括乙醇和甲醛固定的中性粒細胞為基質(zhì)的IFA開展ANCA初篩試驗，然后進一步采用免疫印跡法或ELISA方法開展抗PR3抗體和抗MPO抗體的確認試驗。本研究中242例樣本以抗

表4　CLIA與ELISA檢測抗PR3抗體符合率分析Table 4　Qualitative agreement between CLIA and ELISA for the detection of anti-PR3

PR3：蛋白酶3；CLIA：化學發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法

表5　CLIA與ELISA檢測抗PR3抗體差異樣本的第三方試劑復測結(jié)果分析Table 5　Analysis of discrepant samples between CLIA and ELISA retested with the validation reagent for anti-PR3　(n)

PR3：蛋白酶3；CLIA：化學發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法。CLIA與第三方驗證結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，ELISA與第三方驗證結(jié)果差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)

MPO和(或)抗PR3抗體陽性作陽性樣本，分別開展兩種方法與IFA檢測結(jié)果的符合率比較。結(jié)果顯示，CLIA與IFA的陰性符合率(94.8%)明顯優(yōu)于ELISA與IFA的陰性符合率(77.2%)(表6)。

CLIA和ELISA抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測性能對比分析

本研究中，共有119例入組樣本具有明確的疾病診斷，其中包括47例SSV以及72例非SSV。應用上述兩組樣本的檢測結(jié)果，分別比較CLIA和ELISA抗PR3抗體和抗MPO抗體的檢測性能。結(jié)果顯示在抗PR3抗體檢測時，CLIA敏感度(21.3%)略低于ELISA(29.8%)，但CLIA特異度(92.3%)優(yōu)于ELISA(87.5%)。而在檢測抗MPO抗體時，兩種方法學的敏感度基本相當，但CLIA特異度(68.1%)高于ELISA(58.3%)(表7)。

表6　CLIA及ELISA確認試驗與IFA篩查檢測結(jié)果符合率比較Table 6　The qualitative agreement between IFA screening test and confirmatory test with CLIA and ELISA

MPO：髓過氧化物酶；PR3：蛋白酶3；CLIA：化學發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法；IFA：免疫熒光法

表7　CLIA和ELISA抗MPO和PR3抗體檢測性能對比分析Table 7　The comparison of clinical performance between CLIA and ELISA for the detection of anti-MPO and anti-PR3

SSV：系統(tǒng)性小血管炎；MPO：髓過氧化物酶；PR3：蛋白酶3；CLIA：化學發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法

討　　論

ANCA是SSV臨床診斷的重要血清學指標。大約85%～90%的壞死性肉芽腫性血管炎、顯微鏡下多脈管炎和Churg-Strauss綜合征等疾病患者的體內(nèi)都能夠檢測到ANCA。應用IFA方法檢測ANCA時，在乙醇固定的中性粒細胞基質(zhì)中可以觀察到cANCA和pANCA等熒光表現(xiàn)。前者表現(xiàn)為細胞胞質(zhì)顆粒陽性且在核小葉部位明顯增強，而后者則表現(xiàn)為細胞核周邊連續(xù)線性的熒光。ANCA常規(guī)檢測中除了開展IFA篩查實驗之外，由于抗PR3抗體和抗MPO抗體對系統(tǒng)性血管炎具有良好的診斷特異性，而且抗體的滴度與疾病的活動度具有明確相關(guān)性[12]。因此，在臨床實踐中作為重要的ANCA靶抗原確認實驗而廣泛開展定量檢測。

自1990年，F(xiàn)alk和Jennette等發(fā)現(xiàn)PR3和MPO等靶抗原后，ELISA方法一直以來都被作為抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測的主要方法。ELISA作為20世紀70年代的傳統(tǒng)免疫學檢測技術(shù)，存在明顯的方法學局限性，包括特異性較低、檢測線性范圍有限和僅能實現(xiàn)半定量檢測等。近年來，新的免疫學技術(shù)已經(jīng)逐步應用到臨床自身抗體檢測實踐中。CLIA檢測技術(shù)作為目前臨床免疫檢測的主流技術(shù)，由于具有全自動、全定量、隨機上樣、靈活組合和質(zhì)控更嚴等顯著優(yōu)勢和特點，已經(jīng)在包括腫瘤標記物、傳染病、性激素和甲狀腺功能等免疫學檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要的臨床價值。

本研究采用CLIA檢測技術(shù)對臨床申請ANCA檢測的常規(guī)樣本開展抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測，同時將檢測結(jié)果與IFA及ELISA檢測結(jié)果進行對比分析。在所有入組242例樣本中，無論是CLIA還是ELISA與IFA方法學相比較，陽性符合率均低于75%(CLIA為60.7%，ELISA為73.6%)。IFA作為篩查實驗由于所包含的抗原譜更廣泛，因此與CLIA和ELISA等靶抗原確認實驗相比較具有更好的檢測敏感性。在臨床實踐中，針對ANCA相關(guān)抗體檢測時，IFA方法應始終作為首選篩查實驗開展。但基于IFA而檢測出的cANCA和pANCA，在臨床應用方面由于均不具備明確的疾病特異性，因此需要應用CLIA或ELISA等方法進行抗MPO抗體和抗PR3抗體的定量或半定量的確認，從而提高ANCA在臨床中的疾病特異性。與此同時，采用CLIA及ELISA等定量及半定量的檢測方法，還可以獲得抗體濃度的數(shù)值，為臨床針對系統(tǒng)性血管炎患者的疾病診斷、病情監(jiān)測、預后及復發(fā)判斷提供更加重要的實驗室依據(jù)。

應用CLIA與ELISA對抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測時，兩種方法在抗MPO抗體的檢測結(jié)果上均保持良好的一致性(陽性符合率81.9%，陰性符合率98.8%，總符合率93.8%)和相同的檢測敏感度(62.2%)。但在抗PR3抗體的檢測結(jié)果顯示兩種方法學的陽性符合率偏低(僅為35.1%)，而且CLIA的檢測敏感度(21.3%)略低于ELISA(29.8%)。上述差異可能是由于下列幾個原因?qū)е拢?1)不同反應體系和不同反應原理所引起的結(jié)果差異。與ELISA相比較，CLIA以納米級的磁微粒作為抗原和抗體反應的液相載體，因此具備更良好的反應效率、更完整的抗原抗體結(jié)合及更徹底的清洗步驟，從而確保整體反應體系的特異性。由于抗PR3抗體和抗MPO抗體的檢測為ANCA中最常見的靶抗原確認實驗，因此在方法學選擇上應該更加注重特異性的考量。(2)不同方法學中所使用的檢測抗原不同而導致結(jié)果差異。本研究中ELISA檢測法為了提高檢測的敏感度采用的是重組PR3及天然PR3抗原混合包被的方式。而CLIA所采用的抗原為天然的PR3抗原[13]?？乖g的差異可能是導致檢測結(jié)果之間差異的原因之一。從本研究的結(jié)果來看，盡管ELISA在檢測抗PR3抗體的敏感度略優(yōu)于CLIA，但特異性卻顯著下降。(3)在CLIA反應體系中，借助生物素和親和素作為載體實現(xiàn)PR3抗原在納米磁性微球的間接包被，因此能夠更好地確?？乖Y(jié)構(gòu)不會由于ELISA在微孔板中的直接包被而導致的抗原構(gòu)想改變。上述兩種方法學在檢測抗PR3抗體時的檢測差異樣本應用第三方驗證試劑進行驗證，結(jié)果表明第三方驗證試劑的檢測結(jié)果與CLIA檢測更加符合。

綜上所述，由于抗MPO抗體和抗PR3抗體缺乏公認的標準參考方法，因此不同檢測方法之間的結(jié)果可能存在差異?？紤]到抗MPO抗體和抗PR3抗體對于SSV患者疾病診斷、病情進展及預后判斷等具有至關(guān)重要的作用和價值，因此建議在實驗室針對上述兩種抗體的檢測方法學選擇之前，應同時結(jié)合IFA抗體篩查實驗結(jié)果、樣本的臨床診斷信息以及方法學的具體特點(包括自動化、線性范圍、隨機上樣等)因素進行嚴格的判斷和評價。

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